PLoS ONE: Identifikation af chemokin CX3CL1 som en ny regulator af malignt Cell Proliferation i Epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Baggrund

vides kun lidt om de molekyler, der bidrager til væksten i epitelial ovariecarcinomer (EOC), som fortsat den mest dødbringende gynækologisk kræft hos kvinder. Den chemokin fractalkin /CX

3CL1 er blevet bredt rapporteret at spille en biologisk relevant rolle i tumor vækst og spredning. Vi rapporterer her den første undersøgelse af udtrykket og rolle CX

3CL1 i EOC.

Resultater

Epitelceller fra overfladen af ​​æggestokkene og æggelederne og fra godartede, borderline og maligne tumorer alle farves positive for CX

3CL1. I tumor prøver fra 54 kvinder, der gennemgik kirurgisk behandling for EOC diagnose, blev CX

3CL1 immunoreaktivitet ujævnt fordelt i epitel tumorceller, og varierede fra stærk (33%) til fraværende (17%). Denne ulige fordeling af CX

3CL1 ikke afspejlede den morfologiske heterogenitet EOC. Det var positivt korreleret med spredning indeks Ki-67 og med GILZ (glukokortikoid-induceret leucin zipper), der tidligere er identificeret som en aktivator af spredning af maligne EOC celler. Hierarkisk klyngedannelse analyse, herunder alder ved diagnose, tumor kvalitet, FIGO stadie, Ki-67-indekset, CX

3CL1, SDF-1 /CXCL12 og GILZ immunfarvning scoringer, fornemme to store klynger, der svarer til lave og høje niveauer af spredning og forskellige i form af GILZ og CX

3CL1 udtryk.

GILZ

overekspression i carcinom-afledte BG1 cellelinie resulterede i parallelle ændringer i CX

3CL1 produkter. Omvendt CX

3CL1 fremmes gennem dets binding til CX

3CR1 AKT aktivering og proliferation i BG1 celler. I en mus subkutant xenograftmodel, overekspression af

GILZ

var forbundet med højere udtryk for CX

3CL1 og hurtigere tumorvækst.

Konklusion

Vores resultater fremhæve tidligere unappreciated konstitutiv ekspression af CX

3CL1 foregående tumorigenese i ovarieepitelceller. Sammen med GILZ, dette chemokin fremstår som en regulator af celleproliferation, som kan være af potentiel klinisk relevans for udvælgelsen af ​​den mest hensigtsmæssige behandling for EOC patienter

Henvisning:. Gaudin F, Nasreddine S, Donnadieu AC, Emilie D, Combadiere C, Prévot S, et al. (2011) Identifikation af chemokin CX

3CL1 som en ny regulator af malignt Cell Proliferation i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (7): e21546. doi: 10,1371 /journal.pone.0021546

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: 23. maj 2011; Accepteret: 1 Juni 2011; Udgivet: 7 Juli 2011

Copyright: © 2011 Gaudin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ligue contre le cancer (Comité Val d’Oise), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Université Paris-Sud, og EU FP6 (INNOCHEM yde nummer LSHB-CT -2.005-518.167). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) udgør den sjette mest almindelige kræftform og den femte hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder i de udviklede lande [1]. På grund af den tavse karakter af tidlige fase sygdom, har de fleste kvinder med EOC dissemineret sygdom (

dvs

ekspansion i bughinden og metastase i omentum) på tidspunktet for diagnose og nuværende fremskreden sygdom, med en fem- års overlevelse under 30% [2]. Trods den høje forekomst og dødelighed af EOC, forbliver de ætiologiske faktorer involveret i æggestokkene carcinogenese dårligt defineret, hvilket begrænser effekten af ​​behandlingsprotokoller.

epitelial tumor mikromiljø består af et komplekst væv, der indeholder flere celletyper. De fleste af disse celler producerer og /eller reagere på chemokiner, som kan spille vigtige roller i udviklingen og progressionen af ​​primære epiteliale tumorer [3] – [5]. Vi har for eksempel vist, at α-CXC-kemokin Stromal celle-afledt faktor-1 SDF-1 /CXCL12 bidrager til immunosuppressive netværk inden for tumormikromiljøet, navnlig ved at skabe rekruttering af præ-DC2s [6]. Vi har også vist, at CXCL12 regulerer tumorangiogenese og at dette er kritisk for tumorvæksten [7]. Derimod lidt, hvis noget er kendt om rollen chemokin fractalkin /CX

3CL1 i EOC, selv om det er blevet dokumenteret at formidle stærke celleadhæsion [8] og dens tilstedeværelse i epitelvæv er bredt dokumenteret [9] – [10]. CX

3CL1 findes i to former. Den membranforankret form, medierer den faste adhæsion af celler, der udtrykker eget receptor, CX

3CR1, til endotelet under fysiologiske flow via sit eget iboende adhæsion funktion og gennem integrin aktivering [11] – [12]. Den opløselige form frigives gennem spaltning ved et sted tæt på membranen [13]. Ligesom andre konventionelle chemokiner, det får immunsystemets celler, der bærer CX

3CR1, såsom T-lymfocytter og cytotoksiske NK-celler, dendritiske celler eller en stor subpopulation af CD14

+ monocytter [8]. Som et resultat af både adhæsion og kemotiltrækkende aktiviteter chemokinet, CX

3CL1 /CX

3CR1 kompleks kan mediere enten pro- eller antitumorvirkninger [14]. Pankreatiske duktale adenocarcinomceller bærer CX

3CR1 specifikt overholde CX

3CL1 udtrykkende celler af neural oprindelse og migrere som reaktion på CX

3CL1 produceret af neuroner og nervefibre, der bidrager til perineurale udbredelse i bugspytkirtelkræft [15 ]. Prostatacancerceller, der udtrykker CX

3CR1 klæbe til humane knoglemarvsceller endotelceller og migrerer mod et medium konditioneret med osteoblaster, som udskiller den opløselige form af kemokinet bidrager til den høje sandsynlighed for prostatacancerceller metastaserende til skelettet [16] – [17]. Derimod kan opløselig CX

3CL1 (SCX

3CL1) udgivet i tumoren mikromiljø være en aktiv del af det anti-tumor respons [18] – [21], hvilket gør vaccination af mus med carcinomceller modificeret til producere CX

3CL1 en potent anti-tumor respons på grund af chemoattraktion af NK-celler [22], eller gør CX

3CL1 udtryk ved kolon kræftceller en faktor, der drastisk reduceret deres metastatiske potentiale [23].

i det foreliggende arbejde har vi undersøgt ekspressionen af ​​CX

3CL1 hos raske og maligne æggestokkene væv og dets rolle i udbredelsen af ​​maligne ovarieepitelceller. Denne chemokinet blev produceret af både raske og maligne ovarieepitelceller, og produktionen i EOC var positivt korreleret til celledeling indeks. Interessant nok blev det også korreleret til ekspressionen af ​​glucocorticoidinduceret leucin-zipper (GILZ), en 17 kDa leucin-zipper-protein opdaget som en dexamethason-induceret transkript i murine thymocytter, og at vi for nylig har vist sig at øge celleproliferation i EOC og aktivere AKT, en afgørende signalmolekyle i tumorigenese [24], [25]. Vores resultater blev støttet af akkumuleret i tumor prøver fra patienter diagnosticeret for EOC, i BG-1 æggestokkræft cellelinje og en mus subkutant xenotransplantationsmodel parallelle og supplerende data. De giver yderligere indsigt i rollen som CX

3CL1 i ondartet celledeling og tumorvækst, tæt forbundet med GILZ.

Resultater

Påvisning af CX

3CL1 i sunde og maligne ovarie væv

Den cellulære udtryk for CX

3CL1 blev undersøgt ved immunohistochemisty (IHC) i afsnit isoleret fra tre sunde æggestokke, otte serøse og mucinøse godartede tumorer (nogle stadig indeholder normale ovarievæv), otte serøs og mucinøse borderline tumorer, to æggestokkene granulosa celle tumorer, og fra 54 prøver af invasiv EOC. CX

3CL1 blev klart påvist i æggestokken overflade epitel (OSE) celler og i epitel æggelederne (figur 1A). I serøse og mucinøse godartede og borderline tumorer blev CX

3CL1 immunreaktivitet detekteret i prolifererende tumorceller afledt fra epitel (figur 1, B og C). CX

3CL1 ekspression blev påvist i EOC prøver, herunder serøs, klar-celle, endometrioide og mucinøse histologiske undertyper (Figur 1D). I disse tumorer, blev det opdaget meste i maligne celler, hvilket gør tumorceller den væsentligste kilde til CX i

3CL1 EOC. I overensstemmelse med denne konstatering, CX

3CL1 blev detekteret i epitelceller fra malign ascites, med højere niveauer af ekspression i CD326

+ fraktion (figur 1E). CX

3CL1 var begrænset til cytoplasmaet af maligne epitelceller og blev ikke påvist i kerner. CX

3CL1 var fraværende fra ikke-epitelial ovariecancer granulosa celle tumorer (figur 1F).

(A) sund æggestok, CX

3CL1 immunoreaktivitet i OSE (i) og æggeleder (ii) . (B) serøs (i) og mucinøse (ii) godartede ovarieepitelceller tumorer. (C) serøs (i) og mucinøse (ii) borderline ovarieepitelceller tumorer. (D) Ondartede epiteliale ovarietumorer: mucinøs (I), endometrioide (ii), klar-celle (iii) og serøs (iv), CX

3CL1 immunreaktivitet i epitelceller er begrænset til cytoplasmaet, ingen farvning i kerner af tumorceller. (E) Cytocentrifuged CD326

– ikke epitelial (i) og CD326

+ epitelial (ii) celler isoleret fra maligne ascites indsamlet fra en patient diagnosticeret med invasiv EOC. CX

3CL1 detekteres i CD326

+ celler og også i nogle CD326

– celler. (F) Ikke-epitelial ovariecancer granulosa celle tumor, fravær af CX

3CL1 immunfarvning. (A-F) Forstørrelse x 40.

Messenger RNA til CX

3CL1 blev visualiseret ved RT-PCR, hvilket gav et produkt med den forventede størrelse (387 bp) fra tre raske ovarieceller prøver i seks prøver fra godartede tumorer i æggestokkene, tre borderline prøver og ni EOC prøver. Det blev også påvist i BG1, SKOV3 og OVCAR3 kræft i æggestokkene cellelinjer. Repræsentative data er vist i figur 2A. Mængden af ​​mRNA blev kvantificeret ved real time PCR på fem EOC prøver. Det var positivt korreleret med intensiteten af ​​IHC farvning på en syv-trins-skalaen (Spearman test,

P

0,05, r = 0,88) (Figur 2B). En 90-kDa proteinet, der svarer til den forventede størrelse af fuld-længde CX

3CL1, blev påvist i EOC biopsiprøver, i CD326

+ epitelceller fra malign ascites og i SKOV3, BG1 og OVCAR3 celler (figur 2C). CX

3CL1 er et membranbundet molekyle med chemokin domæne på en mucin-lignende stilk. Spaltning ved basis af denne stok metalloproteinaser genererer en opløselig chemokin, der fungerer som en klassisk kemoattraktant [13]. Vi derefter undersøgt, om SCX

3CL1 blev løsladt fra æggestokkene cancerceller. Det blev påvist i maligne ascites (varierede fra 1,3 til 1.5 ng /ml). Vi har også udført ELISA assays af dyrkningssupernatanter. De største mængder af SCX

3CL1 blev udvundet fra kultursupernatant af OVCAR3 celler, som gav det kraftigste signal på Western blots (Fig 2D). Vores resultater fremhæve den tidligere unappreciated konstitutiv ekspression af CX

3CL1 på sund epitel af de æggestok overflade og æggeledere, hvilket indikerer, at EOC kan stamme fra en af ​​disse epithel. Vi afslører desuden, at CX

3CL1 produktion af maligne epitelceller forud tumorigenese.

(A)

CX

3CL1

mRNA blev påvist ved konventionel PCR ved den forventede størrelse (387 bp ) i repræsentative prøver fra 2 sunde æggestokke, 5 cystadenomas (godartede tumorer), 2 borderline tumorer, 5 adenocarcinomer (maligne tumorer) og i EOC-afledte cellelinjer, SKOV3, OVCAR3 og BG1. Den hvide lodrette linje adskiller baner ikke køre på samme gel. (B)

CX

3CL1

mRNA niveauer blev kvantificeret ved real-time PCR og udtrykkes som

CX

3CL1

indhold normaliseret til den for

ß-actin

. Diagrammet viser fordelingen af ​​immunfarvning scoringer versus mængden af ​​

CX

3CL1

mRNA normaliseret til de af

ß-actin

5 EOC prøver. Hvert symbol repræsenterer en individuel prøve kørt tredobbelt (middelværdi); Spearman test,

P

0,05, r = 0,88. (C) CX

3CL1 immunblots total protein lysater fra EOC prøver, fra CD326

+ epitel celle-beriget malign ascites prøver, og fra SKOV3, BG1 og OVCAR3 cellelinjer. CX

3CL1 protein er angivet som en -90 kDa bånd. ß-actin niveauer er vist for normalisering. (D) Påvisning ved ELISA af SCX

3CL1 i 24 timer dyrkningsmediet fra BG1, OVCAR3 og SKOV3-celler (data er middelværdier ± SEM af tre separate forsøg); målbart SCX

3CL1 i dyrkningsmediet af HEK-293T celler (HEK), anvendt som en negativ kontrol.

CX

3CL1 er korreleret med Ki-67 og GILZ i EOC

CX

3CL1 immunfarvning var heterogen i EOC prøver, der spænder fra fravær af påviselig farvning (score 0, 9/54) til stærk immunoreaktivitet (scores 5-7, 18/54). Vi undersøgte derfor, om forskelle i CX

3CL1 ekspressionsniveauer var associeret med ekspressionen af ​​to markører for proliferation: Ki-67, som rutinemæssigt anvendes til diagnose [26] og GILZ, som vi for nylig identificeret som en faktor styrer proliferationen af maligne EOC celler [25]. Immunreaktivitet for CX

3CL1, GILZ og Ki-67 blev scoret på en syv-trins-skalaen på grundlag af farvning intensitet og graden af ​​farvning af serielle sektioner af fragmenter af EOC fra 54 patienter. Der var en stærkt signifikant positiv korrelation mellem scorerne for Ki-67 og dem for GILZ, som forventet (tabel 1). Interessant var signifikante positive korrelationer fundet mellem CX

3CL1 og Ki-67 og mellem CX

3CL1 og GILZ, for hele kohorte af 54 patienter (Figur 3, A og B). Immunofarvningen scorer for disse proteiner blev også korreleret i serøs carcinom og ikke serøst karcinom (tabel 1).

(A og B) CX

3CL1 og Ki-67 endelig points (A, Spearman test,

P

0,01, r = 0,38) og CX

3CL1 og GILZ endelige score (B, Spearman test,

P

0,0001, r = 0,59) var positivt korreleret i 54 EOC enheder, heriblandt serøse (sorte firkanter) og ikke serøs (hvide firkanter) prøver. (C) dendrogram genereret af hierarkisk agglomerative cluster analyse for de 54 EOC prøver undersøgt, mod alder ved diagnose, FIGO stadie, grad, Ki-67, GILZ, CX

3CL1 og CXCL12 immunoreaktivitet niveauer. To klynger identificeres, med lav (øverst) og høje (nederst) niveauer af proliferation. Relevante prøver er mærket med tal.

CXCL12, et kemokin produceret af æggestokkene cancerceller [6], har været impliceret i kontrollen af ​​proliferation i disse celler [27]. Som vi tidligere har vist i en kohorte af 183 patienter [28], CXCL12 immunreaktivitet i cancerceller var heterogen, med snesevis af 0 (ikke-detekterbar produktion) opnået i 16 patienter og mellem 5 og 7 (stærk immunoreaktivitet) opnået i otte patienter i vores kohorte af 54 patienter. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem endelige score for CXCL12 og CX

3CL1, eller mellem endelige score for CXCL12, GILZ og Ki-67. En analyse af syv datasæt, herunder alder ved diagnose, FIGO stadie, sortering, GILZ, Ki-67, CX

3CL1 og CXCL12 immunoreaktiviteter på grundlag af en agglomerative hierarkisk klyngedannelse tilgang afslørede to store klynger, som det fremgår af dendrogram genereret fra den statistiske analyse (figur 3C). De vigtigste egenskaber, der adskiller de to store klynger, der svarer til lave og høje niveauer af proliferation, er vist i tabel 2. Som forventet havde CXCL12 produktion ikke signifikant mellem de to grupper. Derimod CX

3CL1 og GILZ immunoreaktiviteter i tumorceller var højere for gruppen med højere spredning. Trods det forholdsvis lille antal patienter, antallet af cancere på FIGO stadium III og IV var signifikant højere i den høje proliferation gruppen. Derimod gjorde alder ved diagnose og lønklasse ikke afvige mellem de to grupper. Således blev højere spredning i forbindelse med opregulering af GILZ og CX

3CL1 udtryk.

GILZ opregulerer CX

3CL1 udtryk

Immunohistokemiske data indikerede tydeligt, at GILZ niveauer i maligne celler blev positivt korreleret med CX

3CL1 niveauer, hvilket tyder på en mulig rolle for GILZ i reguleringen CX

3CL1 produktion. Vi testede denne hypotese ved fastsættelse af størrelsen af ​​CX

3CL1 mRNA og protein i pGILZ (overekspression GILZ) og CTRL (producerer lav mængde GILZ) BG1 celler. Som forventet GILZ indhold (mRNA og protein) var signifikant højere i pGILZ end i CTRL kloner. Parallelle stigninger i CX

3CL1 mRNA og protein blev afbildet på RT-PCR, IHC og western blots (Figur 4, A, B og C). Derudover pGILZ celler frigives større mængder af SCX

3CL1 end kontrolcellerne (figur 4D). Ved anvendelse af en Ab målretning det ekstracellulære domæne af CX

3CL1, Western blots af lysater af BG1 celler behandlet med phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), en proteinkinase C (PKC) aktivator, udviste et fravær af 90-kDa bånd svarende til den fulde længde af CX

3CL1. Omvendt denne behandling øget udgivelsen af ​​SCX

3CL1 ind supernatanten. (Figur 4, C og D). Tilsammen vores resultater viser, at CX

3CL1 produktion af ovarieepitelceller maligne celler opreguleres ved GILZ.

(A)

CX

3CL1

PCR signal intensitet i CTRL og pGILZ BG-1 celler blev kvantificeret ved densitometri med normalisering mod signalet for

ß-actin

; Resultaterne udtrykkes som

CX

3CL1 /ß-actin

nøgletal. Et eksperiment repræsentativt ud af tre. (B) Immunfarvning for CX

3CL1 på CTRL og pGILZ BG1 cytocentrifuged celler. Forstørrelse x 40. (C) Total cellulær proteinekstrakter af CTRL og pGILZ BG1 celler dyrket med eller uden 100 ng /ml PMA i 24 timer blev analyseret ved western blotting med et specifikt Ab anerkender det ekstracellulære domæne af CX

3CL1. CX

3CL1 niveauer blev kvantificeret ved densitometri, med normalisering mod signalet for ß-actin; Resultaterne udtrykkes som CX

3CL1 /ß-actin nøgletal. Et eksperiment repræsentativt for tre. (D) Histogrammer viser frigivelsen af ​​SCX

3CL1 i supernatanten af ​​celler behandlet eller ej med PMA, som målt ved ELISA. Resultater er de middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg. *

P 0,05

, fravær versus tilstedeværelse af PMA og

#

P 0,05

, CTRL versus pGILZ BG1 celler (uparret

t

test)

CX

3CL1 stiger ondartet celledeling

Vi viste, at SCX

3CL1 er udgivet af æggestokkene cancerceller fra nedlæggelsen af ​​membranbundne chemokin tyder på, at SCX

3CL1 kan være en aktiv bestanddel af det tumorale mikromiljø. Her spurgte vi, om dette chemokin har en indvirkning på tumorcelleproliferation, som foreslået af korrelationen af ​​CX

3CL1 og Ki-67 immunfarvninger i EOC prøver. Denne proliferative handling kan være resultatet af en autokrin virkning af CX

3CL1, som afhænger af ekspressionen af ​​sin unikke receptor, CX

3CR1 [8]. Vi har registreret

CX

3CR1

mRNA ved konventionel RT-PCR på den forventede størrelse (340 bp) i alle de testede EOC prøver (N = 14) og i de tre EOC cellelinier, BG1, SKOV3 og OVCAR3. Flow-cytometrisk analyser yderligere afsløret membran CX

3CR1 udtryk i både CD45

+ og CD45

– celler fra maligne tumor prøver. I CD45

– fraktion, der er stærkt beriget med maligne epiteliale ovarieceller, procentdelen af ​​CX

3CR1

+ -celler lå i området fra 20% til 95% (figur 5A). I BG1 celler, steady-state niveau af membran CX

3CR1 udtryk var svag ( 10% af de samlede celler) under basale betingelser (figur 5B). Interessant nok den del af CX

3CR1

+ -celler blev markant forøget ved sur behandling, en proces kendt at dissociere liganden fra dens receptor. På en anden side, at reducere koncentrationen af ​​FBS fra 10% til 1% i dyrkningsmedium ført til øget membran ekspression af CX

3CR1 i BG1 celler (figur 5C). I modsætning hertil niveauet af overfladen CX

3CR1 var lavere i pGILZ celler, som producerer højere mængder af SCX

3CL1 end CTRL-celler. Baseret på disse resultater, vi bruges CTRL BG1 celler dyrket i medium suppleret med 1% FBS at måle den proliferative effekt af rekombinant human (rh) CX

3CL1 efter [

3H] -thymidin inkorporering. Resultater fra ni uafhængige forsøg viste, at rhCX

3CL1 omtrent fordoblet hastigheden af ​​celleproliferation efter 24 timers behandling (figur 6A). Dette respons blev ophævet ved tilsætning af en CX

3CL1 analog med en modificeret N-terminus, som binder til CX

3CR1 og fungerer som en antagonist (figur 6B) [29]. Disse resultater viser en proliferativ virkning af eksogen CX

3CL1 gennem sin binding til CX

3CR1. Derefter undersøgte vi, om endogene CX

3CL1 stimulerer tumorcelleproliferation. Til dette formål pGILZ BG1 celler, som genererer store mængder af endogene CX

3CL1, blev behandlet med den CX

3CL1 analog fornyes hvert 24 timer i 72 timer. Under disse betingelser, blev hastigheden af ​​celleproliferation markant nedsat, underliggende en rolle for endogen CX

3CL1 i reguleringen tumorcelleproliferation (figur 6C).

(A) Niveauer af CX

3CR1 og af den pan-hæmatopoietisk markør CD45 blev bestemt ved flowcytometri i 2 frisk dissocierede prøver af EOC prøver. Tal angiver frekvenser af CX

3CR1

+ CD45

– celler. (B) Repræsentative FACS profiler til CX

3CR1 niveauer i BG1 celler. Venstre, overflade udtryk for CX

3CR1 under basale betingelser; midten, overflade udtryk for CX

3CR1 i celler efter sure behandling; højre, udtryk for CX

3CR1 i permeabiliserede celler. Tal angiver procentdelen af ​​CX

3CR1

+ -celler (gennemsnit ± SEM) for 3 uafhængige eksperimenter. (C) Histogrammer viser fluorescensintensiteten af ​​CX

3CR1 farvning ved overfladen af ​​CTRL BG1 celler dyrket i nærvær af 1% eller 10% FBS, og CTRL og pGILZ BG1 celler dyrket i nærvær af 1% FBS. Tal angive den procentdel af CX

3CR1

+ celler til et repræsentativt forsøg ud af tre.

(A-C) Proliferation blev målt ved [

3H] -thymidininkorporering (A) i CTRL-celler inkuberet med eller uden 10 ng /ml rhCX

3CL1 i 24 timer, 9 uafhængige forsøg. Histogrammer repræsenterer midler ± SEM, parret t-test,

**

P

0,001; (B) i CTRL-celler inkuberet med eller uden 10 ng /ml rhCX

3CL1 i 24 timer, i nærvær eller fravær af 10 pg /ml CX

3CR1 antagonist; hvert symbol repræsenterer en individuel prøve løb tre eksemplarer linjer repræsenterer middelværdier, *

P

0,05,

t

test, en repræsentant eksperiment ud af tre; (C) i pGILZ celler med og uden behandling med 10 ug /ml CX

3CR1 antagonist erstattes hver 24 timer i 72 timer, hvert symbol repræsenterer en individuel prøve løb triplo, linjer repræsenterer middelværdier, *

P

0,05,

t

test, en repræsentativt forsøg ud af 3. (D) Total cellulær proteinekstrakter af CTRL celler dyrket i nærvær og fravær af 10 ng /ml rhCX

3CL1 analyseret ved western blotting med Ab’er. Pakt niveauer blev kvantificeret ved densitometri, med normalisering mod signalet for total AKT. Resultater er udtrykt som Pakt /AKT-forhold. En skamplet, repræsentant for tre udført, vises.

AKT hyperaktivering ofte observeret i ovariecancer og er relateret til kontrol af celledeling i EOC [30], [31] [32] – [33]. Niveauer af Pakt, som er den aktive AKT form var højere i rhCX

3CL1-behandlede BG1 celler (Figur 6d). Disse resultater tyder på, at proliferative effekt af CX

3CL1 /CX

3CR1 par er forbundet med AKT aktivering. GILZ har tidligere blevet identificeret som en proliferativ faktor aktivering AKT i EOC [25]. For at bekræfte, at CX

3CL1 handling involverer AKT aktivering

in situ

, målt vi Ki-67 og Pakt scorer på EOC prøver scorede 0 for GILZ og enten producerer eller ikke CX

3CL1. Som vist i tabel 3, spredning og AKT fosforylering var højere i prøver, der producerer CX

3CL1. Tilsammen disse resultater tyder på, at den proliferative effekt af CX

3CL1 om ovarieepitelceller maligne celler er fortløbende til CX

3CR1 bindende, der aktiverer AKT.

In vivo

virkningen af ​​GILZ overekspression

Endelig har vi undersøgt effekten af ​​GILZ og CX

3CL1 på tumorvækst

in vivo

ved at bruge en mus subkutan xenograftmodel. BG1 celler enten overekspression GILZ (pGILZ) eller ej (CTRL) blev injiceret subkutant i atymiske nøgne mus og tumorvækst blev fulgt i 35 dage. De gennemsnitlige tumorvolumener er repræsenteret grafisk i figur 7A. Tumorerne udviklingslande fra pGILZ celler havde signifikant større mængder end dem, der udvikler sig CTRL, på ethvert givet tidspunkt. Western blots af xenograft ekstrakter og immunfarvning viste parallelle stigninger i GILZ og CX

3CL1 proteinniveauer (figur 7, B og C). Således

GILZ

overekspression er klart forbundet med højere niveauer af CX

3CL1 produktion i tumorer, hvilket resulterer i højere spredning og tumorvækst.

(A) pGILZ eller CTRL BG1 celler (40 × 10

6 celler /ml) blev injiceret subkutant i den højre flanker af nøgne mus. Tumorstørrelse blev målt hver 5 dage, i 35 dage (n = 3 mus pr gruppe). Tumor volumen [mm

3] blev beregnet som følger: (længde [mm]) × (bredde [mm])

2 × 0.5 **

P

0,001 (uparret

t

test). (B) Total cellulær proteinekstrakter af xenotransplanterede tumorer blev analyseret ved western blotting med Ab’er. CX

3CL1 og GILZ niveauer blev kvantificeret ved densitometri, med normalisering mod signalet for ß-actin; Resultaterne udtrykkes som CX

3CL1 eller GILZ /ß-actin nøgletal. En blot-repræsentativt for tre udføres, er vist. (C) Serielle sektioner af pGILZ og CTRL xenotransplanterede tumorer blev farvet for CX

3CL1, GILZ og Ki-67. Negativ kontrol: ingen mærkning blev opdaget, da hver primære Ab blev udeladt. Forstørrelse x 40.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi afsløret, at CX

3CL1 blev konstitutivt produceret i EOC og undersøgte rolle denne chemokin i tumorvækst. Produktionen af ​​denne chemokin forud malignitet i OSE, og blev også fundet i æggelederne af raske kvinder og godartede tumorer. Immunhistologisk analyse viste, at CX

3CL1 produktion i EOC prøver blev korreleret med niveauer af Ki-67 og GILZ, to markører af spredning i maligne ovarieepitelceller. Hierarkisk klyngedannelse analyse identificerede to store klynger, med høje og lave niveauer af spredning, forskellige i GILZ og CX

3CL1 niveauer.

In vitro

, GILZ overproduktion fører til en stigning i CX

3CL1 produktion i BG1 celler. CX

3CL1 øger BG1 proliferation via dets receptor, CX

3CR1, og der ses en parallel stigning i Pakt niveauer. I xenotransplanterede mus, overekspression af både GILZ og CX

3CL1 er forbundet med hurtigere tumorvækst. Disse resultater fremhæver en sammenhæng mellem GILZ og CX3CL1 som en vigtig regulator af ondartet celleproliferation og tumorvækst.

Ifølge de seneste hypoteser vedrørende oprindelse og histogenese af EOC, type I tumorer, som menes at omfatte alle større histotypes, stammer fra OSE, der traditionelt er blevet anset for at være kilden til neoplastisk transformation. Derimod til type II tumorer, som menes omfatter næsten udelukkende high-grade serøse carcinomer, menes at stamme fra det distale område af æggelederne [34] – [36]. Både OSE og æggelederne er i øjeblikket menes at være mulige kilder til neoplastisk EOC og begge er afledt af den embryonale mullerian kanal [37]. CX

3CL1 er blevet påvist i den menneskelige endometrium [38] og æggeledere [39]. Vi har detekteret også CX

3CL1 i OSE, hvilket yderligere indikerer, at produktionen af ​​CX

3CL1 af epitel æggestokkene celler forud tumorigenese. CX

3CL1 blev også påvist i benigne og grænsetilfælde tumorceller, hvilket tyder på, at produktionen ikke er forbundet med malignitet.

æggestokkene epiteliale tumorer er morfologisk heterogene og er klassificeret af patologer i serøs, klar celle, endometrioide og mucinøse undertyper på grundlag af histopatologisk undersøgelse. Hver subtype er kendetegnet ved en specifik mRNA profil, genetiske risikofaktorer og molekylære funktioner [34] [40] – [41], hvilket antyder, at ovariecancer er en heterogen sygdom [42]. Trods denne forskellighed, fandt vi ingen signifikant sammenhæng mellem CX

3CL1 niveauer og histologiske type, i vores serie, som omfattede repræsentative prøver af alle fire vigtigste histologiske typer af EOC. Ligesom GILZ og CXCL12, CX

3CL1 er almindeligt udtryk i EOCs og dens tilstedeværelse ikke afspejler den morfologiske heterogenitet EOC [25] [28].

De kemokiner, herunder CXCL12, produceres lokalt i æggestokkene tumorer og bidrage til tumormikromiljøet [5] – [6]. Her identificerer vi CX

3CL1 som en anden komponent af EOC mikromiljø. Epitelceller fra maligne ascites, tumor prøver og fra tre æggestokkene kræftceller, nemlig BG1, OVCAR3 og SKOV3, viste farvning for CX

3CL1. CX

3CL1 var begrænset til cytoplasmaet og var fraværende fra kerner. Cellerne indeholdt CX

3CL1 med en molekylvægt på 90 kDa svarende til membranen form af CX

3CL1, hvorfra den opløselige form afledes ved at kaste [8]. Produktionen af ​​SCX

3CL1 i kultursupernatanter parallelt at den membranbundne form, hvilket antyder, at produktionen af ​​SCX

3CL1 i EOC mikromiljø var forøget i tumorer med stærk CX

3CL1 immunreaktivitet. Interessant, den lokale frigivelse af CX

3CL1 kan også afhænge af CXCL12, produceret af epitelceller æggestokkene maligne celler i EOC og vides at regulere spaltningen af ​​CX

3CL1 fra neuroner [43]. Vi kan ikke udelukke, at CXCL12 stimulerer metalloproteinaser involveret i CX

3CL1 spaltning i EOCs, som den gør i neuronale kulturer. Faktisk er yderligere undersøgelse af dette aspekt skal indgå.

Intensiteten af ​​CX

3CL1 farvning og den del af tumorceller farvet for CX

3CL1 var variabel i vores kohorte af 54 patienter med fremskreden primær EOC. Denne heterogenitet i produktionen af ​​CX

3CL1 var positivt korreleret med GILZ niveauer.