PLoS ONE: Anterior Gradient Protein-2 er en regulator for Cellulær Vedhæftning i prostata Cancer

Abstrakt

Anterior Gradient Protein (AGR-2) er rapporteret at være over-udtryk på mange epitelial kræft og fremmer metastaser. En klar mekanisme til dens observerede funktion (er) er ikke tidligere blevet identificeret. Vi fandt signifikant opregulering af AGR-2 ekspression i en knogle metastatisk prostatacancer-cellelinie, PC3, efter dyrkning i knoglemarv-konditioneret medium. Betydelig AGR-2-ekspression blev også bekræftet i prostata cancer vævsprøver fra patienter med knoglelæsioner. Ved at udvikle stabile kloner af PC3-celler med varierende niveauer af AGR-2-ekspression, identificerede vi, at ophævelsen af ​​AGR-2 betydeligt reduceret cellulær binding til fibronectin, collagen I, collagen IV, laminin I og fibrinogen. Tab af cellulær adhæsion var forbundet med kraftigt fald i ekspression af a4, a5, av, p3 og p4 integriner. Manglende undergå apoptose efter frigørelse er kendetegnende for epitelial cancermetastase. De AGR-2-tavshed PC3 celler viste højere modstand til Tumornekrosefaktor-relaterede apoptosis- inducerende ligand (TRAIL) induceret apoptose

in vitro

. Denne iagttagelse blev også støttet af signifikant reduceret Caspase-3-ekspression i AGR-2-tavshed PC3-celler, hvilket er en vigtig effektor af både ydre og indre død signalveje. Disse data tyder på, at AGR-2 indflydelse prostatakræft metastaser ved regulering af cellulær vedhæftning og apoptose

Henvisning:. Chanda D, Lee JH, Sawant A, Hensel JA, Isayeva T, Reilly SD, et al. (2014) Anterior Gradient Protein-2 er en regulator for Cellulær Vedhæftning i prostatakræft. PLoS ONE 9 (2): e89940. doi: 10,1371 /journal.pone.0089940

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: 22 oktober, 2013; Accepteret: 25 Jan 2014; Publiceret: 27 feb 2014

Copyright: © 2014 Chanda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den finansielle støtte fra National Institutes of Health giver R01 AR560948, R01 CA133737 og P30 AR046031 er taknemmeligt værdsat. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Raj Singh er en medarbejder i Vivo Biosciences Inc. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft har den højeste forekomst blandt alle kræftformer hos mænd i den udviklede verden og er den tredje hyppigste dødsårsag bag lunge og colorektale cancere [1]. Patogenesen af ​​prostatakræft og dens præferentielle metastase til knogle og andre organer er reguleret af gener, der fungerer sammen om at fremme hvert trin i carcinogenese og den metastatiske kaskade [2] – [4]. Selvom distinkte gen underskrifter for stadier af kræft progression er rapporteret i brystkræft, er sådanne oplysninger vedrørende prostatakræft stadig mangler [5]. Identificering den rolle, nye molekyler af diagnostisk og terapeutisk betydning er stadig en stor fokus på aktuelle kræftforskning. Ved genanalyse, observerede vi signifikant forøgelse af AGR-2 i PC3 prostatacancer-cellelinie, metastaseret til knogler, efter opretholdelse i normal knoglemarv-konditioneret medium. AGR-2 blev først identificeret som XAG-2 i

Xenopus laevis

, der inducerer differentiering af cement kirtel, der hjælper embryoner fortsat hænger ved substratet gennem sekretion af et mucinøs [6] stof. Den mammale homolog, AGR-2, er et protein (PDI), som indeholder en thio-redoxin domæne og ansvarlig for intestinal slimproduktion [7]. Mus, som mangler AGR-2 er tilbøjelige til at udvikle colitis [7]. AGR-2 har trukket stor opmærksomhed i de seneste år for sin formodede rolle i neoplastisk progression og metastase [8] – [15]. AGR-2 har vist sig at være overudtrykt i forskellige adenocarcinomer og er blevet forbundet med ringe overlevelse af patienter med brystkræft og prostatakræft [16], [17]. Få seneste rapporter har kastet lys over de regulatoriske elementer af AGR-2-funktion, men dens særlige rolle (r) i tumorigenese og progression til metastase mangler stadig [18] – [20]. I prostatacancer, er AGR-2 rapporteret at være androgen inducerbar og kun overudtrykkes i de tidlige stadier af carcinogenese [13], [21]. Tværtimod også en nylig undersøgelse observeret reduceret AGR-2 ekspression i høj kvalitet tumorer, som faldt sammen med metastatisk sygdom [13].

Den foreliggende undersøgelse anvendte AGR-2 gene silencing metode i knogle metastatisk human prostatacancer cellelinje PC3 at forstå dens biologiske funktion i prostatakræft knoglemetastaser. Resultaterne indikerede tab af AGR-2 i PC3-celler resulterede i signifikant reduktion i tumor celleadhæsion, tab af ekspression af a4, α5, av, p3 og p4 integriner og udvikling af apoptose resistens, hvilket antyder rolle AGR-2 i metastaserende kaskade af prostata kræft ved at påvirke tumorcelleadhæsion og migration.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

En osteolytiske human prostatacancer-cellelinie, PC3, blev købt fra ATCC (Manassas , VA), og en klonal derivat af PC3-celler, der udtrykker ildflueluciferase, var en generøs gave fra Dr. Kenneth J. Pienta (University of Michigan, Ann Arbor, Michigan). Begge cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Mediatech Inc. Hendron, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Mediatech Inc.) og penicillin /streptomycin (Mediatech Inc.). Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og oprenset under anvendelse af et QIAGEN mini kit (Valencia, CA). cDNA microarray analyse blev udført af Cancer Genomics delte ressourcer på Winship Cancer Center for Emory University (Atlanta, Georgien) ved hjælp af en Illumina Beadstation 500 og data blev analyseret ved JAVA Treeview, Spotfire, Gene Cluster 3.0 og Opfindsomhed pathway analyse. iScript cDNA-syntese kit blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA). AGR-2-primere (fremadrettet 5′-TTGGGGTGACCAACTCATCT-3 ‘; Reverse 5’GGACAAACTGCTCTGCCAAT-3’) for RT-PCR-analyse blev udformet under anvendelse af (version 4.0) software Primer 3 og oligonukleotider blev indkøbt fra Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA). cDNA-prøver blev analyseret i Bio-Rad iCycler (Hercules, CA). 3-dimensional (3-D) PC3 perler for vækst i knoglemarv konditioneret medium blev dannet efter væksten af ​​PC3-celler på hu-Biogel matricer og leveres af Vivo Biosciences (Birmingham, AL). En Vybrant ® MTT Cell Proliferation Assay Kit blev indkøbt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). 3-D Culture Matrix ™ basalmembran ekstrakt blev indkøbt fra Cultrex (3445-00.501, Gaithersburg, MD). En Cytoselect ™ 48 brønde celleadhæsion assaykit blev købt hos Cell Biolabs, Inc. (CBA-070, San Diego, CA). Alle kits og reagenser blev anvendt efter producentens anvisninger.

Antistoffer Salg

Mus og humane monoklonale antistoffer og polyklonale antistoffer til AGR-2 blev købt hos Abcam Ltd (Cambridge, MA, og anvendt i en fortynding af 1:1000 for immunblots og 1:500 for IHC). Et integrin antistof sampler kit blev indkøbt fra Cell Signaling (4749S, Danvers, MA, og anvendt i en fortynding på 1:1000 for immunblots og 1:500 for IHC). Caspase-3, blev spaltet caspase-3 og beta-actin-antistoffer købt fra Cell Signaling (Danvers, MA, og anvendt i en fortynding på 1:500 for immunblots). Sekundær immuno-detektion blev udført under anvendelse af gede-anti-rotte /mus /kanin IgG ABC kits indkøbt fra Vector Laboratories (Burlingame, CA) og GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). For immunfluorescens sekundær detektion blev gede-anti-rotte /mus /kanin-IgG mærket med Alexa-Fluor-594 købt hos Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR, 2 ug /ml). Salg

humant væv Prøver

Bone metastatisk prostatacancer væv blev opnået fra obduktion ved University of Alabama i Birmingham i overensstemmelse med godkendt institutionelle review board (IRB) protokol. Formalin-fikserede paraffin-embedded tissue blokke opnået fra disse kilder blev snittet til 6 um. Alle vævsprøver blev revideret og karakteriseret ved bord-certificeret anatomiske patologer.

Isolering af knoglemarv-conditioned Medium

Male C57BL /6 mus blev aflivet, og både lårben og skinneben blev høstet og marv var skylles med sterilt serumfrit SIGMA Stemline medium (St Louis, MO) under anvendelse af en 28,5 gauge nål monteret på en 1 ml sprøjte i en 50 ml sterilt rør indeholdende 10 ml serumfrit Stemline medium. Knoglemarvsceller klumper blev fjernet ved gentagen passage gennem en 16,5 gauge nål monteret på en 10 ml sprøjte, indtil der opnås en homogen enkelt cellesuspension. Cellerne pelleteres via centrifugering ved 1200 rpm, vasket tre gange ved anvendelse af serum-frit medium og til sidst resuspenderet i 50 ml Stemline medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og antibiotika. Cellerne fortyndes yderligere med serum indeholdende Stemline medium til 100 ml og distribueres til fire 150 cm

2 celle-dyrkningskolber (Corning Inc. Corning, NY) til vedligeholdelse i et fugtigt kammer med 95% O

2 og 5% CO

2 forsyning. Efter to dage blev dyrkningsmediet opsamlet og centrifugeret ved høj hastighed for at slippe af celler og rester. Supernatanterne blev puljet og anvendt direkte til dyrkning af 3-D, PC3 perler.

Konstruktion af rekombinant shRNA Vektor og Udvikling af enkeltcelle-afledte PC3 Kloner med AGR-2 Knockdown

Twenty én-base mål pair blev udvalgt fra unikke områder af AGR-2 kodende sekvens under anvendelse Tuschl et al., 1999 siRNA design guidelines [22]. Blandt de testede shRNA sekvenser, var den, der viste maksimal virkning anvendes i den foreliggende undersøgelse og bestod af 21-mer forstand (GACAAACACCTTTCTCCTGAT) og anti-sense strenge adskilt af en 9-bp-region og indeholdt BamHI- eller HindIII restriktionssites, henholdsvis , til retningsbestemt kloning (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Oligonukleotiderne blev annealet og ligeret direkte ind i en pRNAT.U6 /Neo /GFP-ekspressionsplasmid (Genescript, Piscataway, NJ). En af de 21-mer sekvenser (CCTTGAGACTTGAAACCAGAA), der undlod at lukke munden AGR-2-ekspression blev brugt som den eksperimentelle kontrol at minimere enhver off-target effekt. PC3-celler blev dyrket i 6-brønds plader til ca. 90% konfluens i antibiotisk medium. Cellerne blev derefter transficeret med AGR-2 shRNA udtrykkende plasmider ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter 24 timer blev transfektionsmediet udskiftet med komplet medium, og efter yderligere 24 timer blev GFP-positive celler flow sorteres og vedligeholdes i præ-standardiseret 600 pg /ml neomycin (10131, GIBCO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Når neomycin-resistente celler udviklet, celler blev trypsinbehandlet og igen udpladet i 96-brønds dyrkningsskåle ved en 1 celle /brønd hyppighed, i dubletter. AGR-2 knockdown PC3-kloner (PC3

AGR-2sh) og kontrol celle kloner (PC3

Kontrol) blev udvalgt efter at teste for AGR-2-ekspression via western blotting og immunofluorescens analyser.

sTRAIL- induceret apoptose Assays Salg

Rekombinant human TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) blev indkøbt fra EMD Millipore Corporation, Temecula, CA. PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev behandlet med 0, 12,5, 25, 50 og 100 ng /ml koncentration af TRAIL. Cellelevedygtighed blev bestemt efter 12 timer og 72 timer efter propidiumiodidfarvning (BD Biosciences) og MTT celleproliferationsassay Kit hhv. Behandlede celler blev også høstet efter 0 timer, 1 time, 3 timer og 6 timer efter celle skrabning blev cellepellets vasket to gange med iskold PBS og underkastet Western blotting til påvisning af caspase 3 og aktive spaltede caspase-3 peptider.

Western Blotting

Celler blev trypsinbehandlet, vasket og resuspenderet i protein lysis buffer før være fryse-optøet én gang ved -80 ° C. Proteiner blev denatureret tilsætning SDS-PAGE-buffer indeholdende β-mercaptoethanol og inkubering ved 95 ° C i 5 min. Genomisk DNA blev forskudt ved ultra-sonikering. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Lowry fremgangsmåde (Biorad, Hercules, CA). Proteiner blev separeret i enten 10 eller 15% polyacrylamidgel og overført til nitrocellulose-membran. Membranen blev inkuberet i 1 time, i 2% fedtfri tørmælk i TBST at blokere ikke-specifik primær antistofbinding. Membranen blev derefter inkuberet natten over med passende fortyndet primære antistoffer i TBST-buffer. Beta-actin antistof blev anvendt som indlæsning kontrol. Efter en 3 gange vask i TBST blev membranen inkuberet i gede-anti-muse /kanin-IgG konjugeret til peberrodsperoxidase (1:5000, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) i 30 min. Membranen blev vasket igen i TBST og udviklet under anvendelse af et forøget kemiluminescens-reagens (GE Healthcare Bio-Sciences Corp. Piscataway, NJ) og afbildes på en Fuji LAS-3000 kemiluminescens udvikler.

Immunofluorescens

både PC3

kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev dyrket i kultur indtil 50% konfluens i kamre objektglas, vasket grundigt i PBS og fikseret i iskold 3,7% paraformaldehyd i PBS indeholdende 0,1% Triton-X-100 , i 20 min, ved stuetemperatur. Celler blev vasket grundigt og inkuberet natten over ved 4 ° C i monoklonalt rotte human AGR-2-antistof. Efter PBS vask blev cellerne inkuberet med Alexa-fluor-594 mærket anti-rotte IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) i 30 minutter ved stuetemperatur. Celler blev vasket og kerner blev farvet med DAPI for kontrast. De fluorescerende mærkede celler blev monteret under anvendelse af Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) og set i et Leica DMRB fluorescensmikroskop.

Histomorfometri og Immunhistokemi

Bløde væv blev fikseret i 10% neutral buffered- formalinopløsning i 48 timer før indlejring i paraffin til histologisk analyse. Bone væv blev afkalket i 0,5 mol /l EDTA i Ca

2 + – og Mg

2 + -fri Dulbeccos PBS (Cellgro) før indlejring i paraffin. Seks um langsgående serielle snit blev skåret fra lårben og skinneben og farvet med hematoxylin og eosin (H Becton Dickinson laboratorieudstyr) i serum-frit medium i tre eksemplarer. For at initiere migration 10% FBS blev anvendt som en kemo-tiltrækningsstof i det nedre kammer. Celler blev inkuberet i 6 timer ved 37 ° C og fjernes fra det øvre kammer med en vatpind. Celler på undersiden af ​​kammeret blev visualiseret under et fluorescensmikroskop og talt under anvendelse Billede J software. Effekten af ​​AGR-2 lyddæmpning på PC3 celle migration blev præsenteret som relative værdier sammenlignet med kontrol (100%).

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved Students

t

-prøve. Værdier forudsat er Mean ± SEM og forskellene blev betragtet som signifikante, hvis p. 0,05

Resultater

AGR-2 Expression øges i metastatisk prostatacancer celler i nærvær af konditioneret knoglemarvens mikromiljø

knoglemetastaser er kendetegnende for formidling prostatakræft, som tilbyder en ideel ramme for at studere metastaser af sådanne kræftceller i mikromiljø og specifikt de molekylære signaler, der fremmer deres overlevelse i metastatisk niche. At belyse, om reaktioner på sådanne signaler i mikromiljøet ændrer AGR-2 ekspression i prostatacancerceller blev PC3-celler dyrket i 3-dimensionelle sfæroider og opretholdt i 3 dage i knoglemarven-konditioneret medium. Totalt RNA blev isoleret fra disse celler og underkastet cDNA microarray analyse (figur 1A), som efterfølgende blev bekræftet ved kvantitativ reel-tid RT-PCR (Gene Expression Omnibus, GEO accession # GSE38714; NCBI tracking system # 16.589.736). AGR-2 var overudtrykt signifikant (p 0,05) sammenlignet med PC3 celler dyrket i regulære medium (figur 1B), hvilket antyder AGR-2 kan være påkrævet til den indledende tilpasning af metastatiske tumorceller til den nye mikromiljø. AGR-2-ekspression blev også bestemt i knogle metastatisk prostatacancer vævsprøve. Intens AGR-2-ekspression blev fundet, hvilket tyder på krav om AGR-2 til etablering af knoglemetastaser (figur 1C).

A. cDNA microarray varme kort, der viser højere AGR-2-ekspression (rød) i PC3 celler dyrket i knoglemarven medium i forhold til almindelig medium (grøn). B. Real-time RT-PCR data, der viser en signifikant (p 0,05) stigning i AGR-2 ekspression i PC3-celler efter vækst i normal knoglemarv konditioneret medium (BMCM) sammenlignet med når de dyrkes i regelmæssig medium (RM). C. immunhistokemisk analyse, der viser intense AGR-2 immunfarvning i de menneskelige prostatacancerceller metastaseret til knogler (Original Forstørrelse 400x).

Bestemmelse af AGR-2 mRNA ekspression i forskellige Prostata Cancer Cell Lines

Relativ AGR-2-mRNA-ekspression blev bestemt i knogle metastatisk PC3, LNCaP og C4-2B human prostatacancer-cellelinier og hjerne metastatisk DU145 prostatacancer-cellelinie ved RT-PCR. Resultater viser signifikant højere AGR-2 ekspression i PC3, LNCaP og C4-2B cellelinjer sammenlignet med DU145-cellelinje, hvilket tyder på vigtigheden af ​​AGR-2 i prostatacancer knoglemetastaser (figur 2A).

A. AGR-2-niveauer blev bestemt ved hjælp af RT_PCR analyse i forskellige human prostatacancer-cellelinier. Knoglen metastatiske PC3 celler har den højeste AGR-2 mRNA-ekspression, mens hjernens metastatiske DU145 celler har den mindste mængde af AGR-2-ekspression. B. Udvikling af AGR-2 tavshed PC3 celler. Western blot-analyse, der viser signifikant nedregulering af AGR-2-protein efter stabil indførelse af shRNA konstruktion målretning AGR-2 i PC3-celler. beta-actin blev anvendt som en loading kontrol. C. Immunofluorescensanalyse sammenligner AGR-2-ekspression i AGR-2 tavshed PC3 celler versus kontrol PC3 celler (Original forstørrelse 400X).

Bestemmelse af AGR-2 Expression i PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh cellelinjer

Mængden af ​​AGR-2-genet nedregulering i PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev vurderet ved Western blotting (figur 2B) og immunfluorescensfarvning (Figur 2C ). Over halvfems procent nedregulering af AGR-2-ekspression blev opnået i PC3

AGR-2sh celler sammenlignet med PC3

Kontrol celler.

ændret vækst Karakteristik af PC3 celler efter AGR-2 Gene Silencing

Når PC3 celler med varierende niveauer af AGR-2-ekspression blev analyseret

in vitro

, var der ingen signifikant forskel i spredning på mellem PC3

AGR-2sh og PC3

Kontrol cellelinier (figur 3a). Men i monolagskulturer, PC3

Kontrolceller syntes at være fibroblastlignende og solidt fastgjort til plastoverfladen. Cellerne blev løst forbundet til hinanden og kun via pseudopodial udvidelser. PC3

AGR-2sh celler på den anden side opretholdes mere epitel fænotype med rundet eller kubisk morfologi og dannede en brosten udseende, når sammenflydende. I modsætning til de PC3

Kontrol celler, PC3

AGR-2sh celler syntes at være løst fastgjort til plastic overflade (figur 3B).

A. MTT celleproliferationsassay viser tilsvarende vækstrater i PC3

kontrol og PC3

AGR2sh celler. B. PC3

kontrol celler (ovenfor) viser en fibroblast-lignende udseende med pseudopodia-lignende forlængelse for celle-celle kontakter. PC3

AGR2sh celler (nedenfor) viste en mere epitelcelle-lignende, afrundet fænotype. Disse celler blev også løst fæstnet til dyrkningsskålene sammenlignet med kontrolceller. Den grønne fluorescens i de højre paneler viser både PC3

kontrol og PC3

AGR2sh celler konstitutivt udtrykker GFP grund af tilstedeværelsen af ​​GFP udtrykkende kassette i vektorerne anvendes til at skabe kontrol og AGR-2-tavshed PC3-cellelinjer.

AGR-2 Fremmer Cellular Vedhæftning

Når PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev sammenlignet for deres evne til at binde til forskellige ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, herunder fibronectin, collagen i, collagen IV, laminin og fibrinogen udnytte en celleadhæsionsassayet kit, resultater viste signifikant reduktion i evnen af ​​PC3

AGR-2sh celler fortsat hænger ved alle komponenter i den testede ECM. PC3

AGR-2sh adhæsion til fibronectin blev faldet max (70%) blandt andre ECM-proteiner, hvilket indikerer AGR-2 påvirkninger pathway (s), der fremmer cellulær adhæsion (figur 4A).

A. Adhæsionsegenskaber af PC3

kontrol og PC3

AGR2sh celler blev evalueret efter vækst i petriskåle overtrukket med forskellige ECM-proteiner. Først blev celler podet i to eksemplarer på de overtrukne substrater og tillades at adhærere. Derefter blev ubundne celler vaskes bort, og de adhærerende celler blev fikseret og farvet. Endelig blev pletten ekstraheret og kvantificeret kolorimetrisk. Væsentlig reduktion i cellulær vedhæftning til fibronectin (*** p 0,001), collagen I (** p 0,01), collagen IV (*** p 0,001), laminin (* p 0,05) og fibrinogen (* p 0,05) blev observeret i tilfælde af PC3

AGR2sh celler sammenlignet med PC3

kontrolceller. BSA coatede brønde blev anvendt som reagenset kontrol (p 0,1). Data præsenteret her er gennemsnit ± SEM. B. Betydelige nedregulering af a4, a5, av, p3 og p4 integriner blev observeret i PC3

AGR2sh celler i forhold til PC3

kontrol celler. blev ikke observeret nogen forskel i p1 integrin niveauer mellem de to celletyper. Beta-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Flere proteinbånd til stede i blots indbefatter integrin precursor og modne proteiner samt spaltede produkter forventes molekylmasse ifølge fabrikantens oplysninger (Cell Signaling Technology, Cat # 4749S).

Tab af Integrin ekspression i PC3 celler, der mangler AGR-2

integrin heterodimerer i forskellige kombinationer er kendt for at mediere cellulær adhæsion til ECM og spiller en vigtig rolle i tumorvækst og metastase [23]. At afgøre, om modulationer af AGR-2 niveauer under tumorvækst og metastase er forbundet med ændrede integrin niveauer og funktion, vi bestemt udtryk for et panel af integriner (a4, a5, av, p1, p3, p4 P5 integriner) i PC3

AGR-2sh og PC3

Kontrol celler ved Western blotting. Markant reduceret ekspression af a4, a5, av, p3 og p4 integriner blev observeret i PC3

AGR-2sh celler. Sammenlignelige mængder af p1 integrin niveauer blev observeret i begge cellelinier hvorimod ingen β5 integrin blev påvist i nogen cellelinie. Disse data antyder kraftigt en rolle for AGR-2 i reguleringen cellulær adhæsion via integrin ekspression. (Figur 4B).

Reduceret af Tumor Cell Migration i AGR-2-lyddæmpet PC3 Cells

For at afgøre, om reduceret celleadhæsion og integrin udtryk i AGR-2-tavshed PC3 celler påvirket PC3 celle migration, blev både en “sårlukning” assay samt en Boyden kammer migration assay udført. Resultaterne viste signifikant reduceret (p 0,01) tumorcellemigration i AGR-2-tavshed PC3-celler sammenlignet med kontrolpatienter PC3-celler. Begge disse analyser også tyder celleadhæsion via integrin udtryk er afgørende for tumor celle migration (Figur 5 A B).

High AGR-2 udtrykker PC3

kontrol celler og lav AGR-2 udtrykker PC3

AGR-2sh celler blev dyrket i 6 brønd dyrkningsskål op til 90% sammenflydning. De blev serum sultet natten over og fik lov til at migrere efter oprettelsen af ​​sår ved anvendelse af en 200 pi pipettespids og tilsætning af frisk komplet medium. Fotografier blev taget ved 0 timer og 22 timer til bestemmelse af hastigheden af ​​sårlukning mellem de to cellelinier. B. Boyden Chamber Assay: PC3

kontrolceller og PC3

AGR-2sh celler blev udpladet på cellekultur-indsatse i serumfrit medium og migration af celler blev stimuleret tilsætning af 10% FBS som chemoattractant i nederste kammer. Efter 6 timers inkubation blev celler fjernet fra toppen af ​​indsatsen ved hjælp af en vatpind og celler på undersiden af ​​indsatsen blev fotograferet og talt. Effekten af ​​AGR-2 lyddæmpning på PC3 cellevandring præsenteres her som relative værdier sammenlignet med kontrol (100%).

Udvikling af TRAIL Modstand i PC3

AGR-2sh Cells

Tidligere forsøg angivet AGR-2-tavshed PC3 celler viste reduceret celleadhæsion, integrin udtryk og migration. Normale epitelceller undergår apoptose efter løsrivelse fra basalmembranen (anoikis) henviser anoikis resistens er et af kendetegnene ved maligne cancerceller. For at bestemme om AGR-2 silencing har bidraget til modtagelighed for anoikis, både PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev dyrket

in vitro

i 72 timer i nærværelse af 0, 12,5, 25, 50 og 100 ng /ml af rekombinant human opløselig (e) TRAIL-protein. Resultatet af eksperimentet blev analyseret ved cellelevedygtighed assay under anvendelse af en MTS celleproliferationsassay kit efter TRAIL behandling. Selvom celledød blev observeret i begge PC3

Kontrol celler og PC3

AGR-2sh celler, PC3

AGR-2sh celler overlevede TRAIL udfordring væsentligt bedre end de PC3

Kontrol celler (figur 6A), hvilket tyder tab af AGR-2 kan være forbundet med udvikling af anoikis resistens i maligne tumorceller. Cellelevedygtighed efter sTRAIL udfordring blev også bestemt ved farvning af cellerne med propidiumiodid (PI). PC3

Kontrol og PC3

AGR-2sh celler blev dyrket

in vitro

i 12 timer i nærværelse af 0 ng /ml og 100 ng /ml koncentration af sTRAIL efterfulgt af PI farvning. Fase kontrast, fluorescerende og overlagt billeder blev taget med et Leica DMI 4000B mikroskop og analyseret med Image J software. Både levende og døde celler blev talt, og ikke-levedygtige celler (PI positive) var repræsenteret som procent af det samlede antal celler. Resultaterne viste signifikant højere PI positive celler (p 0,05) i PC3

Kontrolceller sammenlignet med PC3

AGR-2sh celler (figur 6 B p 0,02 ved Fishers eksakte test) mellem AGR -2 og caspase-3 antyder en tendens til samtidig forekomst af disse to molekyler [26].

a. PC3

kontrol og PC3

AGR2sh celler blev behandlet

in vitro

med forskellige koncentrationer af sTRAIL. Cellelevedygtighed blev testet efter 72 timer under anvendelse af en celleviabilitetstest kit. Markant højere celledød (p 0,001) blev observeret i PC3

kontrol celler i forhold til PC3

AGR2sh celler. B. Cellernes levedygtighed efter sTRAIL udfordring blev også bestemt mellem PC3

kontrol og PC3

AGR2sh celler ved PI farvning og visning under fluorescensmikroskop (Original Forstørrelse 200X). C. Flere fotografierne blev taget for hver cellelinje efter sTRAIL behandling og PI farvning. Både levende og døde celler blev manuelt talt under anvendelse Billede J software og grafisk afbildet. D. Western blot analyse, der viser caspase-3 og kløvet caspase-3 niveauer i ikke-inducerede og TRAIL-induceret kontrol og AGR-2-tavshed PC3 celler.

Diskussion

Prostatakræft metastaserer til knogle og producerer osteoblastiske /osteolytiske læsioner, som forårsager alvorlige smerter i knoglerne, at modtagelighed brud og rygmarvskompression [27]. Bone metastatisk cancer er uhelbredelig og fører til betydelig sygelighed og dødelighed hos disse patienter. Adhæsion af afstødes, cirkulerende kræftceller i knoglemarven ECM-proteiner er et stort skridt nødvendige for etablering af knoglemetastaser [28]. I vores microarray undersøgelse signifikant opregulering af AGR-2-mRNA-ekspression efter vedligeholdelse i knoglemarv konditioneret medium foreslår en rolle af AGR-2 i at lette væksten af ​​prostatacancerceller i knoglen mikromiljø.