PLoS ONE: miRNA-29c Undertrykker Lung Cancer Cell Vedhæftning til ekstracellulær matrix og metastase ved Målretning Integrin β1 og Matrix Metalloproteinase2 (MMP2)

Abstrakt

Vores pilot forsøg med miRNA arrays fandt, at miRNA-29c (miR -29c) er differentielt udtrykt i den parrede lavt metastatisk lungecancer-cellelinie 95C i forhold til høj-metastatisk lungecancer-cellelinje 95D. Bioinformatik analyse viser, at integrin β1 og matrixmetalloproteinase 2 (MMP2) kunne være vigtige målgener af miR-29c. Derfor fremsatte vi den hypotese, at MIR-29c undertrykker lungecancer celleadhæsion til ekstracellulær matrix (ECM) og metastase ved at målrette integrin β1 og MMP2. De gain-of-funktion undersøgelser, der er rejst miR-29c udtryk i 95D celler ved hjælp af sine efterligner viste reduktioner i celleproliferation, adhæsion til ECM, invasion og migration. I kontraster, tab af funktion undersøgelser, der reducerede miR-29c ved at bruge sin inhibitor i 95 ° C celler forfremmet proliferation, vedhæftning til ECM, invasion og migration. Endvidere dual-luciferase reporter assay demonstrerede, at MIR-29c inhiberede ekspressionen af ​​luciferasegenet indeholdende 3′-UTR’er af integrin β1 og MMP2 mRNA. Western blotting viste, at MIR-29c nedreguleret ekspression af integrin β1 og MMP2 på proteinniveauet. Gelatinezymografi analyse yderligere bekræftet, at miR-29c faldt MMP2 enzymaktivitet. Nøgne mus med xenograftmodeller af lungecancerceller bekræftede, at MIR-29c inhiberede lungekræft metastase in vivo, herunder knogler og levermetastaser. Tilsammen vores resultater viser, at MIR-29c tjener som en tumormetastase suppressor, der undertrykker lungecancer celleadhæsion til ECM og metastase ved direkte inhiberer integrin β1 og MMP2 ekspression og ved yderligere at reducere MMP2 enzymaktivitet. Resultaterne viser, at MIR-29c kan være en hidtil ukendt terapeutisk kandidat target til langsom lungekræft metastase

Henvisning:. Wang H, Zhu Y, Zhao M, Wu C, Zhang P, Tang L, et al. (2013) miRNA-29c Undertrykker Lung Cancer Cell Vedhæftning til ekstracellulær matrix og metastase ved Målretning Integrin β1 og Matrix Metalloproteinase2 (MMP2). PLoS ONE 8 (8): e70192. doi: 10,1371 /journal.pone.0070192

Redaktør: Edward F. Plow, Lerner Research Institute, USA

Modtaget: April 8, 2013; Accepteret: 17 juni 2013; Udgivet: 6. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af delvist af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.800.631, nr 30.872.553 og nr 81.272.433) og en bevilling fra Shanghai Videnskab og Teknologi Udvalg (nr 09411964800). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

dag, lungekræft en af ​​de mest almindelige cancere. Mere end 90% af lungekræftpatienter dør af metastase frem fra deres primære tumorer, hvilket antyder, at metastase er en vigtig prognostisk faktor [1], [2]. Tumor progression og metastase er en kompleks proces, der involverer mange forskellige biologiske spillere. En af de kritiske regulatorer der er involveret i denne proces er en microRNA (miRNA) [3].

Modne miRNA er korte, enkeltstrengede, endogene og ikke-kodende RNA bestående af omkring 22 nucleotider, som regulerer gener på post-transkriptionel niveau i løbet af oversættelsesprocessen. De kan målrette 3′-UTR (utranslaterede regioner) af mRNA, hvilket funktionelt fører til en translationel hæmning eller deregulering af mål-mRNA [4]. miRNA har stor indflydelse på forskellige biologiske processer, herunder celledifferentiering, proliferation, apoptose, stress modstand, fedtforbrændingen, og udvikling. Derfor er de spiller en afgørende rolle i forskellige sygdomme, herunder cancer [3]. Desuden undersøgelser tyder på, at nogle miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere. MiRNA spiller en vigtig rolle i tumorigenese og tumorprogression, herunder proliferation og metastase [3], [5] – [8]. For eksempel MIR-10b fremmer bryst tumormetastase, mens MIR-335 og MIR-126 undertrykke metastasen [9], [10]. Derfor kan den næste generation af terapeutiske mål for maligne tumorer være miRNA [11].

MIR-29 familien er et konserveret familie af miRNA herunder miR-29a, miR-29b, miR-29c, og miR -29d. For nylig blev fundet ekspressionsniveauerne af mange MIR-29 familiemedlemmer at blive reduceret i en række forskellige cancere. For eksempel har Sengupta og hans kolleger vist, at MIR-29c er nedreguleret i nasopharyngeale carcinomer [12], mens Fabbri og hans kolleger opdagede, at MIR-29 familien, herunder MIR-29c målretter DNMT3A og DNMT3B i lungekræft væv og celler [13].

i den foreliggende undersøgelse, vores tidligere pilotundersøgelse fundet en næsten firedoblet differential ekspressionen af ​​miR-29c mellem høj- (95D) og lav-metastatisk (95C) kræft cellelinier (Detaljer i tabel S1). Flere undersøgelser har benyttet sig af denne forskel mellem de to cellelinjer i forhold til invasion og metastase [14], [15]. Men den rolle miR-29c i lungekræft er endnu ikke udforsket og de fleste af dets samlede biologiske funktion er fortsat ukendt. Her viser vi tegn på, at miR-29c fungerer som en metastase suppressor der hæmmer lungekræft celleadhæsion til ECM og migration

in vitro

, og undertrykker kræftcelle fjernmetastaser

in vivo

. Vi bekræftede endvidere, at miR-29c direkte kan nedregulere integrin β1 og MMP2 udtryk ved at målrette 3′-untranslation sekvens, hæmmer protein niveauer af integrin β1 og MMP2, og reducere MMP2 enzymaktivitet. Resultaterne viser, at MIR-29c kan være en hidtil ukendt terapeutisk kandidat mål eller strategi for at forsøge at styre lungekræft metastase. Salg

Materialer og Metoder

Ethics Salg

Alle dyreforsøg blev udført under anvendelse af nøgne hunmus (6-7 uger gamle). Musene blev købt fra SLAC Laboratory Animal Ltd., Co (Shanghai, Kina) og plejes i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle dyr forsøgsprotokol blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Tongji Universitet (IACUC No. 1201).

cellelinjer og cellekultur

parrede lavt metastatisk 95C og high-metastatisk 95D cellelinier blev subklonet fra en lav differentieret human storcellet lungecarcinom-cellelinje PLA-801. Cellerne blev godt autentificeret og offentliggjort af flere forskergrupper [14], [15]. Cellerne blev venligst stillet til rådighed af professor Ying-Lin Lu, Institut for Patobiologi, Institut for Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing, Kina på Dec. 5,2009. Som beskrevet The 95C og 95D-celler blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, USA) med 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% kalv bovinserum, og dyrket ved 37 ° C i atmosfære med 5% CO

2. Cellerne blev anvendt til funktionelle studier inden for 6 måneder efter Thawn fra flydende nitrogen tank.

MikroRNA’er array og QRT-PCR-analyse

Efter at have udført en simpel migration assay til at screene høj- og lav-metastatiske celler vi gennemførte en transwell assay som et indeks af Matrigel invasion

in vivo

hjælp af ikke-invasiv 95 ° C celler i det øverste kammer af den ikke-coatede Transwell indsætte (24 brønde insert, porestørrelse 8 um; Corning, USA) og 95D celler i bunden ved hjælp af en Matrigel (50 ug /ml) overtrukket Transwell indsætte at amplificere den differentielle ekspression af miRNA. Derefter miRNA differentiel ekspression mellem 95 ° C og 95D blev målt under anvendelse af en miR human_01_H10.1_080277 miRNA array (LC Sciences Houston, USA). Alle data blev deponeret hos Gene Expression Omnibus (GEO). Tiltrædelsen nummer er GSE47788. De målte miRNA med en statistisk forskel (

s Restaurant 0,01). Blev anset for at være signifikant differentielt udtrykt

Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) blev udført for at måle ekspressionsniveauerne af 95 ° C og 95D-celler. Total RNA fra vildtype 95C og 95D blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Det totale RNA (50 ng) blev revers-transkriberet med MIR-29c stem-loop RT-primere eller U6 RT-primere (Shanghai Extended Nature Biotech Co., Ltd) ved anvendelse af en RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, USA) i overensstemmelse til fabrikantens protokol til dannelse cDNA. Real-time PCR blev udført under anvendelse af en SYBR® Premix Ex Taq ™ Kit (Takara, Japan) med MIR-29c eller U6 PCR-primere (Shanghai Extended Nature Biotech Co, Ltd). Reaktionerne blev udført ved anvendelse af en ABI7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Alle data for hver prøve blev indsamlet i tre eksemplarer og vurderes ved hjælp af 2

-ΔΔCt relativ kvantitativ analyse.

Gain-of-funktion og tab af funktion for miR-29c

få af funktion assayet ved mIR-29c efterligner og tab af funktion assayet ved mIR-29c inhibitor

in vitro

blev udført af celletransfektion hjælp nedenstående fremgangsmåde. Oligonucleotidsekvenser af miR-29c efterligner, hæmmer og deres negative kontrol er: Salg

MIR-29c efterligner (29c):

Sense: 5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 ‘,

Anti-sense: 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 ‘;

mIR-29c efterligner negativ kontrol (MiNC):

Sense: 5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′,

Anti-sense: 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘;

mIR-29c hæmmer (29ci): 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′

mIR-29c inhibitor negativ kontrol (IhNC): 5’UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘.

Alle disse oligonukleotider chemosynthesized fra Udvidet Nature Biotech, Shanghai.

Cell transfektion

De 95 ° C eller 95D celler dyrket til omkring 80 % sammenflydning i 6-brønds plader og blev transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Cellerne i hver brønd i en plade med 6 brønde blev transficeret med 100 nM efterligner eller 200 nM inhibitor. 24-48 timer efter transfektion blev cellerne høstet til yderligere forsøg, herunder proliferation, adhæsion, migration og invasion.

celleproliferation assays

proliferation af de transficerede celler blev evalueret ved MTT assay. Ca. 2 x 103 celler blev podet i en 96-brønds plade med 100 ul medium i hver brønd. Efter 24 timer, 48 h 72 og 96 timer, 20 pi MTT (5 mg /ml) blev tilsat i en 96-brønds plade og inkuberet i 4 timer før aflæsning ved 530 nm i en pladelæser. Alle uafhængige forsøg blev kørt tredobbelt.

celleadhæsion til ekstracellulær matrix (ECM) assays

Den transficerede celleadhæsion til Matrigel blev vurderet ved MTT-assay og optælling. I MTT-assayet, plader med 96 brønde blev for-overtrukket med 40 pi 50 pg /ml Matrigel (BD Biosciences, USA) og derefter 1 x 104 celler blev udpladet i hver brønd i en plade med 96 brønde med 100 pi medium og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Næste udførte vi MTT-assayet beskrevet tidligere efter tre gange vask væk ikke-adhærente celler med PBS. I optællingen assayet blev den 95D og 95 ° C-celler transficeret med lentivirus af NC-CMV-GFP-LV (Shanghai Genechem) til stabilt at udtrykke GFP-genet. De 95D-GFP og 95C-GFP-celler blev transficeret med 100 nm efterligner eller 200 nM inhibitor, henholdsvis trypsiniseret, vasket to gange i 1 × PBS, og derefter 1 × 104 celler with100 pi medium blev udpladet i hver brønd i en 96-brønds plade pre-coatet med 40 pi 50 pg /ml Matrigel, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 30 min.The ikke-adhærente celler blev vasket ud 3 gange med PBS, og antallet af celler, der klæber Matrigel til taltes under et omvendt mikroskop (Olympus Corp. Tokyo, Japan) ved 100 × forstørrelse fra 3 tilfældigt udvalgte grønne felter i hver brønd. De uafhængige forsøg blev kørt i tre gange.

Cell migration og invasion analyser

Potentialet for migration og invasion af transficerede celler blev evalueret af en transwell assay. I migration assay 2,5 x 104 celler blev dyrket i 200 pi medium med 1% kalv bovint serum i det øvre kammer af et ikke-belagt transwell insert. I det nedre kammer, blev 600 pi medium med 10% kalv okseserum anvendes som kemo-tiltrækningsstof for at fremme cellemigration. I invasionen assayet blev det øvre kammer af Transwell skær overtrukket med 50 pi 2,0 mg /ml Matrigel, og 5 x 104 celler blev udpladet i det øverste kammer i Matrigelcoatede transwell insert. Celler fra begge assays blev inkuberet i 24 timer og celler, som ikke migrerer eller invadere blev fjernet under anvendelse af en vatpind. Alle celler blev farvet ved anvendelse af krystalviolet farvning og talt under et omvendt mikroskop. Vi valgte fire tilfældige udsigt at tælle cellerne og de uafhængige forsøg blev gentaget tre gange.

Bestemmelse af miR-29c targeting sekvenser af beregningsmæssige forudsigelse

Computational forudsigelse er allerede vist sig at være en effektiv og effektiv fremgangsmåde til forudsigelse miRNA mål. Vi brugte Targetscan, PicTar og MIRANDA at forudsige miR-29c targeting sekvenser. Mål, som blev forudsagt af de tre databaser og blev relateret til tumor invasion og metastase været relevante for vores forskning.

Dual-luciferaseanalyse at bestemme virkningerne af målet sekvenser af 3′-UTR-regionen i integrin β1 og MMP2

3′-UTR-fragmentet af integrin β1 og MMP2 gener, herunder mIR-29c bindingssted, blev amplificeret ved PCR fra 95D celle genomisk DNA ved anvendelse af de følgende primere. PCR primere til integrin β1 var:

Intβ1-

Sal

I-UTR1, 5′-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘(fremad),

Intβ1-

Mlu

I-UTR2, 5′-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 ‘(tilbage)

PCR primere til MMP2 var:.

MMP2-

Mlu

I-UTR1, 5′ -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 ‘(fremad), MMP2-

Hind

III-UTR2, 5′-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3′ (tilbage).

integrin β1 og MMP2 gen mutant 3′-UTR fragment indeholdende mIR-29c-bindingssted blev amplificeret fra 3′-UTR fragment under anvendelse af følgende primere for integrin β1 ved Intβ1-

Sal

i-UTR1 + Intβ1-

Mlu

I-

mut

-UTR3 (5′-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 ‘) og for MMP2 af MMP2-

Mlu

i-UTR1 + MMP2-

Hind

III

-mut -.

UTR (5′-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 ‘) (understregede baser viser mutationen stedet)

det amplificerede fragment blev klonet ind i pMIR-RAPPORT Luciferase vektor (Ambion, USA) ved

Sal

i +

Mlu

i

og Mlu

i +

Hind

III site for integrin β1 og MMP2 henholdsvis.

95 ° C eller 95D celler blev co-transficeret i plader med 24 brønde indeholdende 200 ng ildflueluciferase vektor, 40 ng

Renilla

luciferase pRL-TK vektor (Promega, USA) og 100 nM efterligner eller 200 nM inhibitor. Ildflueluciferase fungerede som en reporter gen og

Renilla

luciferase som en normaliseret kontrol. De transficerede celler blev inkuberet i 48 timer. Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA).

Western blotting

Til isolering af totale proteiner, behandlede og kontrolceller blev vasket med 1 x PBS, lyseret med RIPA-buffer (50 m mol /L Tris-base, 150 m mol /l NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 1 m mol /l natriumorthovanadat, 10 m mol /l natrium- fluorid, 1% protease inhibitor cocktail) i 15-20 min på is. Efter centrifugering ved 12000 rpm i 15 min blev supernatanterne opsamlet. og proteinkoncentration blev kvantificeret ved BCA-proteinassay. 20-30 ug totale proteiner blev opløst i SDS-PAGE loading buffer, opvarmet ved 100 ° C i 5 min, separeret på 10% polyacrylamidgel, overført til nitrocellulosemembraner (Amersham Biosciences). Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri mælk i TBST (Tris buffer saltvand indeholdende 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur, og efterfølgende inkuberet natten over ved 4 ° C ved de passende fortyndede primære antistoffer for kanin-monoklonalt anti -human integrin β1 og MMP2 (fortyndet 1:1000; Cell Signaling Technology). Efter grundig vask med TBST-buffer blev blots derefter inkuberet med HRP-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter omfattende vask med TBST buffer blev målproteiner påvist ved forøget kemiluminescens reagenser ECL.

gelatinezymografi af MMP2 enzymaktivitet

Dette eksperiment søgte at afsløre specifikke MMP2 og MMP9 enzymaktivitet. Medierne uden serum udtaget fra det transficerede 95C og 95D celler efter 24 timer blev analyseret ved anvendelse af en gelatinezymografi assaykit (Applygen, Kina). MMP-aktivitet blev målt ved SDS-PAGE under ikke-reducerende betingelser. Gelen indeholdt 1% gelatine og 30% acrylamid. Elektroforese blev udført ved 4 ° C. Efter vask med buffer A (indeholdende 2% Triton X-100) fra kittet, blev gelen inkuberet i 37 ° C med buffer B (indeholdende den nødvendige metalion: 5 mmol /CaCl

2, 1 pmol /L ZnC

2). MMP-aktivitet blev visualiseret ved farvning med Coommasie Blue R-250.

In vivo metastase assays i nøgne mus xenograftmodel

95D og 95 ° C-celler blev transficeret med lentivirus af U6-RNAi- (Ubi ) -Luc-LV (Shanghai Genechem) til stabilt udtrykke ildflueluciferase i lunge kræftceller. De 95D-Luc og 95C-Luc celler blev transficeret med 100 nm efterligner eller 200 nM inhibitor, henholdsvis trypsiniseret, vasket to gange i 1 × PBS og resuspenderet ved en koncentration på 1-5 x 10

6 celler /ml i kold 1 × PBS. Nøgne hunmus (6-7 uger gamle) blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af ketamin (90-110 mg /kg) og xylazin (10 mg /kg) før intrakardielle injektioner og blev placeret i rygleje. Med en 25-gauge kanyle, 2-3 × 10

5-celler blev injiceret i den venstre ventrikel (volumen 0,1 ml) efter visualisering af arteriel blodgennemstrømning ind i sprøjten. Efter injektion blev musene anbragt på opvarmning bure for at komme sig efter anæstesi. De celle-injicerede dyr har været opstaldet under sterile forhold på Experimental Animal Facility af Tongji Universitet (Shanghai, Folkerepublikken Kina).

For

in vivo

metastaser assay, lungekræft metastaser blev overvåget i den levende dyr ved bioluminescerende billeddannelse (BLI) med en LB 983 in vivo imaging system (Berthold), startende 3-4 uger efter implantation. Femten minutter før

in vivo

BLI blev dyr bedøvet med 1-3% isofluran og injiceret intraperitonealt med D-luciferin (150 mg /kg i 1 × PBS). Eksperimenterne blev udført under anvendelse af 5 eller 6 mus pr gruppe og gentagen tre gange. Udviklingen af ​​knoglemetastaser blev overvåget ved røntgen radiografi i 6-8 uger efter injektion. Musene blev bedøvet, placeret på en transparent bord i udsatte og laterale positioner, udsættes for røntgenstråler ved 30 kV og 0,5 mA i 10 s i en Fixitron MX-20 radiografi System på Institut for traumatologi Ortopædi, Shanghai Academy of Traditionel kinesisk medicin.

Statistisk analyse

Kvantitative værdier blev præsenteret som gennemsnit ± SEM. Den studerendes

t

og χ

2 tests blev udført for at sammenligne de tilsvarende data. Forskelle med

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

miR-29c er nedreguleret i høj metastatiske lunge- cancerceller

i denne undersøgelse 95C og 95D cellelinier blev udvalgt, fordi de stammer fra det samme individ, og der er en dramatisk forskel i deres metastatiske adfærd. At identificere forskellen udtryk for miRNA mellem 95 ° C og 95D celler. Først blev en primær screening udføres ved hjælp af en simpel Matrigel invasion transwell assay før miRNA array. Vi fandt en signifikant differentiel udtryk for miRNA mellem 95 ° C og 95D celler ved hjælp miRNA array (Detaljer i tabel S1). For at undersøge den mulige rolle af miRNA, der hæmmer lungekræft celle metastase og potentielle kandidater målrette gener, vi fokuseret på miR-29c, fordi det er nedreguleret i høje-metastatisk 95D celler og opreguleret i lav-metastatisk 95 ° C celler. Konstateringen kan indebære MIR-29c funktion som tumormetastase lyddæmper. Dataene fra QRT-PCR bekræftede endvidere de forskellige ekspressionsniveauer af miR-29c mellem 95 ° C og 95D celler. Dette resultat er i overensstemmelse med de miRNA array-resultater. (MIR-29c viste en 3,8 fold gange højere i 95 ° C end 95D fra figur 1A).

(A) QRT-PCR af MIR-29c i 95D og 95C cellelinier. Skift blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt relativ kvantitativ analyse; **

s

0,01 (Students

t

-test). Forsøg blev gentaget mindst tre gange (n = 3). (B) MIR-29c inhiberer cellulær proliferation i 95D-celler ved MTT-assayet. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (C) MIR-29c inhibitor forøget cellulær proliferation i 95 ° C-celler ved MTT-assayet. **

p

. 0,01 (Students

t

-test, n = 3)

miR-29c undertrykker celleproliferation i 95D celler

For at bestemme om miR-29c undertrykker lungekræft celleproliferation, miR-29c efterligner (mIR-29c) og efterligner negativ kontrol (MiNC) blev transficeret ind 95D celler, mens miR-29c inhibitor (29ci) og inhibitor negativ kontrol ( IhNC) blev transficeret ind 95 ° C-celler. MTT-assays blev udført for at måle celleproliferation. Resultater (figur 1b) antyder, at MIR-29c har en hæmmende virkning på proliferation af 95D-celler. Der var ingen forskel på 24 timer i udbredelsen af ​​95D celler mellem miR-29c og MiNC grupper (

s

0,05). Der var imidlertid en væsentlig forskel mellem de to grupper efter 48 h, 72 timer og 96 h inkubation (

s

0,01). De inhibitoriske effektivitet var 37,5%, 54,4% og 40,3% (Figur. 1 B), henholdsvis. Derfor MIR-29c inhibering af 95D-celleproliferation er en tidsafhængig proces.

95 ° C celler transficeret med MIR-29c inhibitor (MIR-29ci), proliferation steg på en tidsafhængig måde. De spredning kurser mellem MIR-29ci og IhNC grupperne ikke variere (

s

0,05) ved 24 h punkt inkubation. Der var imidlertid en statistisk signifikant mellem de to grupper efter 48 h, 72 timer og 96 h inkubation med spredning satser på 15,2%, 13,7% og 10,4% (figur 1C,

s

0,01), henholdsvis. Derfor miR-29c forfremmet 95C celledeling i en tidsafhængig måde.

miR-29c hæmmer celleadhæsion til ECM in vitro

Vedhæftning til ECM er et vigtigt skridt, når kræftceller plante sig selv i fjerntliggende steder under metastaser. Matrigel indeholder basalmembranen komponenter kan simulere celleadhæsion

in vitro.

Vi benyttede sig af denne egenskab, og udført en vedhæftning assay. I 95D celler transficeret med MIR-29c efterligner (MIR-29c) og efterligner negativ kontrol (MiNC), antallet af celler, der klæber til Matrigel faldt betydeligt (

s Restaurant 0,01, figur 2 A-C ) efter mIR-29c transfektion sammenlignet med dem transfekteret med MiNC. Men i 95 ° C-celler transficeret med MIR-29c inhibitor (29ci) og inhibitor negativ kontrol (IhNC), har MIR-29c inhibitor signifikant forøget 95C adhæsion til matrigel når celler transficeret med MIR-29c inhibitor sammenlignet med dem transfekteret med IhNC (

s

0,01, figur 2 D-F). Disse resultater indikerer, at mir-29c kan reducere antallet af friktion celler i høj metastase 95D celler, mens inhiberingen af ​​mir-29c kan forøgede celleadhæsion i lav-metastatiske 95C-celler (figur 2).

( A) 95D celler transficeret med mIR-29c efterligner adhæsion til Matrigel blev målt ved at tælle som beskrevet i Materialer og Metoder. Repræsentative områder af 95D 29c og 95D MiNC (forstørrelse x 100). (B) Gennemsnitlig vedhæftning celle antal pr tilfældig felt. **

P

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (C) MIR-29c inhiberer 95D celleadhæsion (MTT-assay). **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (D) Repræsentative felter fra 95D 29ci og 95 ° C IhNC lungekræft celler (forstørrelsen × 100). (E) Gennemsnitlig vedhæftning celle antal pr tilfældig felt. **

P

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (F) Undertrykkelse af miR-29c forbedret celleadhæsion i 95 ° C-celler (MTT assay). **

s

. 0,01 (Students

t

-test, n = 3)

miR-29c hæmmer celle invasion og migration in vitro

Transwell assay er almindeligt anvendt til at måle cellulær adfærd under migration og invasion, vigtige skridt i tumormetastaser. Vi sætter en Matrigel membran eller transwell selv med en kemo-lokkemiddel til at simulere celle invasion og migration adfærd

in vitro

. I 95D celler efter miR-29c og MiNC transfektion blev en synlig signifikant forskel set med færre MIR-29c transficerede celler tælles end MiNC transfekterede celler (celle tal reduceret 104,2% i migration assay og 136% i invasionen assay,

p

0,01). Dette fund kan indikere, at opregulering af MIR-29c inhiberer celleinvasion og migration (figur 3A og B). I modsætning hertil transfektion af 95 ° C celler med MIR-29c inhibitor og IhNC viste en modsat resultat; mere miR-29c inhibitor transficerede celler passerede gennem matrigel og transwell membran (celletal steg omkring 79,7% i migration assay og 97,4% i invasionen assay,

s

0,01) sammenlignet med de 95 ° C celler transefected med IhNC (Figur 3 C og D). Disse data viser, at miR-29c påvirket celle invasion og migration adfærd

in vitro

.

(A) I en Matrigel invasion assay, miR-29c efterligner transficerede 95D celler vs MiNC transficerede celler i en 200 × lys anvendelsesområde efter krystalviolet farvning. (B) Matrigel invasion og transwell migration: 95D-celler blev talt i en lys anvendelsesområde i fire tilfældige visninger. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 4). (C) I en Matrigel invasion assay MIR-29c inhibitor transficerede 95 ° C celler vs IhNC transficerede celler i et 200 × lys anvendelsesområde efter krystalviolet farvning. (D) Matrigel invasion og transwell migration: 95 ° C-celler blev talt i en lys anvendelsesområde i fire tilfældige visninger. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 4)

miR-29c direkte retter sig mod 3′-UTR af integrin. β1 og MMP2 gen

for yderligere at udforske de mekanismer, som miR-29c undertrykker lungekræft celle invasion og metastase, vi analyserede sandsynlige nedstrøms tumor metastase-relaterede gener. Computational forudsigelse blev anvendt til at finde ud af den mest sandsynlige målgen. Vi benyttede sig af Targetscan, PicTar og MIRANDA databaser over forudsagte microRNA mål for at analysere taregets af miR-29c. 3′-UTR’er af integrin β1 (Intβ1) og MMP2 bære MIR-29c-bindingssteder. 3′-UTR af integrin β1 og MMP 2 af MIR-29c-bindingssteder har højt konservative sekvenser i pattedyr (figur 4A og D). Undersøgelserne i de formodede funktioner miR-29c i cellulær vedhæftning og invasion opfordrede os til yderligere forskning i integrin β1 og MMP2.

(A) Bevarelse målretning af 3′-UTR’er af det menneskelige int β1 af miR- 29c (understreget). Vildtype og mutant sekvenser af int β1 3′-UTR er angivet til sammenligning. (B) Dual-luciferase reporter assay for målgenet int β1 i 95D celler transficeret med miR-29c efterligner. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (C) Dual-luciferase reporter assay for målgenet int β1 i 95 ° C celler med eller uden transfektion mir-29c hæmmere. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (D) MIR-29c bindingssteder i MMP2 3’UTR region (understreget); bindingssted er stærkt bevaret i hvirveldyr, herunder mennesker. Vildtype og mutant sekvenser af MMP2 3’UTR er angivet til sammenligning. (E) Dual-luciferase reporter assay af MMP2 mRNA i 95D-celler transficeret med MIR-29c efterligner. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3). (F) Dual-luciferase reporter assay af MMP2 mRNA i 95 ° C-celler med eller uden transfektion mir-29c inhibitorer. **

s

0,01 (Students

t

-test, n = 3)

For at bestemme om integrin β1 og MMP2 undertrykkes af miR-. 29c gennem binding til deres mRNA 3′-UTR, udførte vi en dual-luciferase assay for at verificere forholdet mellem de to målgenet og mIR-29c. Vildtype og mutant integrin β1 og MMP 2-mRNA 3′-UTR blev indsat i den nedstrøms region af et luciferase reportergen fra pMIR-RAPPORT vektor, og nemlig vildtype integrin β1 3′-UTR-vektor, MMP 2 3 ‘-UTR vektor, mutant integrin β1 3′-UTR vektor og mutant MMP2 3’-UTR-vektor hhv. Vi brugte pMIR-RAPPORT Luciferase vektor som en kontrol, fordi det ikke ville blive påvirket af eventuelle miR-29c efterligner eller hæmmer, og kan også fungere som en standard kontrol for transfektion effektivitet. Derfor

Renilla

luciferase vektor (pRL-TK vektor) og ildflueluciferase vektor blev cotransficeret med efterligner eller inhibitor. I 95D celler med MIR-29c efterligner blev luciferaseaktiviteten af ​​vildtype integrin β1 og MMP2 vektor relative forhold inhiberes ca. 2,00 gange sammenlignet med kontrollen (figur 4 B og C,

s Restaurant 0,01) . Selvom mutant integrin β1 og MMP2 vektor i 95D-celler viste en lavere luciferaseaktivitet end kontrollen, var der ingen signifikant forskel (

s Restaurant 0,01) sammenlignet med celler, der ikke blev stimuleret med MIR-29c inhibitor på grund af den integrin β1 og MMP2 vektor luciferaseaktivitet, der blev inhiberet af endogen mIR-29c. Tilsvarende mutante integrin β1 og MMP2 i 95 ° C-celler viste ingen signifikant reaktion med kontrollen (

s Restaurant 0,01) . I 95 ° C-celler, sammenlignet med celle transficeret med IhNC, Western blotting resultater viste integrin β1 og MMP2 preotein ekspression blev opreguleret efter transficeret med MIR-29c inhibitor i 95C (figur 5,

s Restaurant 0,01). Disse data viser integrin β1 og MMP2 er direkte mål for miR-29.

(A) Virkninger af miR-29c på endogene integrin β1 protein.