PLoS ONE: Selektiv målretning af Tumorgenetisk kræftcellelinjer af mikrotubulus Inhibitors

abstrakt

I anticancer lægemiddelterapi, er det afgørende at dræbe disse celler med højeste tumorigene potentiale, selv når de omfatter en relativt lille del af den samlede tumorcellepopulation. Vi har anvendt den etablerede NCI /DTP 60 cellelinien vækstinhibering assay som en platform for at udforske forholdet mellem kemisk struktur og vækstinhibering i begge tumorigene og ikke-tumorigene cancercellelinier. Brug eksperimentelle målinger af “tage rate” i ektopiske implantater som en proxy for tumorigent potentiale, vi identificeret otte kemiske midler, der synes at stærkt og selektivt at hæmme væksten af ​​de mest tumorigene cellelinjer. Biokemiske assay data og struktur-aktivitet-relationer viser, at disse forbindelser virker ved at hæmme tubulin polymerisering. Men deres aktivitet over tumorigene cellelinjer er mere selektive end de andre mikrotubuli inhibitorer i klinisk anvendelse. Biokemiske forskelle i tubulin underenheder, der udgør mikrotubuli, eller forskelle i funktionen af ​​mikrotubuli i mitotiske spindel montering eller celledelingen kan være forbundet med selektiviteten af ​​disse forbindelser

Henvisning:. Abdullah NM, Rosania GR, Shedden K (2009) Selektiv målretning af Tumorgenetisk kræftcellelinjer ved mikrotubulus Inhibitors. PLoS ONE 4 (2): e4470. doi: 10,1371 /journal.pone.0004470

Redaktør: Winston Skjul, University of the Western Cape, Sydafrika

Modtaget: August 8, 2008; Accepteret: November 28, 2008; Publiceret: 13. februar 2009

Copyright: © 2009 Abdullah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. USA national Institutes of Health give P20HG003890. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

aggressivitet forskellige slags tumorceller afledt af humane patienter kan vurderes med hensyn til deres tumorigent potentiale i mus xenograftmodeller. For eksempel har tumorigent potentiale i muse-xenotransplantater nylig blevet anvendt til at definere cancer “stamceller”, som formentlig svarer til subpopulationen af ​​maligne celler, der driver dannelsen og væksten af ​​tumoren [1]. Følgelig er det blevet postuleret, at nogle kræftformer er sammensat af en heterogen samling af celler, kun et mindretal af som er i stand til at danne nye tumorer [2]. Disse celler kan beriges fra heterogene tumorcellepopulationer på grundlag af deres ekspression af celleoverflademarkører. I brysttumorer, for eksempel celler co-udtrykker høje niveauer af CD44 og epitelial antigen (ESA) og lave niveauer af CD24 er tumorfremkaldende celler [2]. Ligeledes i tyktarmen og kræft i hjernen, subpopulationer af celler, der udtrykker høje niveauer af CD133 (PROML1) indlede tumorer [3], [4]. Vigtigst efter transplantation i immunkompromitterede mus, tumor-initierende celler kan fuldt rekonstituere en tumor med heterogenitet minder om den oprindelige tumor [2] – [4]. Selvom begrebet kræft “stamcelle” er stadig kontroversiel, fra et terapeutisk synspunkt, anticancer midler rettet mod tumorigene kræftceller kan være den mest effektive til at udrydde tumorer.

lægemiddelforskning og udvikling inden for National Cancer Institute (NCI), Developmental Therapeutics Program (DTP) har udnyttet et panel af 60 humane tumorafledte cellelinjer til screening af kemoterapeutiske potentiale på mere end 75000 forbindelser [5], [6]. Dette panel af 60 cellelinjer er almindeligt kendt som “NCI60 cellelinier.” Cellelinjerne repræsenterer forskellige leukæmier, melanomer og kræft i lunge, colon, hjerne, ovarie, bryst, prostata og nyrer [5]. Bortset fra deres anvendelse i screening af narkotika, er tumorigent potentiale af disse cellelinjer blevet målt ved xenotransplanting disse celler i immunkompromitterede mus og vurdere deres evne til at danne nye tumorer [6]. Forskellige cellelinjer i NCI60 panelet vise en række tumorigene potentialer ved transplantation i immunkompromitterede mus. Den tumorigent potentiale er blevet registreret som hver cellelinje s “take-rate.”

Som en hypotese, forskelle i tumorigent potentiale blandt NIC kræft cellelinjer kan afspejle variationer i proliferativ aktivitet og tumor-initierende egenskaber faktiske kræftceller som de eksisterer i tumorer i cancerpatienter. Således kan NCI60 cellelinjer demonstrerer høj take rate være mere repræsentativ for tumor-initierende cancerceller fundet

in situ

. Her identificerer vi forbindelser fra DTP-databasen, der er mest aktive mod cellelinjer med den højeste take rate, og fortsæt til at etablere en formodet virkningsmekanisme for disse forbindelser ved at udføre struktur-aktivitet relationer undersøgelser, og sammenligne dem til standard anticancer midler, hvis virkningsmekanisme kendes. Endvidere er forskelle i tumorigent potentiale og kan reagere på disse midler vist sig at være relateret til forskelle i genekspression mellem NCI60 cellelinier med høj og lav tumorgene potentialer, samt til genekspression markører af tumorgene cancerceller.

Resultater

Identifikation af selektivt cytotoksiske forbindelser

vækst hæmmende aktivitet i DTP samling af kemiske midler, som repræsenteret ved -logGI50 kan sammenlignes med de fire kategorier af take-rate ved hjælp Pearson korrelationskoefficienter. Under anvendelse af denne fremgangsmåde blev ni forbindelser, der har korrelationskoefficient på over 0,5 i størrelsesorden identificeret ud af 34,909 testede forbindelser (figur 1). Alle ni korrelationskoefficienter var positive, hvilket indikerer, at disse midler var mere aktive ved inhibering af cellevækst i de mest tumorigene cellelinjer (figur 2). Fordi det forventede antal af forbindelser ud af 34.909, der har en korrelationskoefficient på over 0,5 i størrelsesorden tilfældigt er 0,7 med 95

percentil af to forbindelser, er det meget usandsynligt, at to eller flere af disse ni forbindelser er falske positiver.

Ingen af ​​de standard anticancer agenter i DTP-databasen overgå disse ni forbindelser i form af selektiv cytotoksisk aktivitet mod de mest tumorigene cellelinjer. Den største korrelationskoefficient observeret blandt faste anticancermidler er 0,47 for vinblastin, som er et antimitotisk middel. Faktisk antimitotiske midler er den eneste mekanistisk klasse viser konsekvent ikke ubetydelig positiv korrelation med take-sats. Trods deres positive korrelationskoefficienter, ingen af ​​de antimitotiske standard anticancermidler viser korrelationskoefficient er større end 0,5, hvilket antyder, at de ni forbindelser identificeret i vores korrelationsanalyse kan være entydigt selektiv mod de mest tumorigene cellelinjer. Flere af disse ni forbindelser udviser en bred selektivitet vindue med forskel i -logGI50 mellem tumorigene og ikke-tumorigene cellelinjer af to eller flere. Forbindelser 384.634, 385.177, 5.468.780, 361500 og 379.512 er sammenlignelige med alle de standard antimitotiske midler i forhold til deres cytotoksicitet; men deres selektivitet vindue er meget bredere (figur 3)

Hæmning af tubulin polymerisering som muligt virkningsmekanisme

Forbindelserne identificerede punkt til en større struktur-aktivitetsforhold klasse.: fire af forbindelserne identificerede dele en kerne naphthyridin struktur (se figur 1). Tre af disse forbindelser (385.177, 5.468.780, 5468781) er strukturelt beslægtede, gennem tilstedeværelsen af ​​en naphthelene gruppe ved stilling R

2. Disse strukturer adskiller sig fra hinanden kun baseret på placeringen af ​​en eller to methylgruppe på A-ringen: forbindelser 385.177 og 5.468.780 indeholder en methylgruppe på positioner R

5 og R

2, henholdsvis mens forbindelsen 5.468.781 indeholder to methylgrupper i positionerne R

5 og R

2. Den anden forbindelse (384.634), afviger fra de tre tidligere nævnte forbindelser fordi gruppen 3′-methoxy substitueret benzenring erstatter naphthalen i stilling R

2. Denne forbindelse indeholder også en methylgruppe i stilling R

5 på ring A. Tilstedeværelsen af ​​kernestrukturen fælles for alle forbindelserne i denne gruppe tyder på, at det kan spille en hjørnesten rolle i virkningsmekanismen for denne kohorte af forbindelser .

for at identificere en mulig virkningsmekanisme, de ni forbindelser blev grupperet sammen med de 168 standard anticancer midler ved hjælp af 881 centrale CACTVS fingeraftryk. Skæring dendrogram ved en Tanimoto koefficient på 0,7, fem af de ni forbindelser er grupperet med ni standard anticancermidler herunder forskellige antitubulin midler, såsom vinblastin og vincristin. Efterfølgende analyse af den videnskabelige litteratur afslørede, at mange af vores forbindelser rent faktisk hæmmer polymeriseringen af ​​tubulin

in vitro

. Forbindelse 384.634 er blevet syntetiseret og har vist sig at påvise antitublin aktivitet i et tubulinpolymerisations assay [11]. Ligeledes isosterer af forbindelsen 385.177, 5.468.780 og 5.468.781 kraftigt inhiberer tubulin polymerisering [12]. Det er højst sandsynligt, at forbindelsen 379.512 er et antitubulin agent samt, fordi en række forbindelser indeholdende 2-phenyl-quinolon ringstruktur er blevet syntetiseret og udviser tubulinpolymerisation [13] – [17]. Forbindelse 5388755 er næsten strukturelt identisk med combretastatin A-4, som er en meget potent antitubulin agent [18].

Sammenlign analyse [19] blev udført for yderligere at karakterisere virkningsmekanismen for forbindelserne. I SAMMENLIGN, er en korrelationskoefficient på 0,6 generelt taget for at angive bevis for lignende virkningsmekanismer mellem de testede og referencestoffer. Jo højere korrelationskoefficienten, jo mere sandsynligt er det, at de forbindelser deler den samme intracellulære mål [9]. Korrelationskoefficienten af ​​SAMMENLIGN beregninger til de otte mest potente forbindelser og antimitotiske standard anticancermidler afslører adskillige forbindelser udviser høje korrelationer med mikrotubuli inhibitorer colchicin, maytansin, vinblastin og vincristin (tabel 1). Ingen af ​​disse forbindelser udviser lighed med nogen af ​​de midler fra andre mekanistiske klasser såsom topoisomeraseinhibitorer, alkyleringsmidler og DNA /RNA-antimetabolitter (data ikke vist). Ingen af ​​de forbindelser udviser stærk sammenhæng med Taxol, som er et antimitotisk middel, der virker ved at stabilisere mikrotubuli.

Antitubulin aktivitet paralleller selektiv cytotoksicitet

For at identificere den rolle antitubulin aktivitet i at generere selektiv cytotoksicitet, vi identificeret tolv ekstra DTP forbindelser (figur 4), der er strukturelt relateret til nogle af de ni forbindelser vi identificeret i vores korrelationsanalyse men at manglende antitubulin aktivitet [11] – [15]. Hvis antitubulin aktivitet giver selektiv cytotoksicitet, bør disse forbindelser uden antitubulin aktivitet demonstrere nogen selektiv cytotoksicitet. Den scatterplot sammenligning af associering mellem cytotoksicitet og take-sats for disse tolv forbindelser indikerer, at ingen af ​​disse forbindelser udviser selektiv cytotoksicitet (figur 5), og de er stort set inaktive i cellevækstinhiberingen assay.

genanalyse

En række tidligere undersøgelser har identificeret CD44, CD24, og CD133 (PROML1) som værende markører for tumorgene potentielle eller stamcelle-lignende egenskaber, med CD44 og CD133 er relativt højt udtrykt i tumorgene linier, og CD24 er udtrykt ved lave niveauer. Således har vi søgt efter specifikke gener, hvis ekspression kan relateres til den selektive cytotoksiske aktivitet af forbindelserne identificeret. Til dette formål blev transskriptionel profilering data udvundet for gener, hvis udtryk på tværs af cellelinier korrelerer med tumorigent potentiale. I dette datasæt, fandt vi, at take rate er uafhængig af PROML1, CD44, og log-forhold CD44-CD24 i NCI60 cellelinier. Vi analyserede også udtryk for tyve eller så forskellige tubulin isotyper (alfa, beta og gamma) og fandt ingen sammenhæng med take rate.

Selvom kandidat tumorgenicitet markørgener PROML1, CD44, og CD44-CD24 ikke var associeret med take-rate, vi identificere gener udtrykt ved væsentligt højere niveauer i de mere tumorigene cellelinjer. På U95A arrayet platform, en transkriptionsfaktor (DBP), et integrin (ITGA6, to probesæt), og en membran skelet protein (ADD 3, to probesæt) efterfulgt dette ekspressionsmønster. Seks navngivne gener og to unavngivne gener udtrykkes til væsentligt højere niveauer i mindre tumorigene i forhold til de mere tumorgene cellelinier på U95A arrayet platform: PTGIS, JAK1, MGC5560, XPC, NRG1, og SULF1. På U133A /B platform TMEM18, ACACB, og GMCL1 var positivt associeret med tumorigent potentiale, sammen med to unnanotated probesets (229930_at og 230312_at). Ingen negative associationer, der opfylder vores udvælgelseskriterier blev identificeret på U133A /B-array-platform. Den funktionelle betydning af formodede stamceller markørgener i forhold til tumorigenicitet eller øget følsomhed over for mikrotubuli hæmmere er ikke klart.

Diskussion

Ved data mining DTP arkivet, er vi i stand til at identificere forbindelser, der er fortrinsvis toksisk mod den mest tumorigene af NCI60 cellelinjer, baseret på take rate af cellelinierne i en mus xenograft model. Vi fastslog også, at aktiviteten af ​​disse forbindelser ikke var korreleret med ekspressionen af ​​celleoverflade stamcellemarkører rapporteret i litteraturen. Alligevel tumorigent potentiale er den vigtigste funktionelle forhold mellem de mest aggressive tumorceller og

in vitro

model til lægemiddelscreening. Derfor identificerede anticancer midler baseret på deres aktivitet over de mest tumorigene cellelinjer kan betragtes som kandidat anticancer midler, der er specifikt rettet mod subpopulationer af kræftceller, der drev væksten af ​​tumorer.

En af disse stoffer ( 384.634) har vist sig at inhibere mikrotubulus polymerisation. Ligeledes har isosterer af tre af vores midler (385.177, 5.468.780, 5.468.781) også vist sig at hæmme mikrotubulus-polymerisation, hvilket antyder en enkelt virkningsmekanisme. Interessant, Forbindelse 5388755 er strukturelt beslægtet med den potente antitubulin agent combretastatin A-4. Det er også muligt at forbindelse 379512 virker ved at hæmme tubulinpolymerisation fordi flere forskellige midler indeholdende quinolon ringstruktur har vist antitubulin aktivitet. SAMMENLIGN analyse bekræfter lighederne mellem de anticancer midler identificeret her og forskellige forskellige mikrotubuli hæmmere. Med undtagelse af forbindelsen 319.428, alle vores forbindelser viser stærk lighed med colchicin, maytansin, vinblastin og vincristin. Ingen af ​​vores forbindelser viser signifikant sammenhæng til Taxol, som virker ved at stabilisere mikrotubuli.

Fra vores analyse, antitubulin aktivitet sandsynligvis være ansvarlig for selektiv cytotoksicitet mod tumorigene cellelinjer. En udvalgt række af strukturelt beslægtede forbindelser uden antitubulin aktivitet blev analyseret for deres mønster af cytotoksicitet mod NCI60 cellelinjer. Ingen af ​​disse forbindelser demonstrerede selektiv cytotoksicitet. Faktisk er de fleste af disse forbindelser var inaktive. Sammen med deres antitubulin aktivitet, selektiviteten af ​​vores forbindelser mod stærkt tumorigene cellelinjer tyder på, at mikrotubuli af tumorigene og ikke-tumorigene cellelinjer kan variere. Interessant nok blev der ikke observeret nogen forskel i tubulin genekspression niveau mellem højt tumorigene og ikke-tumorigene cellelinjer. Det er plausibelt, at observerede selektiv cytotoksicitet ikke skyldes forskel i tubulin genekspression, men snarere et resultat af forskelle i post-translationelle modifikationer (PTMS) [20]. For nylig er forskellige eksperimentelle resultater understøttede den opfattelse, at tubulin PTMS fører til funktionel diversitet af mikrotubuli. Mange tubulin PTMS er blevet identificeret, herunder detrysosination, glutamylation, glycylation, acetylering phosphorylering og palmitoylering [20] – [22]. Forskelle i tubulin isotype-ekspression og PTMS har været forbundet med celledifferentiering og udviklingsmæssige overgange [23] – [25]. Fordi mikrotubuli er nøglen til mitotisk spindel samling og celledeling, kan forskelle i mitosespindelen struktur og funktion mellem tumorigene og ikke-tumorigene cellelinjer være forbundet med selektiviteten af ​​disse forbindelser.

Som konklusion har vi identificeret en familie af mikrotubuli inhibitorer, som er for det meste giftige mod tumorigene cellelinjer. Etablerede cancer cellelinjer demonstrerer høj tumorigenicitet i xenograftmodeller kan fange nogle egenskaber for kræft celle subpopulationer, der er ansvarlig for at iværksætte og sprede tumorer. Derfor foreslår vi, at denne familie af mikrotubuli-hæmmere, eller beslægtede forbindelser med lignende selektivitet egenskaber, bør betragtes som prime kandidater til yderligere evaluering som anticancer midler.

Materialer og metoder

Primære data

hæmning data sammensatte vækst blev opnået fra NCI 60 cellelinje antitumor skærmen. Den væksthæmmende aktivitet af hver forbindelse svarer til den molære lægemiddelkoncentration nødvendig for at forårsage 50% vækstinhibering (GI50). De fleste analyser anvender en maksimal koncentration på 0,0001 M (cellelinien skærm og GI50 parameter er beskrevet i [7]). For microarray genekspression analyse, vi brugte fem offentligt tilgængelige datasæt for NCI60 cellelinjer: tredobbeltforsøg hjælp af Affymetrix U95A platform fra Novartis, et enkelt U95A datasæt fra GeneLogic, og et enkelt Affymetrix U133A /B datasæt forudsat af GeneLogic. De GI50 data blev indhentet fra https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/cancer_data.html og alle genekspression data blev indhentet fra https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html . Alle genekspression og GI50 assay data analyseres på log-skala.

Rating af tumorigent potentiale

NCI60 cellelinjer er blevet eksperimentelt evalueret for tumorigent potentiale ved transplantation af cellelinier i immun- kompromitterede mus. Forsøgene og resultaterne er tilvejebragt i Anticancer Drug Development Guide [6]. For forskellige cellelinjer, er disse data gives enten kvantitativt eller kvalitativt, eller undertiden som intervaller, som “take rate” eller andel af forsøg implantater, der gav en tumor. Vi konverterede de take rate data i fire bestilt kategorier til analyse: 0 for ingen vækst, en for 1-60% take rate, 2 for 60-80% take rate og 3 for 80-100% take sats. Cellelinier, der overlapper to kategorier der vurderes ved den nedre kategori. For eksempel er en cellelinie med 70-90% take rate bedømt som kategori 3. Disse ratings af tumorigent potentiale er betegnet “TP”.

Compound valg

Forbindelser aktiv mod høj take sats cellelinjer blev identificeret ved sammenligning af væksten hæmning måling (-log GI50) til fire niveauer bedømmelse af take-rate, hjælp Pearson korrelation. Tærsklerne for 0,4 og 0,5, blev anvendt til at definere moderate og stærke korrelationer. Statistisk signifikans blev vurderet ved at beregne det forventede antal forbindelser ud af alle testede forbindelser, der kunne forventes at have en korrelation overskrider en vis grænse tilfældigt (baseret på anvendelsen Fishers Z-transformation og anvendelse af en standard normal henvisning distribution).

genanalyse

Forbindelser aktivt mod cellelinier, som udtrykker relativt høje niveauer af PROML1 eller CD44-CD24, blev identificeret under anvendelse af Pearson korrelationskoefficienter mellem -log

10GI50 og enten log skala ekspression af PROML1, eller forskellen mellem log skala ekspressionsniveauer af CD44 og CD24. PROML1 er repræsenteret ved en unik probeset på begge platforme, er CD44 repræsenteret af to U95A probesets og ved seks U133A /B probesets, og CD24 er repræsenteret ved én U95A probeset og ved seks U133A /B probesets. Når flere probesets er til rådighed, er alle analyseret separat, og forskelle mellem alle par af CD44 /CD24 probesets analyseres separat. For alle analyser, forbindelser, for hvilke færre end 50 cellelinjer havde en GI50 værdi eller som ikke havde nogen variation i deres GI50-værdier, blev udelukket fra vores analyse.

Standard anticancermidler

Et sæt af 168 forbindelser med anticancer-aktivitet blev samlet, og en undergruppe af 121 af dem blev kommenteret efter deres formodede virkningsmekanisme [8] – [10]. De data, vi brugte blev indhentet fra https://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism_list.html, og omfatter følgende virkningsmekanisme klasser og antal unikke strukturer: alkylerende midler (35), antimitotiske midler (13), topoisomerase 1-inhibitorer (24), topoisomerase II inhibitorer (15), DNA antimetabolitter (16), og RNA /DNA-antimetabolitter (18).

kemiske struktur sammenligninger

alle forbindelser diskuteret her er en del af pubchem, og alle rapporterede strukturelle sammenligninger er baseret på Tanimoto koefficienter ved hjælp af 881 centrale CACTVS fingeraftryk. Beregninger af Tanimoto koefficienter og hierarkisk klyngedannelse af kemiske strukturer, der bygger på Tanimoto koefficienter blev udført ved hjælp af NCBI portal til pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Vi konverterede alle sammensatte id’er fra DTP s NSC id til pubchem s CID id for strukturel analyse.

SAMMENLIGN analyse

SAMMENLIGN beregninger for alle de potente forbindelser mod standard anticancer midler fra forskellige mekanistiske klasser udføres . Pearson korrelationskoefficienter svarende til høj koncentration af 0,0001 M er rapporteret for størstedelen af ​​forbindelserne. For forbindelser, der er testet med en alternativ høj koncentration, er Pearson korrelationskoefficienter opnået fra par med den nærmeste høj koncentration.

Selektivitet vindue

selektivitet Vinduet blev beregnet ved at tage forskellen mellem det gennemsnit -logGI50 af de mest tumorigene cellelinier (take-rate kategori 3) og de mindst tumorigene cellelinjer (take-rate kategori 0).