PLoS ONE: galectin-4 Reducerer Migration og metastase Dannelse af bugspytkirtelkræftceller

abstrakt

galectin-4 (Gal-4) er et medlem af galectin familien af ​​glycan bindende proteiner, der viser en signifikant højere ekspression i cystisk tumorer i human pancreas og i pancreas-adenocarcinomer sammenlignet med normale pancreas . Imidlertid er den formodede funktion af Gal-4 i tumorudvikling af pancreascancer stadig ufuldstændigt forstået. I denne undersøgelse rollen som Gal-4 i kræft progression blev undersøgt, ved hjælp af et sæt definerede bugspytkirtelkræft cellelinjer, Pa-Tu-8988S (PATU-S) og Pa-Tu-8988T (PATU-T), som model . Disse to cellelinjer afledt af den samme levermetastaser af en human primær pancreas adenocarcinom, men afviger i deres vækstkarakteristika og metastatisk kapacitet. Vi viste, at Gal-4-ekspression er høj i Patu-S, som viser dårlige vandrende egenskaber, hvorimod meget lavere Gal-4 niveauer observeres i det stærkt metastatisk cellelinie PATU-T. I PATU-S, er Gal-4 findes i cytoplasmaet, men det er også udskilles og akkumuleres på membranen på steder for kontakt med naboceller. Desuden viser vi, at Gal-4 hæmmer metastase dannelse ved at forsinke migrering af bugspytkirtelkræftceller

in vitro

hjælp af en ridse assay, og

in vivo

hjælp zebrafisk (

Danio rerio

) som en eksperimentel model. Vore data antyder, at Gal-4 kan virke på celleoverfladen af ​​PATU-S som et adhæsionsmolekyle at forhindre udslip af tumorcellerne, men har derudover en cytosolisk funktion ved at inhibere migrering via en endnu ukendt mekanisme.

Henvisning: Belo AI, van der Sar AM, Tefsen B, van Die i (2013) galectin-4 Reducerer Migration og metastaser Dannelse af bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (6): e65957. doi: 10,1371 /journal.pone.0065957

Redaktør: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: Februar 14, 2013; Accepteret: April 29, 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Belo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Fundação para en Ciência e Tecnologia (FCT), Lissabon, Portugal, gennem forskningsbevillinger SFRH /BD /44820/2008 tildelt AIB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de førende dødsårsager ved kræft i den vestlige verden. Klinisk effektive strategier for tidlig påvisning af sygdommen er stadig ikke tilgængelige. Forekomsten af ​​kræft i bugspytkirtlen og mortalitet hos patienter med denne form for kræft er næppe faldet i løbet af de sidste 50 år [1], [2], [3], [4]. Derfor yderligere forståelse i mekanismerne i debut, progression og metastase af kræft i bugspytkirtlen er berettiget.

Galectins er proteiner, der kan afvigende udtrykt i kræft og har været impliceret i kræft progression [5], [6]. De består af en familie af galactosid-bindende opløselige lektiner, der er blevet klassificeret i tre undergrupper baseret på deres struktur og antal domæner kulhydrat-genkendelse: prototype (galectins-1, -2, -5, -7, -10, -11 , -13, og -14), kimære type (galectin-3), og tandem repeat typen (galectins-4, -6, -8, -9 og -12) [revideret i [7]]. De fungerer i en lang række biologiske processer både intra- og ekstracellulært. Galectin-glycoprotein gitre spille vigtige roller i reguleringen af ​​cellernes funktion, ligesom celle-celle-adhæsion, celle-ekstracellulære matrix (ECM) interaktioner, cellevækst [8], organisering af membran domæner i lipid raft dannelse [9], [10] [11], leukocyt migration [gennemgået af [12]] og regulering af intracellulær signalering [13], [14], [15].

udtryk for galectins moduleres under udviklingen af ​​de enkelte celler og kan ændres under forskellige fysiologiske eller patologiske tilstande. Galectins ofte overudtrykt i cancerceller og cancerassocierede stromaceller, især i de celletyper, der normalt ikke udtrykker specifikke galectin [16]. I kræft progression, er galectins involveret i differentiering, adhæsion, migration, angiogenese, malign transformation, apoptose og kræft resistens [gennemgået i [5], [17], [18], [19], [20], [21] [22]]. Desuden er der flere rapporter, der har knyttet disse proteiner til invasion og metastase i flere typer af kræft [16], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

i denne undersøgelse har vi fokuseret på den rolle, galectin-4 (Gal-4) i metastaser af bugspytkirtelkræftceller. Metastasedannelse er en multi-trins proces, hvor de primære tumorceller invaderer omkringliggende væv, migrerer gennem vaskulaturen til endelig ekstravasere ind i perivaskulære væv og proliferere til sekundære tumorer. Gal-4 er et 323-aminosyre (36 kDa) protein, som hovedsageligt udtrykkes i den luminale epitel af mavetarmkanalen, fra tungen til tyktarmen. Gal-4 udtryk er ikke påvist i sunde bugspytkirtlen, men væsentligt forbedret i cystisk tumorer i de menneskelige bugspytkirtel og pancreas adenokarcinomer sammenlignet med normale vævsprøver, mens dens udtryk er lav i bugspytkirtlen neuroendokrine tumorer [26], [27], [29 ], [30], [31]. Funktionen af ​​Gal-4 i tumorudvikling og metastase i bugspytkirtelkræft, forbliver imidlertid uklar. I denne undersøgelse den formodede rolle Gal-4 i cancer progression blev undersøgt under anvendelse af et sæt af definerede pancreas cellelinier. Resultaterne viser, at Gal-4 er højere udtrykt i de mere differentierede pancreatiske tumorceller sammenlignet med pancreasceller demonstrerer metastatiske kapaciteter. Desuden Gal-4 påvirker metastase dannelse ved at forsinke migrationen og metastase af bugspytkirtelkræftceller

in vitro

i en ridse assay og

in vivo

i zebrafisk embryoner som en eksperimentel model.

Materialer og metoder

Etik Statement

Roy

– /-; Nacre

– /- casper

Danio rerio

(zebrafisk) blev håndteret i overensstemmelse med de lokale regler for dyrevelfærd og vedligeholdt i henhold til standard protokoller (zfin.org). Opdræt af voksne fisk blev godkendt af den lokale dyrevelfærd udvalg (Animal Experimental licens udvalg, DEC) i VU University Medical Center. Alle protokoller klæbet til de internationale retningslinjer angivet af EU Animal Protection direktiv 86/609 /EØF, som giver zebrafisk embryoner, der skal bruges op til tidspunktet for fritlevende (ca. 5-7 dage efter befrugtningen). Fordi embryoner, som anvendes i denne undersøgelse mødte disse kriterier, er ikke december licens kræves til denne undersøgelse.

Antistoffer, reagenser og buffere

ged anti-humant galectin-4 (BD Biosciences, Belgien) blev anvendes til påvisning af Gal-4 og muse-anti-tubulin (Cedarlane, Canada) blev anvendt som en endogen kontrol. Sekundære antistoffer (Abs), der anvendes var Odyssey IRDye 680 Donkey Anti-Goat (0,5 mg); IRDye 800CW gede-anti-kanin IgG (LI-COR Biosciences, USA); kanin-anti-ged Alexa Fluor 488; kanin-anti-ged Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, USA). TO-PRO®-3 Iodide med langt-rød fluorescens fra levende Technologies (Invitrogen, USA) blev anvendt som døde celle indikator

Rekombinant hGal-4 protein blev købt hos BD Biosciences.; LiCor blokerende buffer blev erhvervet fra LI-COR Biosciences, USA; lactose blev opnået fra Sigma (USA) og røde fluorescerende cellefarvning CM-Dil fra Vybrant, Invitrogen (USA). Kontrol siRNA (scramble A) og for GAL4 siRNA (10 uM) blev købt fra Santa Cruz Biotecknology (USA). Lyddæmper pre-designet siRNA mod Gal-4 (20 uM) og Ambion®

Silencer®

Negative Control # 1 siRNA (20 uM) blev købt fra Ambion (USA). Lipofectamin RNAiMax og Opti-MEM transfektionsreagenser blev opnået fra Invitrogen (USA).

Celler og dyrkningsbetingelser

Bugspytkirtelkræft cellelinjer Pa-Tu-8988S (PATU-S) og Pa-Tu -8988T (PATU-T) blev købt hos DSMZ (Tyskland). Andre pancreatiske cellelinjer var en venlig gave fra Prof. Dr. Richardson (Leiden University, Holland) [32]. Cellelinierne AsPC1, BxPC3, MiaPaCa og Panc01 blev dyrket i RPMI (GIBCO, Invitrogen), med 10% FCS (Lanza, Belgien) og 1:100 Pen /Strep (GIBCO, Invitrogen) ved 37 ° C + 5% CO

2. Cellelinierne Capan-I og Capan-II blev dyrket med 15% FCS. PATU-S, Patu-T og PaTu8902 blev dyrket i DMEM høj glucose (GIBCO, Invitrogen), med 10% FCS og 1:100 Pen /Strep ved 37 ° C + 5% CO

2.

cDNA Syntese og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra alle cellelinjer under anvendelse TriZol Reagent (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens retningslinier. mRNA blev efterfølgende transskriberes til cDNA under anvendelse af revers transkription System (Promega, USA), som tidligere [33] beskrevne. cDNA fra normal human pancreas kanalen epitel-lignende hTERT-HPNE cellelinje [34] var en slags gave fra Dr. E. Giovannetti (Dept. of Medical Oncology, VUmc Cancer Center Amsterdam, Holland). Realtid (RT) PCR-reaktioner blev udført med SYBR Green metode i et ABI 7900HT Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems, USA) som tidligere beskrevet [35]. Alle oligonukleotider blev designet ved hjælp Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, USA) computersoftware, og syntetiseres af Invitrogen Life Technology (USA). Reaktionerne blev udført som følger: 2 minutter ved 50 ° C, efterfulgt af 10 minutter ved 95 ° C og 40 cykler af 15 sekunder ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C. Data er udtrykt som relativ mRNA overflod indhentet fra CT-værdier fra målet versus endogene henvisning gen

GAPDH

.

Konstruktion af Patu-T-celler udtrykker Gal-4

til konstruktion PATU-T-celler, der udtrykker rekombinant Gal-4, det humane galectin-4 (hGal-4) genet blev klonet ved indsættelse cDNA af hGal-4-genet i vektoren pRRL-cPPT-CMV-X2-PRE-Singa- IRES-eGFP (en slags gave fra Dr. A. Horrevoets, VU Medical center, Amsterdam, Holland). Hele hGal-4 åben læseramme (ORF) blev opnået ved RT-PCR-amplifikation, indførelse Nsil /EcoRI restriktionssteder til indsættelse og en COSAC sekvens før ORF (Fwd: catatgcatcaccATGGCCTATGTCCCCGC; Rev: gaattcgatTTAGATCTGGACATAGGACAAGG). The hGal-4 insert blev klonet under anvendelse af EcoRI-stedet i vektoren, således at anbringe hGal-4-genet under en konstitutiv aktiv CMV-promotor. Den resulterende Lenti-viral konstruktion blev opformeret i

Escherichia coli

BL21 (DE3) og oprenset ved spin-kolonne plasmid isolation kit (Qiagen, Tyskland). Lenti-viral produktion og infektion af PATU-T-celler med den virale konstruktion, hvilket resulterer i cellelinjen PATU-T /Gal-4 blev udført som tidligere beskrevet [36]. En kontrol cellelinie (PATU-T /mock) blev konstrueret ved indføring af den tomme vektor.

Gal-4 Knock Down (KD) i Patu-S Cells

RNA-medieret interferens var anvendes til at reducere Gal-4 ekspression i Patu-S-celler. For optimal transfektionseffektivitet i Patu-S-celler, blev begge Gal-4 mål siRNA (40 nM slutkoncentration) fra Santa Cruz Biotechnology og lyddæmper Pre-designet siRNA (10 nM slutkoncentration) samtidig bruges til at hæmme Gal-4-ekspression (PaTu- S /Gal-4-KD). En negativ kontrol (scramble A sammen med negativ kontrol siRNA # 1) blev inkluderet i forsøgene (PATU-S /mock-KD). Transfektioner blev udført ifølge Invitrogen retningslinjer for revers transfektion i en 24-brøndsplade ved anvendelse af 1 ul Lipofectamine RNAiMax og 100 pi Opti-MEM-medium. For at reducere Gal-4 ekspression i Patu-S-celler, blev siRNA introduceret to gange med 4 dages interval og cellerne blev transplanteret ind i zebrafisk embryoner 24 timer efter den anden transfektion. Gal-4 mRNA niveauer blev målt ved flere tidspunkter i løbet af denne eksperimenter med kvantitativ RT-PCR.

Western-Blotting

Celler blev lyseret ved 0 ° C i TEA lysepuffer (Triton X- 100, NaCl, MgCl, CaCI

2, TEA pH8.2) indeholdende proteaseinhibitorer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved A280 målinger og BCA bestemmelse ved hjælp af Protein Assay Kit for Pierce (USA). Proteinerne ifølge cellelysaterne (75 ug) og dyrkningsmedium (25 pi) blev separeret ved SDS-PAGE på en 12,5% polyacrylamidgel i en diskontinuert puffersystem og proteinerne overført til nitrocellulosemembraner (Whatman Protran, Sigma). Efter natten over blokering i 01:01 LiCor blokeringsbuffer i PBST /1% BSA (PBS med 0,05% Tween 20, 1% BSA), blottene blev inkuberet i 60 minutter ved stuetemperatur med gede-anti-hGal-4 (0,1 ug /ml ). Muse-anti-tubulin (1:2000 fortynding) blev anvendt som ladningskontrol (cellelysater) og cellerester detektion (dyrkningsmedium). Sekundær ABs IRDye 680 anti-ged og IRDye 800CW anti-kanin IgG blev anvendt ved 1:15000 fortyndinger (0,07 ug /ml), i PBST /1% BSA i 1 time ved stuetemperatur (RT) i mørke. Western-blotting-analyse blev udført under anvendelse LI-COR Odyssey systemer scanner og software.

celleproliferationsassay

Celler blev podet i en 96-brøndsplade til ca. 1 x 10

4 og 1 × 10

5 celler per brønd og inkuberet natten over for celleadhæsion til pladen. [

3H] thymidin (1 uCi /brønd; Amersham Biosciences, USA) blev tilsat og cellerne inkuberet i yderligere 24 timer ved 37 ° C + 5% CO

2. Celler blev høstet og [

3H] thymidin inkorporering blev vurderet ved anvendelse en væskescintillationstæller MicroBeta

2 Plate Counter 2450 (Perkin Elmer, USA).

immunfluorescensmikroskopi

PATU-S , PATU-T /mock og PATU-T /Gal-4 celler dyrket på dækglas i 24 timer blev vasket 3 gange med PBS, fikseret i 30 minutter i 4% paraformaldehyd og permeabiliseret i 0,1% Triton- X-100 /PBS for 5 min. Uspecifik binding blev blokeret ved bratkøling 10 min med PBS /glycin (0,15M) efterfulgt af 30 min med PBS /gelatine 0,2% /BSA 0,5% (PBSG). Cellerne blev inkuberet med polyklonalt gede-anti-hGal-4 i PBSG (fortynding 0,2 ug /ml) i 1 time og efterfølgende vasket med PBS. Detektion blev udført efter 1 times inkubering ved stuetemperatur med 5 pg /ml af den sekundære Ab’er (anti-ged Alexa Fluor 488 eller anti-ged Alexa Fluor 647). Kerner blev farvet med Hoechst (1 ug /ml i PBS) under inkubationen trin med sekundær Ab. Actin blev påvist ved phalloidin-farvning (1:5000 i PBS, 15 min). Efter en sidste vask skridt i PBS og indlejring hjælp Mowiol (Kuraray Poval, Tyskland) flere celler i hver betingelse blev visualiseret ved hjælp af en Leica M6000 B mikroskop med objektivlinsen HCX PL APO 40,0 × 0,85 DRY. Billeder blev taget med et DFC350FXR2-095903305 Kamera og analyseres ved hjælp LASAF software (Leica Microsystems, Tyskland).

flowcytometri

Til påvisning af endogen Gal-4, cellerne blev først fikseret i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af celle permeabilisering i PBA /0,5% saponin i 15 min ved 4 ° C. For at detektere bindingen af ​​rekombinant human Gal-4 (rec hGal-4) til celleoverfladen blev procedurerne udført ifølge Patnaik,

et al

[37]. Kort sagt blev celler høstet, centrifugeret og resuspenderet i kold Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, Sigma, USA) med 500 mM lactose. Celler blev efterfølgende opsamlet og inkuberet i kold HBSS med 2% BSA i 1 time ved 4 ° C under forsigtig omrøring. Herefter blev cellerne vasket en gang med HBSS /BSA med 2 mM β-mercaptoethanol (Gibco, Invitrogen), og efterfølgende inkuberet i en time ved 4 ° C i HBSS /BSA /1 mM β-mercaptoethanol i fravær eller nærvær af rec hGal-4 (5 ug /ml) for at detektere endogen overfladebundet Gal-4 eller overflade- bundet rec hGal-4. At vurdere, om Gal-4-binding er carbonhydrat afhængig blev bindingsassays udføres i nærvær af 500 mM lactose. For både overfladen og cytosoliske analyse blev celler farvet med anti-Gal-4 Ab (2 ug /ml) i PBS med 0,5% BSA og 0,02% azid (PBA) indeholdende 10% FCS (Sigma, USA), i 30 min ved 4 ° C. For sekundær farvning, Alexa488 eller Alexa647 mærkede Abs blev anvendt (5 ug /ml og inkubation i 30 minutter ved 4 ° C). Dead celle indikator TO-PRO®-3 iodid (1 nM) blev tilsat lige tidligere at flyde cytrometry målinger. Flowcytometri blev udført under anvendelse af en FACScan eller et FACSCalibur flowcytometer og Summit software. Døde celler defineret som høj TO-PRO®-3 farvning blev udelukket fra analysen.

In vitro

Migration Assay ( “scratch” -assay)

scratch-assay blev udført som tidligere beskrevet af Liang et al. [38]. Cellerne blev dyrket til konfluens i en 24-brøndplade. Cellemonolaget blev skrabet i en lige linje med en 200-ul pipettespids (Sarstedt, Tyskland). Fotografier af bunden blev taget under en invert Leica DMI mikroskop ved 0 timer, 12 timer, 24 timer og 48 timer for PATU-T /Gal-4 og PATU-T /mock celler. Fotografier på hvert tidspunkt blev taget med Leica DFC420 kamera. Spaltebredde ved 0 timer var sat til 100%. Spaltebredden analyse blev udført med PhotoshopCS4 hjælp af analytisk lineal værktøj. Målinger blev taget på flere definerede steder ( 5) langs bunden. Hver scratch fik et gennemsnit af alle målinger. Data er udtrykt som den gennemsnitlige ± SEM af tre uafhængige forsøg

In vivo

Metastase Assay

Roy

– /-;. Nacre

– /- casper Danio rerio

(zebrafisk) blev håndteret i overensstemmelse med lokale dyr pleje regler og standard protokoller i Nederlandene. Fisk blev holdt ved 28 ° C i akvarier med dag /nat lys cyklusser (10 h mørke versus 14 timer lys perioder). Udviklingslandene embryoner blev holdt i æg vand (60 ug /ml øjeblikkelig ocean se salte) ved 28 ° C før transplantation og ved 35 ° C efter transplantation.

Cancer celletransplantation blev udført ifølge Marques

et al

[39]. Dybest set blev celler dyrket til konfluens, trypsineret (GIBCO, Invitrogen) og centrifugeret 5 min ved 1500 rpm. Celler blev derefter farvet i PBS indeholdende CM-Dil i en slutkoncentration på 4 ng /pl, i 4 minutter ved 37 ° C og 15 minutter ved 4 ° C. Efterfølgende blev cellerne høstet, og cellepellets resuspenderes i 100% FCS i 5 min nyttiggørelse og vasket to gange med PBS. Endelig blev cellerne resuspenderet i PBS til transplantation til zebrafisk embryoner 2 dage efter befrugtning (dpf). Embryoner blev dechorionated og bedøvet med tricaine (MS-222, Sigma-Aldrich, USA). Ved hjælp af en manuel injektor (Eppendorf, Tyskland; Injectman Ni2), blev cellesuspensionen fyldt i en injektion kapillær (15 um internal- og 18 um udvendig diameter). Derefter blev ca. 100 røde fluorescerende celler injiceret i blommesækken af ​​de dechorionated embryoer. Efter injektion blev embryoer lov til at komme sig efter transplantation i 1 time ved stuetemperatur. Efter denne periode (2 timer efter transplantation (HPT)), blev embryoer undersøges for tilstedeværelsen af ​​fluorescerende celler. Embryoner indeholdende fluorescerende celler uden for transplantation område ved 2 HPT blev anset for at være utæt og udelukket fra yderligere analyse. Antallet af embryoner i live på dette tidspunkt blev fastsat som 100% for hver betingelse uafhængigt af hinanden. Alle andre embryoner blev inkuberet ved 35 ° C i de 3 følgende dage.

Imaging, Valg og positionering af transplanterede zebrafisk embryoner

På 1, 2 og 3 dage efter transplantation (dpt), den embryoer blev bedøvet med tricaine og placeret lateralt på 3% methylcellulose. Embryoner blev screenet under en stereo DSR fluorescens Leica MZ16FA mikroskop. Fluorescerende cancerceller uden for området for implantation blev talt i hvert embryon. Embryoner, der præsenteres mere end 5 cancerceller uden blommen blev betragtet som værende positive for metastase og blev sat til side adskilt fra resten af ​​de transplanterede embryoner. Procentdel af metastase blev sat som antallet af embryoner, der indeholder mere end 5 celler uden blommen per dag i forhold til dag nul. Samlet metastaser procent er indstillet som det samlede antal embryoner med metastaser efter 3 dage i forhold til dag nul.

Statistik

Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse anvendt til kvantitativ RT-PCR-data var envejs ANOVA under anvendelse af Dunnett t-tests. For alle andre data, statistisk analyse anvendte var envejs ANOVA s Tukey t-test.

In vivo

metastase assays blev statistisk analyseret ved anvendelse parrede prøve t-tests. Data blev betragtet som signifikante, hvis

s

≤0.05.

Resultater

mRNA ekspression af Gal-4 i Pancreas adenocarcinom cellelinier

For at undersøge forskellen udtryk for Gal-4 blev mRNA-niveauer bestemt i ni forskellige humane bugspytkirtelkræft cellelinjer bruger Real Time (RT) PCR (figur 1). Som en kontrol for ekspression i normale pancreas kanalen væv blev Gal-4 mRNA-niveauer bestemt i en udødeliggjort cellelinie afledt fra normal human epitel pancreas kanalen (hTERT-HPNE). Resultaterne viste, at Gal-4 mRNA-niveauer i normale pancreas kanalen cellelinje ikke kunne påvises. Gal-4 mRNA-niveauer viste en relativ lav tæthed i otte af de ni kræftceller, ved hjælp af

GAPDH

som en husstand henvisning gen. Én cellelinie, Pa-Tu-8988S (PATU-S), viste imidlertid en mere end 10 gange forhøjet ekspression sammenlignet med de andre cellelinier.

Gal-4 mRNA-ekspression af normalt humant pancreas kanalen epithelial- lignende cellelinie (hTERT-HPNE) og 9 forskellige humane pancreas cancer cellelinjer blev analyseret ved kvantitativ realtids-PCR og afbildet som den relative mængde af Gal-4-transkripter (± SEM) i forhold til ekspressionen af ​​det endogene henvisning genet

GAPDH

. (*** P≤0.001 versus alle andre cellelinjer, ved hjælp af en envejs ANOVA med post Dunnett dobbeltklæbende t-tests).

Interessant Patu-S stammede fra den samme levermetastaser af en human primær pancreasadenocarcinom som en af ​​de lave Gal-4 udtrykkende cellelinjer, Pa-Tu-8988T (PATU-T) [40]. Disse to cellelinjer beskrives at indeholde modstående vandrende og metastatiske kapacitet. PATU-S og PATU-T viser en meget lav og en høj metastatisk kapacitet henholdsvis både

in vitro

in vivo

bruge zebrafisk som model-system [39]. Endvidere er det tidligere blevet vist, at de fleste af cellelinierne afbildet i figur 1, har en forøget

in vitro

migration kapacitet sammenlignet med Patu-S [32], [41]. Disse data førte os til at overveje muligheden for, at ekspressionen af ​​Gal-4 kan begrænse indvandring og /eller metastatisk kapacitet af disse bugspytkirtelkræftceller. På grund af deres fælles oprindelse, den lave vandrende PATU-S-cellelinjen og den metastatiske PATU-T-cellelinie repræsenterer et meget attraktivt modelsystem til at studere den formodede rolle Gal-4 i metastase.

Lokalisering af Gal- 4 i Patu-s og PATU-T-celler

udtrykket og lokalisering af Gal-4 protein i Patu-s og PATU-T-celler blev bestemt ved anvendelse af flowcytometri, Immuncytokemi (ICC) og western blotting (WB) (figur 2-4). For at bestemme endogene Gal-4 i PATU-S og PATU-T-celler, blev cellerne fikseret og permeabiliseret, efterfulgt af flowcytometri ved anvendelse af anti-Gal-4-antistoffer (ABS), og fluorescerende sekundære Abs. Resultaterne viser en klar forskel i Gal-4 Ab binding mellem PATU-S og PATU-T. PATU-S-celler udviser en stærk farvning af anti-Gal-4 Abs, hvorimod Gal-4-farvning i Patu-T-celler er næppe påviselig (figur 2A). At vurdere tilstedeværelsen af ​​glycan ligander ved den ydre celle-overflade, der kan genkendes af Gal-4 blev celler først strengt vasket med 500 mM lactose at fjerne endogent overfladebundne galectins. Efterfølgende exogent rec. hGal-4-protein (5 ug /ml) blev tilsat til cellerne, og Gal-4-binding blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af anti-Gal-4 Abs. Resultaterne viser, at der stadig en betydelig grad af Gal-4-farvning blev observeret på overfladen af ​​Patu-S-celler, men ikke PATU-T-celler, efter vask med lactose (figur 2B), hvilket indikerer tilstedeværelsen af ​​stærkt bundet endogent Gal-4 på overfladen af ​​Patu-S-celler. Efter tilsætning af rec hGal-4 til cellerne, celleoverfladen Gal-4-farvning stærkt forøget, hvilket indikerer, at Patu-S-celler kan binde høje niveauer af Gal-4 til deres overflade. Derimod meget lavere rec hGal-4 bundet til celleoverfladen af ​​PATU-T-celler. For at undersøge om rec hGal-4 binder til cellerne i en kulhydrat-afhængig måde, blev Patu-T og PATU-S-celler inkuberet med rec hGal-4 i nærvær af lactose. I nærvær af 500 mM lactose bindingen af ​​hGal-4 til begge cellelinier blev inhiberet, hvilket indikerer, at Gal-4-binding til celleoverfladen er glycan-afhængig. Kollektivt viser disse resultater, at høje Gal-4 niveauer er til stede i Patu-S-celler, hvorimod Gal-4 er næppe påviselig i Patu-T-celler. Desuden kan PATU-S-celler binder meget højere niveauer af Gal-4 til deres ydre overflade end PATU-T-celler, hvilket viser, at de udtrykker mere Gal-4-bindende carbohydratligander.

Påvisning af endogent Gal- 4, og Gal-4-ligander, i Patu-S og PATU-T-celler ved flowcytometri. Et histogram af et repræsentativt forsøg er afbildet for hver betingelse af mindst to uafhængige forsøg. A) Dot plots af Gal-4 farvning af permeabiliserede PATU-S og PATU-T-celler. Gal-4 blev påvist ved 4 ° C med anti-hGal-4 Abs i faste permeabiliserede celler. Sekundær Abs farvning uden anti-hGal-4 Abs blev anvendt som baggrund autofluorescens kontrol. B) Tilstedeværelse af endogen bundet Gal-4 til overfladen af ​​Patu-S og PATU-T efter vask af cellerne med 500 mM lactose før Gal-4-farvning. Tilstedeværelsen af ​​Gal-4 blev etableret ved FACS analyse under anvendelse af anti-hGal-4 Abs ved 4 ° C. Endogen Gal-4 bundet til overfladen er vist med en sort streg. C) tilstedeværelsen af ​​Gal-4 bindingssteder på PATU-S og PATU-T-celler blev bestemt efter vask af cellerne med 500 mM lactose før Gal-4-farvning. Bindingen af ​​eksternt tilsat rekombinant (rec) hGal-4 (5 ug /ml, sort linje) blev undersøgt. Binding af rec hGal-4 til overfladen kunne inhiberes ved tilsætning af lactose (mørk felt). Baggrund farvning med sekundær Abs er afbildet som lysegrå felter i B og C.

Fotografier af repræsentative ICC analyse af den cellulære lokalisering af Gal-4 i PATU-S-celler. Gal-4 blev påvist under anvendelse Alexa-mærket anti-Gal-4 Abs (grøn), Actin blev farvet ved anvendelse Phalloidin (rød) og nucleus farvning opnået ved anvendelse HOESCHS (blå); den tredje panel viser sammensmeltningen af ​​de forskellige farvninger. Bar = 25 um.

A) Proteiner fra helcelleekstrakterne (75 ug totalt protein) og dyrkningsmedium (4 dage kultur, 25 ul) af Patu-S (PS), Patu-T (PT), PATU-T /Gal-4 (PT /Gal-4) og PATU-T /mock (PT /M) blev separeret ved SDS-PAGE. Efter overførsel af proteinerne til en nitrocellulosemembran, blev blots farvet under anvendelse af gede-anti-hGal-4 til påvisning af Gal-4, og muse-anti-tubulin som kontrol for tilstedeværelsen af ​​intracellulært protein. B) Fotografier af repræsentative ICC analyse af den cellulære lokalisering af Gal-4 i PATU-T /Gal-4 og PATU-T /mock celler. Gal-4 blev påvist under anvendelse Alexa-mærket anti-Gal-4 Abs (grøn), Actin blev farvet ved anvendelse Phalloidin (rød) og nucleus farvning opnået ved anvendelse HOESCHS (blå); den tredje panel viser sammensmeltningen af ​​de forskellige farvninger. Bar = 25 um.

Den cellulære lokalisering af Gal-4 blev yderligere undersøgt ved hjælp ICC. Resultaterne viser høj fluorescens intensitet hele cytoplasmaet af Patu-S-celler (figur 3), hvilket indikerer, at de fleste Gal-4 er lokaliseret i cytosolen. Høj fluorescens blev observeret ved den cytoplasmatiske membran i individuelle celler og mellem celler, især ved kontaktsteder mellem tilstødende celler (celle-celle-kontakter), hvorimod næsten ingen fluorescens blev detekteret i kernen. Gal-4 er ikke homogent fordelt i cytoplasmaet, som viser nogle områder med højere fluorescens niveauer end andre, selv om der ikke er tydelige tegn på specifikke organeller involveret i ophobning af Gal-4. I PATU-T-celler, kunne der ikke Gal-4 detekteres med denne metode, oprettelse af flowcytometri data indikerer, at Gal-4 niveauer i Patu-T-celler er meget lave.

Overekspression af Gal-4 i Patu -T celler

for at vurdere en formodet involvering af Gal-4 i migration, Gal-4 blev overudtrykt i Patu-T-celler ved indføring af en viral vektor indeholdende hGal-4-gen drevet af en CMV-promotor (Patu -T /Gal-4). Som en kontrol blev den virale vektor uden insert transduceret til PATU-T (PATU-T /mock). Proteinekspression og lokalisering af Gal-4 i ubehandlede patu-T og PATU-S-celler, PATU-T /Gal-4 og PATU-T /mock blev analyseret ved Western blot (WB), ICC og flowcytometri.

for at bestemme niveauet af Gal-4 ekspression i cellelinierne, celler og medium blev høstet efter 4 dages dyrkning. Proteiner til stede i celleekstrakterne og mellemstore blev separeret ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Efter farvning blottene ved anvendelse af gede-anti-Gal-4 Abs, bånd ved 36 kDa svarende til den tilsyneladende masse af Gal-4 blev observeret i Patu-T /Gal-4 celleekstrakt og medium, i tilsvarende mængder som observeret i PATU-S celleekstrakt og medium (figur 4A). Som forventet har PATU-T /mock ikke vise påviselige bånd på 36 kDa. Disse resultater viser, at Gal-4 udtrykkes i Patu-T /Gal-4 på samme niveau i forhold til PATU-S-celler. Desuden er tilsvarende mængder af Gal-4 udskilt af PATU-S og PATU-T /Gal-4-celler.

Brug ICC, vi påvist, at den intracellulære fordeling af Gal-4 inden for PaTuT /Gal-4 celler ligner fordelingen i Patu-S-celler, hvorimod der ikke Gal-4 blev detekteret i PaTuT /mock celler (figur 4B). Fordelingen af ​​Gal-4 i disse celler i cytosolen ligner fordelingen i Patu-S-celler. Gal-4 er til stede i hele celler, bortset fra kernen, ens som observeret for PATU-S. Men mens Gal-4 er til stede ved plasmamembran PATU-S-celler, næppe Gal-4 detekteres ved membranen af ​​permeabiliseret PATU-T /Gal-4-celler. Afslutningsvis disse resultater viser, at PATU-T /Gal-4 udtrykker og udskiller Gal-4 i lignende beløb som PATU-S-celler.

Derudover har vi fastslået, om endogene, og /eller tilsættes rekombinant Gal- 4 blev bundet til celleoverfladen af ​​PATU-T /Gal-4 ved flowcytometri under anvendelse anti-Gal-4 Abs. Binding af anti-Gal-4 Abs til celleoverfladen var ikke forskellig PATU-T /Gal-4 og PATU-T /Mock (data ikke vist). Derfor kapaciteten af ​​Patu-T /Gal-4 celler binder Gal-4 ekstracellulært er uændret i forhold til den ubehandlede PATU-T-celle linie.

Overekspression af Gal-4 Formindsker Migration Kapacitet Patu-T celler

for at undersøge, om Gal-4 påvirkninger den vandrende adfærd PATU-T-celler, blev en ridse assay udføres ved hjælp PATU-T og PATU-T /Gal-4-celler (figur 5A-B).

En bunden (sårheling) assay blev udført med PATU-T, PATU-T /Gal-4 og PATU-T /mock celler. PATU-T /mock og PATU-T /Gal-4-celler blev podet på en plade med 24 og ridset på overfladen med en 200-pi pipettespids. Relative værdier blev sat til 100% af mellemrummets bredde på tidspunktet for bunden.