PLoS ONE: EMT og Køb af stamcelle-lignende egenskaber er involveret i spontan Dannelse af Tumordannende Hybrider mellem lungekræft og knoglemarv-afledte mesenchymstamceller Cells

Abstrakt

Den mest dødelige fase i kræft progression er metastatisk konvertering. Epiteliale-til-mesenkymale overgang (EMT) er en vigtig proces, hvorved cancerceller erhverve invasive og metastatiske fænotyper. For at gyde makroskopiske metastaser, ville disseminerede cancerceller synes at kræve selvfornyelse kapacitet. Imidlertid er den underliggende mekanisme afgrænser disse processer dårligt forstået. En mulig mekanisme underliggende metastase er fusion mellem myeloide celler og cancerceller. I denne undersøgelse fandt vi, at spontant dannede tumorigene hybrider mellem knogle marv-afledte mesenchymal-stamceller (MSC’er) og tre forskellige ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier bidrog til stærkt maligne subpopulationer med både EMT og stamcelle-lignende egenskaber. Hybrider mistet deres epitelial morfologi og antog en fibroblast-lignende udseende. blev observeret opregulering af vimentin, α-glatmuskelactin (α-SMA), og fibronectin og nedregulering af E-cadherin og pancytokeratin i tumorigene hybrider. Disse celler udviste også forøget ekspression af stamcelle markør prominin-1 (CD133) og overekspression af transskription faktorer OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 samt Sox2, alle gener, der er ansvarlige for regulering og vedligeholdelse af stamcelle-fænotype. Derudover i spontant dannede tumorgene hybrider, øget pneumosphere-dannende evne og tumor-dannende evne i NOD /SCID-mus kunne påvises. Således celle fusion mellem lungekræft celler og servicekontrakter giver en nonmutational mekanisme, der kunne bidrage til afvigende genekspressionsmønstre og giver anledning til meget ondartede subpopulationer både i stand til EMT og med egenskaber for kræft stamceller (CSCS).

Henvisning: Xu MH, Gao X, Luo D, Zhou XD, Xiong W, Liu GX (2014) EMT og Erhvervelse af stamcelle-lignende egenskaber er involveret i spontan Dannelse af Tumordannende Hybrider mellem lungekræft og knoglemarv-afledte mesenchymal stamceller . PLoS ONE 9 (2): e87893. doi: 10,1371 /journal.pone.0087893

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: August 17, 2013; Accepteret: 6 jan 2014; Publiceret: 6 feb 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81.071.728). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lung cancer, især ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), forbliver den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. De mest almindelige former for såkaldt NSCLC omfatter adenocarcinom, pladecellecarcinom og storcellet carcinom [1], [2]. Tumor metastaser er den primære årsag til dødsfald som følge af NSCLC. Imidlertid forbliver de mekanismer der er involveret i tumormetastaser dårligt forstået.

epitel-mesenkymale overgang (EMT) er en trans-differentiering proces, hvorved celler undergår en morfologisk skifte fra epitel polariserede fænotype til mesenkymale fibroblastoid fænotype, og involverer tab af cellepolaritet, nedsat celle-til-celle-adhæsion, og øget motilitet og kapacitet for migration [3]. EMT er blevet foreslået at være et vigtigt skridt i formidling kræftcelle og metastase. Under processen med tumormetastase, som ofte aktiveret af en EMT, ville disseminerede cancerceller synes at kræve selvfornyelse kapacitet, for at gyde makroskopiske metastaser. Nyligt arbejde afslørede, at processen med EMT genererer celler med stemlike egenskaber i brystkirtler cellepopulation [4]. Forbindelsen mellem EMT og erhvervelse af stamceller celle-lignende egenskaber ved at kræftceller kan forklare, hvorfor EMT inducerer tumorprogression. Men de mekanismer, der inducerer og derefter opretholde denne mesenkymale /stammer celle tilstand er fortsat uklare.

Købet af metastatisk evne ved tumorceller betragtes som en sen begivenhed i udviklingen af ​​maligne tumorer, hvor metastatisk celle er formodes at opstå gradvis og trinvis at akkumulere de yderligere mutationer, der kræves for motilitet. For nylig har dog dette paradigme blevet anfægtet. Nye beviser tyder på, at maligne celler kan formidle på et langt tidligere tidspunkt, end der tidligere er indregnet i tumorigenese [5], [6]. Dette antyder, at en tidligere trigger skal drivkraft for udviklingen af ​​den bevægelige fænotype, så nogle af disse celler til at bryde fri fra den primære tumor, invadere mikrovaskulaturen, rejser og etablere foci på fjerne steder. Dannelsen af ​​hybrider mellem cancerceller og normale knoglemarv-afledte celler i tumor-associerede stroma er blevet anbefalet som en nonmutational mekanisme, der kunne bidrage til afvigende genekspression mønstre forbundet med meget ondartede subpopulationer [7] – [11].

Cellefusion er en grundlæggende proces, der forekommer i både sundhed og sygdom, hvor to eller flere celler bliver en ved at fusionere deres plasma membraner og omarrangere deres nukleare indhold. Afkommet af cellefusion er kendt som hybrider. Sådanne fusion hybrider deler de genetiske og funktionelle egenskaber fra begge forældre celler [7], [9], [12]. Genomet af cancerceller kan bidrage tumorigenicitet til hybriderne, hvorimod myeloide celler kan bidrage ekspression af mesenchymale gener og forøget metastatisk potentiale.

I det seneste årti, flere særskilte undergrupper af tumorinfiltrerende myeloide celler er blevet beskrevet [ ,,,0],13], blandt hvilke mesenkymale stamceller (MSC’er) har gjort opmærksom for at have en rolle i cancer progression [14] – [16]. MSC’er er en lille population af celler i mesenchymale stromale celle rum, der har kapacitet til at forny sig selv og til at differentiere til flere cellelinier. MSC’er infiltration er almindelig i NSCLS [17]. I de fleste tilfælde, tumorinfiltrerende MSC’er giver forskellige funktionelle hjælpemidler til fremme malignitet, der spænder fra strukturel støtte til at skabe en forud metastatisk miljø [18], [19].

Alle disse forskellige linjer af beviser tyder den hypotese, at fusogene myeloide cellepopulationer, såsom MSC’er, kunne gøre det lettere for tumorceller at erhverve mesenchymale og stamcelle-lignende egenskaber ved at overføre forskellige cellulære funktioner under en fysisk fusion begivenhed med cancerceller. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at identificere, om hybrider dannet ved fusion mellem humane lunge kræftceller og knogle MSC’er kunne blive en ressource for mesenkymale /cancer stamceller-lignende celler.

Resultater

Spontan Dannelse af MSC-lunge Cancer Hybrider

Kulturperler MSC udstillet fibroblastlignende cellemorfologi (figur S1A), typiske fænotyper og var positive for CD44, CD105 og negativ for CD34 (figur S1B), og har multipotency at differentiere til osteoblaster, adipocytter og chondrocytter efter osteogen, adipogeniske og chondrogen induktion differentiering (fig S1c-E).

Vi først evalueret, om spontant dannede heterotypiske hybrider kunne findes i en co-kultur eksperiment. MSC’erne blev fluorescens tagget af retroviral transduktion med RFP-udtrykkende vektorer, og lungecarcinomceller blev tagget af EGFP-udtrykkende vektorer. Vi co-dyrkede humane MSC’er med humant A549, H460, eller SK-MES-1 lunge kræftceller. Efter 72 timer celler, der udtrykker både EGFP og RFP blev detekteret (figur 1A). Som cellefusion skred frem, observerede vi MSC’er gradvist vender grønne og lunge kræftceller gradvist dreje rød, således duelt fluorescerende celler, med tydelig stromale morfologi og udsender gul fluorescens, opstod (Figur 1B). Tilstedeværelsen af ​​to eller flere kerner blev påvist i de fleste af disse celler. Den heterotypisk hybrid population udgjorde 2,91 ± 0,35%, 1,23 ± 0,13% eller 3,20 ± 0,48% af de totale celler i MSC-A549 co-kultur, MSC-H460 co-kultur eller MSC-SK-MES-1 co-kultur, henholdsvis som vurderet ved flowcytometri (fig 1C). viste dog, et kontrolforsøg, at cellefusion var relativt ikke-detekterbar ved samtidig dyrkning humane MSC’er med BEAS-2B (normal human bronchial epitel cellelinje) eller MRC-5 (normal human lunge fibroblastcellelinie) hhv.

(a) Fluorescerende mikrografer af en co-kultur af A549-EGFP (grøn) og MSC-RFP (rød), der viser dannelsen af ​​dobbelt-mærkede hybrid celle med to kerner og en fibroblastisk form (pile). Scale bar, 50 um. (B) Fluorescerende mikrografer, udtaget med 2 timers interval, i co-kulturer af SK-MES-1-EGFP (grøn) med MSC-RFP (rød), der viser tilsyneladende involvering af cellefusion (pile) og ændring i farve i interaktionen af ​​lungecancerceller med MSC’er. Scale bar, 10 um. (C) Kvantificering af spontan hybridisering mellem lungekræft celler (A549-EGFP, H460-EGFP eller SK-MES-1-EGFP) og MSC-RFP i high-density co-kultur. Antallet af hybrider blev bedømt ved flowcytometrianalyse og udtrykt som en procentdel af de totale celler. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SEM af tre eksperimenter. (D) FISH-analyse af HCC827 /MSC co-kulturer. Mandlige MSC’er dyrkedes med kvindelige HCC827 lungecancerceller i 8 dage og fikseres. FISH (Spectrum rød-Y-kromosom og Spectrum grøn-X-kromosomet) blev udført, og kerner blev farvet med DAPI (blå). Grønne pile viser X-kromosomer og røde pile, Y kromosomer. Mand MSC’er udtrykte et Y-kromosom og et X-kromosom mens kvindelige HCC827 celler udtrykte kun X-kromosomer. I HCC827 /MSC hybrider: eksempel på to celler, én huser to kerner og den anden med en kerne. Disse to celler hver besidder et Y-kromosom indikerer et MSC-afledt celle. Scale bar, 25 um.

For at bekræfte rollen som fusion, køns- uoverensstemmende MSC og HCC827 celler blev co-dyrket og heterotypiske hybrider blev evalueret ved FISH af kønskromosomer. Til disse eksperimenter blev kvindelige HCC827 celler gjort puromycinresistente ved lentiviral transduktion. De HCC827 /MSC hybrider blev udvalgt ved udsættelse for 1 ug /ml puromycin, som forårsagede fuldstændig forsvinden af ​​mandlige MSC’er. Efter 5 dage med selektion, er opdaget forekomst af mandlige-afledte hybrider med stromale morfologi. Nogle af hybriderne indeholdt en enkelt kerne med et Y-kromosom og flere X-kromosomer, hvilket indikerer, at kernen af ​​en mandlig MSC havde fusioneret med kernen i en kvindelig HCC827 celle. Nogle celler indeholdt to kerner, en med et Y-kromosom og andre uden et Y-kromosom, hvilket indikerer, at membranen af ​​en mandlig MSC havde fusioneret med membranen af ​​en kvindelig HCC827 celle uden fusion af de to kerner (figur 1D). Andre celler indeholdt en enkelt kerne med et Y-kromosom og et X-kromosom, hvilket tyder mitose af fusionerede flerkernede celler giver anledning til MSC-afledte mononukleære datterceller (fig S2a).

For at bekræfte forekomsten af ​​fusion

in vivo

, køns- uoverensstemmende MSC og HCC827 celler var frisk blandet i samme forhold som det, der anvendes i

in vitro

analyser derefter xenotransplanterede ved subkutan injektion i NOD /SCID immunsvækkede mus. Cellefusion mellem MSC’er og HCC827 celler blev evalueret ved FISH af kønskromosomer. Fem uger efter xenografting blev spontant dannede mandlige-afledte tumorigene hybrider detekteres (figur S2B). Kollektivt, disse data indikerer, at spontant dannede MSC-lungekræft hybrider kan observeres både

in vitro

in vivo

.

Fusion mellem MSC og lungekræft Cells inducerer morfologiske forandringer og væksthæmning

ved 5 til 7 dage efter afslutningen af ​​puromycin behandling, vi isoleret puromycin-resistente fluorescerende hybrider ved fluorescens-aktiveret celle sortering. Efter fusion med MSC-RFP, mistede A549-EGFP celler deres epitelial morfologi. De blev dispergeret og antog en fibroblast-lignende udseende med en aflang form og front-to-back polaritet. Den samme virkning blev observeret med H460-EGFP og SK-MES-1-EGFP-celler (figur 2A). Disse hybrider udtrykkes både EGFP og RFP (figur 2B), og to eller flere kerner blev påvist i de fleste af disse celler. Vores observationer tyder på, at en overgang fra epitelial til mesenkymale-lignende morfologiske karakteristika blev induceret ved fusion.

(A) Fase kontrast billeder af heterotypiske hybrider og respektive forældre lunge kræftceller. Efter fusion med MSC’er, lungecancerceller dispergeret, mistede deres epithelmorfologi og antog en fibroblast-lignende udseende med aflang form og front-to-back polaritet. Scale bar, 500 pm. (B) Konfokal laser mikroskopi billeddannelse. A549 /MSC hybrider antaget en fibroblast-lignende udseende og udtrykkes både EGFP og RFP. Scale bar, 25 um.

Næste, vi testede den hypotese, at fusion med MSC kan påvirke kræft celleproliferation. I alle testede cellelinier (A549, H460 og SK-MES-1), fusion med MSC’er induceret væksthæmning. Hybrider begyndte at vokse langsommere end respektive parentale lungecancerceller fra dag 2, og forskellen i væksten hastighed mellem de to grupper var signifikant efter dag 4 (fig S3). Disse resultater viser, at den proliferative potentiale hybrider faldt væsentligt i forhold til de respektive forældre lunge kræftceller på hvert tidspunkt efter dag 2.

Fusion med MSC Fremmer en Shift fra Epithelial til Mesenchymale Fænotype i Lung Cancer Cells

i betragtning af de morfologiske ændringer af MSC-lungekræft hybrider, Derefter undersøgte vi, om de har erhvervet et skift i ekspression fra en epitelial til en mesenchymal repertoire. Vi brugte immunofluorescens og QRT-PCR til at undersøge udtryk og distribution af E-cadherin, pancytokeratiner, vimentin, α-glatmuskelactin (α-SMA) og fibronektin i heterotypiske hybrider og i deres respektive forældre lunge kræftceller. Vi brugte også QRT-PCR til at undersøge ekspressionen af ​​EMT-inducerende transkriptionsfaktorer såsom Snail, Slug, Zeb1, Zeb2, Foxc2 og Twist gener.

Immunfluorescensfarvning viste, at sammenlignet med forældrenes lunge kræftceller, MSC -lung cancer hybrider udviste en kraftig reduktion i protein ekspression af E-cadherin og pancytokeratiner samt signifikant forøget ekspression af vimentin, α-SMA og fibronectin i alle tre NSCLC cellelinier (figur 3A-E).

MSC’erne og lungekræft celler fluorescens tagget af retroviral transduktion med RFP- og EGFP-udtrykkende vektorer, hhv. Spontant-formede heterotypiske hybrider udtrykkes både EGFP og RFP. Immunfarvning blev udført med primære antistoffer mod (A) E-cadherin (E-Cad), (B) pancytokeratin (PCK), (C) vimentin (Vim), (D) α-SMA, og (E) fibronectin (fibro) og afslørede under anvendelse AlexaFluor 647-mærkede sekundære antistoffer (lilla); kerner blev farvet med DAPI (blå). Scale bar, 25 um. (F) Ekspressionsniveauerne af mRNA’erne koder E-cadherin, vimentin, α-SMA, fibronektin, Foxc2, Slug, sneglen, Twist, Zeb1 og Zeb2 i spontant dannede A549 /MSC, H460 /MSC, SK-MES-1 /MSC heterotypiske hybrider i forhold til de respektive forældre lungekræft celler som bestemt ved QRT-PCR. GAPDH mRNA blev anvendt til at normalisere variabiliteten i skabelonen læsning. De data indberettes som gennemsnit ± SEM.

QRT-PCR-analyser viste, at i forhold til udtryk i forældrenes lunge kræftceller, blev niveauet af E-cadherin mRNA i hybrider stærkt reduceret, mens ekspressionen af mRNA’er koder mesenchymal markører blev markant forøget (figur 3F). Der var også en betydelig stigning i ekspressionen af ​​EMT-inducerende transkriptionsfaktorer (figur 3F). Salg

For at bestemme kapaciteten af ​​lungecancerceller at erhverve mesenchymal karakteristika uden fusionsbegivenheder, EGFP-udtrykkende lungecancerceller og RFP-udtrykkende MSC’er blev udpladet i det øverste og nederste brønde i en 0,4 um-celledyrkningsinsert. Efter indirekte co-dyrkning i 8 dage, lungecancerceller udviste lignende ekspression af E-cadherin, vimentin, α-SMA og fibronectin i alle tre NSCLC cellelinjer sammenlignet med parentale lungecancerceller der blev dyrket alene (data ikke vist). Disse resultater viste, at MSC-lungekræft hybrider udtrykte markører associeret med celler, der har undergået en EMT.

Hybrider Anskaf Øget motilitet og invasiv

For yderligere at undersøge en anden funktionel kendetegnende for mesenkymale /stamcelle tilstand, gennemførte vi

in vitro

motilitet assays. I migration analyser, A549 /MSC hybrider var mere vandrende (5,5 gange) i forhold til forældrenes A549 celler, H460 /MSC hybrider var mere vandrende (5,9 gange) i forhold til forældrenes H460 celler, og SK-MES-1 /MSC hybrider var mere vandrende (4,1 gange) sammenlignet med parentale SK-MES-1-celler (figur 4A). I invasion assays, A549 /MSC hybrider var mere invasive (3,8 gange) sammenlignet med forælder A549 celler, H460 /MSC hybrider var mere invasive (5,9 gange) i forhold til forældre H460 celler, og SK-MES-1 /MSC hybrider var mere invasive (5,8 gange) sammenlignet med forælder SK-MES-1-celler (figur 4B). Tilsammen vores observationer indikerer, at spontant dannede hybrider mellem lungecancerceller og MSC’er repræsenterer en subpopulation beriget med bevægelige celler.

vandrende og invasive potentiale af cellerne blev bestemt ved at tælle antallet af celler, der var migreret til den nedre overflade af filteret i 12 tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter pr insert. (A) Migration assays: mikroskopiske billeder og kvantificering. (B) Invasion analyser: mikroskopi billeder og kvantificering. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg. Stjernerne skildrer statistisk signifikante forskelle mellem de heterotypiske hybrider og respektive forældre lungekræft celler (*

P

0,001). Scale bar, 50 um.

Gene Expression Profilering af Stemness Markers i Hybrider

stamcelle markør prominin-1 (CD133), et pentaspan membranprotein, kan ikke være den eneste markering, men det er stadig den mest udbredte rapporterede markør for cancer stamceller (CSCS) af lungekræft, og er blevet bekræftet af forskellige grupper [20] – [22]. Vi vurderede yderligere udtryk for CD133 på MSC-lungekræft hybrider ved hjælp af flowcytometri og QRT-PCR. Flowcytometri analyser viste, at i parentale A549-celler, den procentsats, der udtrykker CD133 var omkring 0,94% af den totale cellepopulation. Efter fusion med MSC’er, ekspressionen af ​​CD133 steg 30 gange. Derudover CD133 ekspressionen steg i hybrider sammenlignet med deres respektive parentale H460 og SK-MES-1 cellelinier (figur 5A). QRT-PCR-analyser afslørede også, at i forhold til ekspression i parentale lungecancerceller blev niveauet af CD133 mRNA i hybrider væsentligt forøget (figur 5B). Disse data giver yderligere bevis, som spontant dannede tumorigene hybrider mellem lungecancerceller og MSC’er erhverve overekspression af stamcellemarkører ledsaget af passage gennem en EMT.

(A) Flowcytometrianalyse af CD133 ekspression i heterotypiske hybrider og respektive forældre lunge kræftceller. Procentdele af CD133

+ -celler er vist i kontrol antistof og specifikke antistof-farvede celler. Grå og sort linie angivne negativ kontrol og prøve hhv. (B) Ekspressionsniveauerne af mRNA’erne koder CD133, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1, Sox2 og OCT4 i spontant dannede A549 /MSC, H460 /MSC og SK-MES-1 /MSC heterotypiske hybrider i forhold til respektive forældrenes lungekræft celler som bestemt ved QRT-PCR. GAPDH mRNA blev anvendt til at normalisere variabiliteten i skabelonen læsning. De data indberettes som gennemsnit ± SEM.

For at undersøge de gener, der er ansvarlige for regulering og vedligeholdelse af stamcelle fænotype af A549 /MSC hybrider, vi udførte QRT-PCR for OCT4, Nanog, BMI1, Notch1 , ALDH1 og Sox2. Interessant, transskription faktorer OCT4, Nanog, BMI1, Notch1, ALDH1 og Sox2, kendt for at være tilstrækkeligt til at omprogrammere mus eller humane somatiske celler til udifferentierede, pluripotente stamceller, viste sig at være signifikant forøget i hybrider i forhold til forældrenes lungekræft celler, angivelse af deres stemness fænotype (figur 5B). Disse resultater viser, at selv-fornyelse gener over-udtryk i spontant dannede hybrider mellem lungekræft celler og servicekontrakter.

Evne til at danne Tumor Spheres øges i Hybrider

Den bløde agar assay tjener som en

in vitro

surrogat mål for tumorgenicitet [23], mens pneumosphere assay måler forankringsuafhængig spredning på klontæthed

in vitro

og er blevet forbundet med tilstedeværelsen af ​​stamceller populationer [ ,,,0],24]. Vi har derfor udsat disse celler til både bløde agar og pneumosphere analyser. Interessant observerede vi, at de heterotypiske hybrider dannet mindst 7,5 gange flere kolonier i blød agar suspensionskultur end gjorde kontrol- parentale lungecancerceller (figur 6A og figur S4A). Lige så vigtige, hybride celler viste signifikant forøget evne til at danne pneumospheres forhold til deres parentale lungecancerceller, dannelse af mindst 7,3 gange flere pneumospheres end deres parentale celler (figur 6B). Den pneumosphere størrelse hybridceller var også signifikant større end den af ​​parentale lungecancerceller. Ved at dissociere de oprindeligt dannede mammospheres og genindføre disse celler til sekundære mammosphere kulturer, observerede vi en beskeden stigning i sfære dannelse ved hybrider (Figur s4b). Baseret på denne analyse, konkluderede vi, at spontant dannede tumorigene hybrider mellem lungecancerceller og MSC’er erhverve endnu en egenskab ved CSCS

(A) blød agar-assays:. Enkelte celler (1 x 10

3 pr brønd) blev udpladet i blød agar i 6-brønds plader i tre eksemplarer. Mikroskopiske billeder og kvantificering af heterotypiske hybrider og respektive forældrenes A549, H460 eller SK-MES-1 celler. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM. (B) Pneumosphere assay: Mikroskopiske billeder og kvantificering af heterotypiske hybrider og respektive forældrenes A549, H460 eller SK-MES-1 celler; n = 12. Dataene er angivet som middelværdi ± SEM. Stjernerne skildrer statistisk signifikante forskelle mellem de heterotypiske hybrider og respektive forældre lungekræft celler (*

P

0,001). Scale bar, 100 um.

Heterotypisk Hybrider Exhibit forbedret Tumorigenicitet og Gengiv Human Tumor

in vivo

For at teste, om fusion med MSC lykkes ændre tumor-initierende hyppighed af lungekræft celler, vi injicerede A549 /MSC hybrider, H460 /MSC hybrider samt SK-MES-1 /MSC hybrider og respektive forældre lunge kræftceller i NOD /SCID-mus. Som rapporteret i tabel 1, fandt vi, at injektion af så få som 10

4 hybrider resulterede konsistent i væksten af ​​tumorxenotransplantater med morfologiske træk tæt op ad tumoren induceret af de respektive parentale lungecancerceller, som vist ved hematoxylin og eosin farvning (figur 7A). Mængden af ​​tumor, der genereres af hybrider var signifikant større end resultatet af forældrenes celler (Figur 7B). Disse resultater bekræftede, at spontant dannede tumorigene hybrider mellem lunge kræftceller og MSC repræsenterer en delpopulation beriget for lungekræft-initierende celler.

(A) MSC-lungecancer hybrider er tumorigene og regenerere lignende tumorer til deres respektive forældres lungecancerceller i NOD /SCID-mus. Hematoxylin og eosin (H & E) -farvning udført på tumorprøver afledt af parentale tumor eller fra tumorer genereret ved subkutan injektion af MSC-lung cancer hybrider i NOD /SCID-mus (xenotransplantat). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B)

Overpanel:

Tumorgenetisk potentiale på 1 × 10

3 A549 /MSC sammenlignet med 1 x 10

4 forældrenes A549 celler. Celler blev samtidig injiceret i den højre (A549 /MSC) og venstre flanke (A549) i samme mus, og musen fotografiet blev taget 12 uger efter injektion.

Nederste panel:

Gross patologi tumor genereret ved subkutan injektion af A549 /MSC hybrider i det øverste panel. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. Scale bar, 100 um.

Hybrider Cells generhverve Epithelial-lignende morfologiske karakteristika

in vitro

in vivo

Ved Differentiering

efter 3 måneder i kultur, til en generaliseret overgang fra mesenkymale epitel-lignende morfologiske karakteristika blev observeret for MSC-lungecancer hybrider (figur 8A). En lignende morfologisk ændring blev også observeret under væksten af ​​tumorxenoplantater. Celleformen af ​​hybride xenotransplantater var meget mere ligesom de parentale lungecancerceller i udseende. Stærk membranøs udtryk for pancytokeratiner og E-cadherin i hybrid xenografter sammenlignelige med udtrykket i forældrenes lungekræft implanteret, og cellemorfologi antydede epitel arten af ​​tumorer, at øget udtryk for vimentin, α-SMA og fibronektin foreslog en MSC bidrag til den hybride fænotype (figur 8B). Disse data tyder ustabiliteten af ​​hybriderne. Som tiden går, en tilbageførsel af den blandede fænotype og den omvendte proces betegnes mesenchymale-epitelial overgang (MET) finder sted.

(A) Billeder på hinanden følgende tidspunkter, der viser reversion af de fibroblastiske morfologiske karakteristika A549 /MSC hybrider til en epitel, A549-lignende udseende i kultur. Scale barer: 500 um. (B) Immunohistokemisk farvning for de angivne antigener udført på tumorprøver afledt fra parental A549 tumor eller fra tumorer genereret ved subkutan injektion af A549 /MSC hybrider i NOD /SCID-mus. Eksplantater af tumorxenografter af A549 /MSC hybrider og forældrenes A549 celler viste lignende lungekræft-lignende morfologiske karakteristika. Scale bar, 100 um.

Diskussion

Resultaterne præsenteres her beskriver en uventet konvergens EMT og stamceller ejendomme i spontant dannede tumorigene hybrider mellem lungekræft celler og knogler marrow- afledte MSC’er. Epitel-mesenkymale overgang (EMT) er blevet beskrevet i det seneste årti som en kritisk normal proces under udviklingen og sårheling, men for nylig egenskaber EMT er blevet impliceret i human patologi, herunder cancermetastase [25]. Uafhængigt af disse resultater, har undersøgelser beskrevet beviser af stamceller i en række forskellige cancere. Mani

et al.

Først fundet en sammenhæng mellem disse to sæt fænomener i bryst tumorceller i 2008 [4]. ingen forskning har imidlertid endnu afsløret mekanismerne bag dem, eller identificeret kilden til cellerne med både EMT og stamceller egenskaber. I denne undersøgelse viser vi for første gang, at lungecancerceller kan erhverve mesenchymale egenskaber og stamceller egenskaber gennem en fusion mekanisme med MSC’er. Opdagelsen af ​​spontant dannede tumorigene hybrider mellem lungekræft celler og knogle MSC’er med mange af de egenskaber både EMT og selvfornyende stamceller giver løfte om at løse et stort problem i kræft biologi. Under processen med tumormetastase, kan EMT egenskaber tillade spredning af tumorceller fra den primære tumor i det omgivende stroma og dermed til fjerne steder [26]. Men hvis det store flertal af celler, som er spredt mangler selvfornyelse kapacitet, er deres evne til fundet makroskopiske metastaser kompromitteret fra begyndelsen på grund af deres begrænsede proliferative potentiale. Dette mysterium kan løses, i det mindste delvis af de foreliggende resultater, idet de spontant dannede hybrider mellem cancerceller og MSC’er opnå både EMT og stamcellelignende egenskaber, udvikling af hvilket muliggør kræftceller at formidle fra en primær tumor og til at danne kolonier på afstand.

for nylig sammenhængen mellem kræft progression og infiltration med myeloide celler er blevet anerkendt i en række forskellige kræftformer [13]. Infiltration med myeloide celler er normalt forbundet med mindre gunstige kliniske resultater [27] – [29]. Inflammation er en vigtig bestanddel af det lokale miljø af tumorer [30]. Kemokiner og cytokiner er afgørende elementer, der bidrager til kræft-relaterede inflammation [31], [32]. Tiltrukket af kemokiner, er en bred vifte af MSC fra knoglemarven rekrutteret til tumor sites, og spille en rolle i at lette lungekræft progression [17]. Nylige undersøgelser tyder desuden kronisk inflammation kan fremme cellefusion [33] – [35]. Den foreliggende undersøgelse viser for første gang, at MSC kan fremme EMT og formidling ved hjælp af fusion med lunge- kræftceller. Det giver også en mekanistisk forklaring på den længe anerkendt forbindelse mellem betændelse og cancer progression.

Den foreliggende undersøgelse viser, at cellefusion mellem MSC’er og lungekræft celler resulterer i en subpopulation udviser mesenchymal morfologiske karakteristika og cytogenetiske abnormaliteter, sammen med invasive funktioner og selvfornyelse kapacitet. Det er klart, genom lungecancerceller bidrog tumorigenicitet til hybriderne, mens MSC’er bidrog ekspression af mesenchymale gener og forøget metastatisk potentiale. Nogle af hybriderne kan også få evnen til at forny sig selv og til at differentiere til flere cellelinier fra knoglemarven MSC’er. Interessant nok i en tidligere undersøgelse, spontant dannede tumorigene hybrider mellem MSC’er og brystcancerceller havde en mesenchymal-lignende udseende og blandet ekspression af mesenchymale og brystcarcinom-gener [9]. Vores data er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der spontant-kondenserede tumorigene hybrider mellem MSC og cancerceller efterfølgende kan vedtage fænotype af de modtagende celler [9], [12].

in vivo

tumorigen assay bekræftede deres tumorgene egenskaber, mens forøget ekspression af vimentin, α-glatmuskelactin (α-SMA) og fibronectin, og overekspression af transskriptionsregulerende gener, såsom Slug, snail, Zeb1 , Zeb2, Foxc2 og Twist, viser, at hybrider kan erhverve mesenkymale egenskaber fra MSC. Desuden overekspression af selv-fornyelse gener såsom Bmi1, ALDH1, og Oct-4 viser, at lungekræft celler kan erhverve stamceller celle-lignende egenskaber fra MSC’er ved fusion.

Cogle

et al.

viste ingen tegn på en fusion karyotype mellem epitelceller og knoglemarvsceller bruger konfokal mikroskopi og XY tælling siden donor-afledte (Y kromosom positive) celler detekteret af FISH indeholdt kun ét X-kromosomer [36]. De paradoksale resultater ovennævnte måske på grund af ustabilitet af hybrider. Inden for 3 måneder, både

in vitro

in vivo

, de morfologiske karakteristika af hybride celler ændret. Dette indikerer, at hybrider er ustabile. Celler, der opstår som fusion produkter kan gennemgå “reduktion division”, og DNA ploidi faldt inden for 60 dage [9].