PLoS ONE: fibroblastvækstfaktor receptorer-1 og -3 Play Tydelige Roller i forordningen for blærekræft Vækst og metastase: Konsekvenser for Terapeutisk Targeting

Abstrakt

fibroblastvækstfaktor receptorer (FGFR’er) aktiveres ved mutation og overudtrykt i blære kræftformer (BCs), og FGFR-hæmmere er i øjeblikket ved at blive evalueret i kliniske forsøg i BC patienter. Men BC celler vise markant heterogenitet i deres svar til FGFR hæmmere, og de biologiske mekanismer bag denne heterogenitet er ikke veldefinerede. Her anvendte vi en hidtil ukendt inhibitor af FGFR’er 1-3 og RNAi at bestemme virkningerne af inhibering FGFR1 eller FGFR3 i et panel af humane BC cellelinier. Vi observerede, at FGFR1 blev udtrykt i BC celler, der også udtrykte “mesenkymale” markører ZEB1 og vimentin, mens FGFR3 udtryk var begrænset til E-cadherin- og P63-positive “epitelial” delmængde. Følsomhed over for de vækstinhiberende virkninger af bgj-398 blev også begrænset til de “epitel” BC celler og det korreleret direkte med FGFR3 mRNA-niveauer, men ikke med tilstedeværelsen af ​​aktiverende FGFR3 mutationer. I modsætning hertil bgj-398 ikke stærkt inhibere proliferation men gjorde blok invasion i “mesenchymal” BC celler in vitro. Tilsvarende havde bgj-398 ikke inhiberer primær tumorvækst, men blokerede produktionen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs) og dannelsen af ​​lymfeknude og fjerne metastaser i mus, som bærer orthotopisk implanteret “mesenchymal” UM-UC3 celler. Sammen vores data viser, at FGFR1 og FGFR3 har stort set ikke-overlappende roller i reguleringen invasion /metastase og spredning i særskilte “mesenchymal” og “epitel” delmængder af humane BC celler. Resultaterne tyder på, at tumoren EMT fænotype vil være en vigtig faktor for de biologiske virkninger af FGFR hæmmere hos patienter

Henvisning:. Cheng T, Roth B, Choi W, Sort PC, Dinney C, McConkey DJ (2013 ) fibroblast vækstfaktorreceptorer-1 og -3 Afspil Tydelige Roller i forordningen for blærekræft vækst og metastase: Konsekvenser for Therapeutic Målretning. PLoS ONE 8 (2): e57284. doi: 10,1371 /journal.pone.0057284

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: 25 oktober, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Publiceret: 26 feb 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af MD Anderson Blære SPORE (P50 CA91846), The Baker Foundation, og MD Anderson CCSG (P30 016.672). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret ikke konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft (BC) er den femte mest almindelige kræftform i de vestlige lande. Blære kræft kan opdeles i to store undergrupper, der besidder distinkt patologisk, kliniske og molekylære karakteristika [1], [2]. De fleste BCs (70% -80%) er lav kvalitet, non-muscle invasive papillær ( “overfladiske”) tumorer (NMIBCs), der sjældent fremskridt, så patienter med denne form for kræft har en meget god prognose. På den anden side, patienter med muskel-invasiv blære kræft (MIBCs) har en langt dårligere prognose ( 50% 5-års overlevelse) [1], [2]. MIBCs ofte udvikle sig til at blive metastatisk, og patienter med metastatisk sygdom har en trist 5-års overlevelse på mindre end 5%. Derfor identificere de molekylære mekanismer, der er involveret i BC invasion og metastase og identificere terapeutiske strategier, der er målrettet disse processer er meget høje prioriteter i igangværende forskning.

fibroblastvækstfaktor receptorer (FGFR’er) er meget attraktiv kandidat mål i begge delmængder af BCs [3]. Mindst to tredjedele af NMIBCs indeholder aktivering FGFR3 mutationer, der resulterer i ligand-uafhængig receptordimerisering og konstitutive nedstrøms signaltransduktion [4], [5], [6], [7], og in vitro-undersøgelser har vist, at FGFR hæmmere blokerer spredning i normale urothelial celler, som overudtrykker disse receptorer [8], [9]. Selvom hyppigheden af ​​aktivering FGFR3 mutationer i MIBCs er meget lavere ( 25%), mange af dem udtrykker høje niveauer af FGFR3 og andre FGFR’er [3], [10], [11]. Ud over at fremme spredning, er FGFR’er været impliceret i reguleringen af ​​epitelial-til-mesenkymale overgang (EMT), invasion, og forankringsuafhængig vækst i BC celler [11].

bgj-398 er en selektiv inhibitor af FGFR’er 1, 2, og 3, der blev syntetiseret under anvendelse af en hidtil ukendt kemisk fremgangsmåde [12]. Den udviser IC

50’erne på ca. 5 nM mod vildtype-FGFR’er og de mest almindelige mutantform af FGFR3 som udtrykkes i BCs (S249C) [12]. En indledende karakterisering af forbindelsens væksthæmmende effekter i et panel på 8 humane BC cellelinjer afslørede markant heterogenitet i besvarelser, hvor den vises IC

50 s af 5-30 nM i halvdelen af ​​cellelinjer og IC

50 s af over 1 um i den anden halvdel [12]. Den observerede heterogenitet er konsistent med resultater opnået under anvendelse af en særskilt kemisk inhibitor [13], men den molekylære basis for denne heterogenitet er stadig uklar. Vi indledte derfor den foreliggende undersøgelse for at få en bedre forståelse af virkningerne af FGFR inhibering i BC-celler, med det mål at identificere biologiske mekanismer og biomarkører, der kunne bruges til fremadrettet identificere FGFR-afhængige tumorer. Vores resultater viser, distinkte, EMT-relaterede roller for FGFR3 og FGFR1 i kørsel spredning og invasion, som har stor betydning for udviklingen af ​​FGFR inhibitor-baserede terapier i patienter.

Materialer og metoder

Kemi og reagenser

bgj-398 blev generøst tilvejebragt af Novartis. Til in vitro-undersøgelser blev bgj-398 rekonstitueret i DMSO ved en koncentration af stamopløsning på 10 mmol /L og opbevaret ved -20 ° C. Den bgj-398 bestand blev fortyndet i medium umiddelbart før anvendelse, således at koncentrationen af ​​DMSO aldrig oversteg 0,1%. For in vivo undersøgelser blev bgj-398 opløst i 10% Tween-80.

tumorcellelinier og dyrkningsbetingelser

Cellelinjer blev opnået fra University of Texas MD Anderson Cancer Center Blære SPORE tissue Bank, og deres identitet blev bekræftet ved DNA-fingeraftryk under anvendelse af AmpFlSTR® Identifiler® Amplification (Applied Biosystems) eller AmpFlSTR® Profiler® PCR-amplifikation (Applied Biosystems) protokoller. Alle cellelinjer blev opretholdt som monolag i modificeret Eagles MEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, vitaminer, natriumpyruvat, L-glutamin, penicillin, streptomycin og ikke-essentielle aminosyrer ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator .

Dyr

Female atymiske nøgne mus (NCR-nu) blev købt fra National Cancer Institute. Musene blev opstaldet under specifikke patogenfrie forhold i Animal Core Facility på The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center. Anlægget har modtaget godkendelse fra American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care og i overensstemmelse med gældende regler og standarder for det amerikanske Department of Health og Human Services, USA Department of Agriculture, og NIH. Musene anvendt i disse eksperimenter var 6 til 8 uger gamle.

FGFR3 mutation Analyser

DNA blev isoleret fra BC cellelinjer under anvendelse af et genomisk DNA-ekstraktion kittet (Qiagen). PCR blev udført til amplifikation exonerne 7 og 10 ved anvendelse af AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems) og primerne 5′-CGGCAGTGGCGGTGGTG- GTG-3 ‘(sense) og 5′-AGCACCGCCGTCTGGTT GGC-3′ (antisense) for exon 7 (23 ) og 5’-CCTCAACGCCCATGTCTTT-3 ‘(sense) og 5′-AGGCAGCTCAGAACCTGGTA-3’ (antisense) for exon 10 (indkøbt fra Sigma Genosys). Følgende cykling variabler blev anvendt: 95 ° C i 10 minutter, derefter 35 cykler ved 95 ° C i 30 s, 65 ° C (exon 7) eller 58 ° C (exon 10) i 30 s og 72 ° C i 30 s, efterfulgt af en endelig inkubering ved 72 ° C i 10 min (23). Ikke-inkorporerede primere og deoxynucleotider blev fjernet under anvendelse af reje-alkalisk phosphatase og exonuklease I (U.S. Biochemical). Produkter blev analyseret af Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), og dataene blev analyseret med Sequencing Analysis 3.0 software (Applied Biosystems).

RNAi-medieret Knockdown af FGFR3, FGFR1 eller bFGF

UM-UC14 og RT4 blev transficeret med små interfererende RNA’er (siRNA’er) målretning FGFR3 og FGFR1 hjælp Oligofectamine (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Målrettede oligonukleotider (sekvens) og en ikke-targeting kontrol blev indkøbt fra Ambion. Totalt RNA blev opsamlet 48 timer efter transfektion og analyseret ved RT-PCR for at bekræfte target knockdown. Parallelt hermed blev siRNA transficerede celler høstet ved 48 timer og analyseret ved anvendelse af celleproliferation og cellecyklus assays beskrevet nedenfor. UM-UC3 og UM-UC13 blev transduceret med lentivirale korte hårnål RNA (shRNAs) (Open Biosystems). Celler blev kontinuerligt dyrket i 5~7 dage i 10% MEM indeholdende puromycin. Totalt RNA blev opsamlet efter selektion og analyseret ved RT-PCR for at bekræfte target knockdown. Stabile Knockdown celler blev holdt i puromycin og anvendes i MTT og Boyden kammer invasion assays beskrevet nedenfor.

Immunoblotting Analyser

Celler blev høstet ved -75% til 85% konfluens og lyseret. Proteinkoncentrationer blev målt under anvendelse af Bradford-assayet (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lysater blev kogt i prøvebuffer (62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 10% (vægt /vol) glycerol, 100 mmol /l DTT, 2,3% SDS, 0,002% bromphenolblåt) i 5 minutter og afkølet på is i 5 minutter. Prøver blev separeret på 8% eller 12% SDS-PAGE geler ved 110 V i elektroforese-buffer (25 mmol /L Tris-HCI (pH 8,3), 192 mmol /l glycin, 0,1% SDS) og derefter elektroforetisk overført til methanol-befugtet polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner i transfer-buffer (25 mmol /L Tris-HCI, 192 mmol /l glycin, 20% methanol) i 1 time ved 100 mV. Membranerne blev inkuberet i blokeringsbuffer (TBS: 10 mmol /l Tris-HCI (pH 8,0), 150 mmol /l NaCl, 5% fedtfri mælk) i 1 time ved stuetemperatur under omrystning og derefter skyllet en gang kortvarigt med TBS-T (TBS indeholdende 0,1% Tween-20). Membranerne blev inkuberet med primære antistoffer fortyndet 1:1000 i blokerende buffer natten over, vasket og derefter inkuberet med sekundære antistoffer (anti-mus eller anti-kanin immunoglobulin, peberrodsperoxidase-koblet F (ab) 2-fragment fra muse) fortyndet 1: 8.000 i blokeringsbuffer i 1 time ved stuetemperatur under omrystning. Immunreaktive proteiner blev påvist ved anvendelse af forstærket kemiluminescens (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ifølge producentens instruktioner.

genekspressionsprofilering

genekspressionsprofilering blev udført på et panel af 30 humane BC cellelinier ved hjælp af Illumina platformen. For hver cellelinje, blev mRNA genereret fra en enkelt log-fase-kultur. RNA renhed og integritet blev målt under anvendelse af et NanoDrop ND-1000 og en Agilent Bioanalyzer, og kun høj kvalitet RNA blev anvendt til cRNA amplifikation. Biotin-mærket cRNA blev fremstillet under anvendelse af Illumina RNA-amplifikation kit (Ambion, Inc, Austin, TX), og amplificeret cRNA blev hybridiseret til Illumina HT12 V4 chips (Illumina, Inc., San Diego, CA). Efter de blev vasket, blev objektglassene scannet med iScan (Illumina, Inc.). Signalintensiteter blev kvantificeret med GenomeStudio (Illumina, Inc.), og fraktil normalisering blev anvendt til at normalisere dataene. BRB ArrayTools version 4.2 er udviklet af National Cancer Institute [14] blev anvendt til at analysere dataene. At observere ekspressionsmønstre for differentielt udtrykte gener, specifik genekspression værdier, justeret til en middelværdi på nul, blev anvendt til klyngedannelse med Cluster og TreeView [15].

MTT-assays Salg

Celler ( 5 × 10

3) blev udpladet i plader med 96 brønde og fik lov til at klæbe i 24 timer, før de blev inkuberet med eller uden stigende koncentrationer af bgj-398 i 48 timer eller 5 dage. MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) assays blev anvendt til at måle de relative celletal baseret på omdannelse af MTT til formazan i levedygtige celler. Halvtreds pi MTT opløst i PBS (50 ug /ml) blev tilsat til hver brønd og pladerne blev inkuberet i 3 timer. Mediet blev derefter fjernet og 100 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at lysere cellerne og solubilisere formazan. En standard mikropladelæser blev anvendt til bestemmelse af absorbansen (600 nm). Hvert eksperimentelt datapunkt repræsenterer gennemsnitsværdier opnået fra seks replikater og hvert forsøg blev udført mindst to gange.

Real-time revers transkriptase PCR Analyser

Celler blev høstet ved 75% til 85% sammenløb og total RNA blev isoleret ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion, Life Science, CA). FGFR’er og andre gener af interesse blev analyseret ved Taqman-baseret real-time PCR (ABI PRISM 7500; Applied Biosystems). Den sammenlignende CT metode blev anvendt til at bestemme relative genekspression for hvert mål-gen; den cyclophilin A-genet blev anvendt som intern kontrol til normaliseret mængden af ​​amplificerbare RNA. Taqman primere blev købt fra fremstillingen (Applied Biosystem, CA) som følger: E-cadherin; Hs00170423_m1, TP63; Hs00978343_m1, ZEB1; Hs00232783_m1, vimentin; Hs00185584_m1, FGFR1; Hs00915142_m1, FGFR2; Hs01552926_m1, FGFR3; Hs00179829_m1, FGFR4; Hs01106908_m1, bFGF; Hs00266645_m.

Cell Cycle Analyser Salg

Celler blev udpladet i 6-brønds plader og opretholdt i 10% FBS MEM i 24 timer. Cellerne blev derefter udsat for forskellige koncentrationer af bgj-398 i 48 timer eller dyrkes endnu 24 timer (nå -75% til 85% sammenflydning) at analysere virkningerne af FGFR3 eller FGFR1 knockdown. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og pelleteret ved centrifugering. Pellets blev derefter resuspenderet i PBS indeholdende 50 ug /ml propidiumiodid, 0,1% Triton X-100 og 0,1% natriumcitrat. Propidiumiodid fluorescens blev målt ved fluorescens-aktiveret celle sortering (FL-3 kanal, Becton Dickinson, Mountain View, CA) ved hjælp af instrumentets cyklus analyse software.

Boyden Chamber Invasion assays

Invasion kamre indeholdende Matrigelcoatede polyethylenterephthalat membraner med 8 um porer blev indkøbt fra BD Science i en 24-brønds pladeformat. Celler (2,5 x 10

5) blev frigjort fra vævskulturkolber ved hjælp EDTA (1 mmol /l), centrifugeret, suspenderet i et serumfrit medium og anbringes i de øvre rum i invasion kamre. Tredive procent føtalt bovint serum-medium blev anbragt i de nedre rum som en kemotiltrækkende og invasion assays blev udført i 48 timer. Hver cellelinje blev udpladet in triplo. Til undersøgelse celleinvasion efter eksponering for bgj-398 celler, som ikke havde invaderet blev fjernet, og cellerne på den nedre overflade af filteret blev farvet med Diff-Quick (American Scientific Products, McGaw Park, IL). Invasiv aktivitet blev målt ved at tælle celler, der var migreret til den nedre side af filteret. At evaluere invasion efter silencing FGFR1 eller bFGF blev membranerne fjernet efter inkubation i 48 timer ved 37 ° C og farves i propidiumiodid (Sigma-Aldrich) uden at fjerne celler fra de øvre overflader af membranerne. Filtrene blev monteret på objektglas og analyseret ved konfokal mikroskopi ved 100 ganges forstørrelse. Planerne af fokus blev indstillet, således at celler, der ikke havde invaderet kunne skelnes fra den invaderede celler og talt i 8 uafhængige felter. Invasiv aktivitet blev målt ved at beregne forholdet af invaderede til noninvaded celler.

Archorage Independent Growth Assay

UM-UC3 og UM-UC13 vildtype eller bFGF /FGFR1 lyddæmpede celler blev udpladet med 1 × 10

4 celler per brønd i 6-brønds-plader suppleret med 10% FBS MEM indeholdende 0,6% agar. Celler lodes vokse i 2 uger. Billeder er erhvervet ved hjælp af et Olympus IX omvendt-fasekontrastmikroskop. De samlede antal kolonier pr tilfældig visning (100 ×), og den gennemsnitlige diameter af kolonier pr tilfældig visning (100 ×) blev bestemt ved hjælp af en SliderBook billedanalysator.

ortotopisk xenograft Eksperimenter

Den menneskelige BC cellelinie UM-UC-3 blev transduceret med en lentiviral vektor, der koder luciferase (luc) og rødt fluorescerende protein (RFP; mCherry) som tidligere beskrevet [16]. Efter stabil transduktion med luc-RFP reporter blev celler sorteret efter fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) under anvendelse af en tilstrømning High-Speed ​​sorteringsenhed (BD Biosciences). Luciferaseaktivitet blev kvantificeret in vitro under anvendelse D-luciferin (150 ug /ml), og IVIS bioluminescens systemet (Xenogen Co.). At producere tumorer i nøgne mus, blev subkonfluente kulturer af mærket UM-UC3 løftes med trypsin, blandet med 10% FBS MEM, centrifugeret ved 1.200 rpm i 5 min, vasket i PBS og resuspenderet i HBSS. Celler blev derefter injiceret orthotopisk i blærevæggen ved en koncentration på 5 × 10

5/50 pi bruger lavere laparotomi. Mus med metastaser blev aflivet 5 til 8 uger efter tumorcelle-injektion blev lymfeknude og fjerne metastaser udskåret, skåret i små stykker med skalpeller, udsat for 1% trypsin i 20 minutter, centrifugeret (1.200 rpm i 5 min), og dyrket i 10% suppleret MEM. Efter FACS-sortering, de genvundne celler blev subconfluently dyrket og injiceret i en koncentration på 2 × 10

5/50 pi HBSS som beskrevet ovenfor. Således blev tumorcelle genbrug udført tre gange for at vælge et stærkt metastatisk UM-UC3 subpopulation som udvikler metastaser i -75% af musene. Til vores terapi eksperiment, vi injiceret 4

th cyklus af genanvendt UM-UC3 i en koncentration på 2 × 10

5/50 uL. Mus med detekterbar tumorvækst på tidspunktet for den første billeddannelse (5 dage efter injektion) blev randomiseret i to grupper (n = 7 /gruppe).

In vivo Bioluminescens Imaging

Bioluminescens billeddannelse var udført på en IVIS 100 imaging system med Living Billede software (Xenogen) som beskrevet andetsteds [16]. Kort fortalt blev dyrene bedøvet før billeddannelse med en 2,5% isofluran /luftblandingen og injiceret s.c. med 15 mg /ml luciferin kaliumsalt i PBS ved en dosis på 150 mg /kg legemsvægt. En digital grå-skala dyr billede blev taget, og en pseudocolored billede blev overlejret repræsenterer den rumlige fordeling af detekterede fotoner nye fra aktiv luciferase. Signal intensitet blev kvantificeret som summen af ​​alle registrerede fotoner inden for området af interesse per sekund, separat tælle hver primær tumor og hver metastatisk websted.

Indsamling af primære tumorer og Cirkulerende tumorceller (CTCs)

Fyrre dage efter injektion, når dyrene i kontrolgruppen blev døende, blev musene bedøvet med isofluran, som beskrevet ovenfor. At måle antallet af CTCs, den maksimale mængde blod (600-1200 pi) blev opsamlet ved hjertepunktur ved anvendelse af 1 ml sprøjte, 22 gauge nål, og opsamlingsrør heparin-belagt som tidligere [17] beskrevne. Mus blev derefter aflivet med carbonmonoxid. Tumorer blev udskåret, og prøver blev enten fikseret i formalin og indlejret i paraffin, indlejret i OCT (Miles, Inc.), eller frosset hurtigt i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C for RNA og protein ekstraktion. For yderligere behandling af blod, blev røde blodlegemer lyseret to gange i 5 minutter med 1 ml ACK-lysepuffer (Invitrogen), og centrifugeret i 5 min ved 1200 rpm i Eppendorf-rør. Pillen blev endelig lyseret og behandles yderligere for total RNA isolering ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation kit (Ambion, Life Science). For Real-time PCR-analyse, PCR-teknologi (Step One, Applied Biosystems) blev anvendt sammen med TaqMan® genekspression assays (Applied Biosystems). Absolut kvantificering blev anvendt til dannelse tærskelcyklus (CT) værdier for human specifik HLA-C-primer (Hs00740298_g1) for hver prøve. RT-PCR-analyse af blodprøverne (i triplikater) blev kørt sammen med standard isolater (0, 2, 20, 200, 2000 og 20.000 UM-UC3 celler i 100 pi muse blod). CT-værdier af parametrene blev brugt til at skabe en standardkurve for UM-UC3 CTC, og antallet af CTCs af hver blodprøve blev beregnet i overensstemmelse hermed.

Resultater

Forholdet mellem E-cadherin og bFGF /FGFR ekspression i UC Celler

Vi analyserede ekspressionen af ​​de 4 FGFR’er og den dominerende cancerassocieret ligand (FGF-2 /basisk FGF) på mRNA-niveauet i et panel af 30 UC-cellelinier ved hele genom udtryk profilering (Illumina platform). Ekspression af FGFR3 korrelerede direkte med ekspression af P63 [18], [19] og E-cadherin [20] (fig. 1A), hvilket indikerer, at FGFR3 er udtrykt ved “epitel” delmængde af BC-celler. Omvendt ekspressionen af ​​FGFR1 korrelerede mere direkte med “mesenkymale” markør vimentin (Fig. 1A). Vi anvendte kvantitativ real-time reverse transkriptase PCR (RT-PCR) for mere nøjagtigt at definere mønstre af ekspression af “epiteliale” og “mesenchymal” markører over panel af cellelinier. Resultaterne er vist i figur 1B, hvor vi organiseret BC cellelinier i alle panelerne efter deres relative ekspression af den kanoniske “epitel” markør E-cadherin (fig. 1B, øvre venstre panel) [20]. Ekspressionen af ​​E-cadherin korrelerede direkte med ekspression af P63 og omvendt med ekspression af ZEB1 og vimentin, hvilket viser, at de “epitel” og “mesenchymale” markører udtrykkes i en stort set ikke-overlappende måde i BC linjer (fig. 1B) . Kun to af de cellelinier (1A6 og UM-UC18) co-udtrykte “epitel” og “mesenchymale” markører (fig. 1B).

A. Korrelation af FGFR1 og FGFR3 med kanoniske EMT markører. mRNA-niveauer blev målt under anvendelse hele genomet mRNA-ekspression profilering (Illumina platform). Varmen kort afbilder ekspressionen af ​​FGFR1, FGFR3, FGF2 (bFGF), P63 (TP63), E-cadherin (CDH1), Slug (SNAI2), og vimentin. B. Kvantitativ analyse af EMT markør ekspression. Relative niveauer af “epitel” markører E-cadherin (CDH1) og P63, og “mesenkymale ‘markører ZEB1 og vimentin blev målt ved kvantitativ realtids-RT-PCR.

Vi derefter målt ekspression af FGFR’er 1-4 og FGF-2 ved kvantitativ RT-PCR (fig. 2A). Bekræftelse af genekspression profilering resultater blev FGFR1 udtryk primært af celler i “mesenkymale” delmængde (UM-UC3, UM-UC13, T24, BV og UC12) (fig. 2A øverst til venstre), mens FGFR3 udtryk blev koncentreret inden for ” epitel “celler, med RT4 der har den højeste udtryk efterfulgt af UM-UC14, SW780 og RT112 (fig. 2A, øverst til højre). FGFR2 syntes også at være noget beriget i “epitel” og FGFR4 i “mesenchymal” celler, henholdsvis, men deres ekspressionsniveauer var meget lavere end niveauerne af FGFR3 eller FGFR1 (gennemsnit af 36 cyklusser versus 30 cykler af PCR), i overensstemmelse med tidligere resultater [10]. Endelig de “mesenchymal” celler udtrykte højere niveauer af FGF2 (bFGF) end gjorde de “epiteliale” celler (fig. 2A). Vi bekræftede, at FGFR3 ekspression blev beriget i “epitel” og FGFR1 og bFGF-ekspression blev beriget i “mesenchymal” cellelinjer på proteinniveauet ved immunoblotting (figur S1). Brug parametrisk korrelation analyser, vi bekræftet, at FGFR3 udtryk korrelerede stærkt og direkte med udtryk for E-cadherin (Spearman r = 0,8155, s 0,0001, figur 2B.), Og omvendt med udtryk af “mesenkymale” markører (Fig S2.). Omvendt ekspression af FGFR1 og bFGF kraftigt og direkte korreleret med ekspression af ZEB1 (Spearman r = 0,799, p = 0,0001 for FGFR1 og r = 0,6198, p = 0,008 for bFGF) (fig. 2B). Desuden bFGF og FGFR1 ekspression korrelerede direkte med hinanden som forventet (fig. 2B). Vi undersøgte dernæst, om de observerede forskelle i mRNA-ekspression oversat til differentiel ekspression på proteinniveauet i en undergruppe af de cellelinier ved immunblotting. Vi fandt, at FGFR3 men ikke FGFR1 blev udtrykt i epitel UM-UC14, RT4 og RT112 celler, hvorimod FGFR1 men ikke FGFR3 blev udtrykt i mesenkymale UM-UC3, UM-UC12 og UM-UC13. FGF-2 blev udtrykt i alle 6 cellelinjer, men de mesenkymale celler udtrykte mere FGF-2 end epitel “celler gjorde. Tilsammen udgør disse data understøtter ideen om, at FGFR3 og bFGF /FGFR1 sandsynligvis fungere i ikke-overlappende epitel og mesenkymale delmængder af BC celler.

A. Ekspression af FGFR’er 1-4 og bFGF i forhold til E-cadherin ekspression. De relative mRNA-niveauer blev målt ved kvantitativ realtids-RT-PCR. De cellelinier i hvert panel er organiseret ved relativ E-cadherin ekspression (lav til høj, fra venstre mod højre, se figur 1B.). B. Scatterplots skildrer forholdet mellem FGFR1, bFGF, FGFR3, og EMT markør udtryk. Parametrisk korrelation analyser blev anvendt til at bedømme sammenhængen mellem FGFR3 og E-cadherin (CDH1) ekspression, FGFR1 og ZEB1 udtryk, bFGF og ZEB1 ekspression og bFGF og FGFR1 ekspression. Korrelationskoefficienter og p-værdier er angivet på figuren.

Virkninger af bgj-398 på Cell Proliferation

Tidligere undersøgelser konkluderet, at FGFR hæmmere blokerer spredning i nogle humane BC celler in vitro [ ,,,0],12], [13]. Vi har derfor testet effekten af ​​bgj-398 på proliferation i 17 f.Kr. cellelinjer til at karakterisere omfanget af heterogenitet i narkotika følsomhed. Vi inkuberede cellerne med stigende koncentrationer af bgj-398 i 48 timer og målt cytotoksicitet og vækststandsning ved hjælp MTT-assays. Vi identificerede 5 cellelinier (UM-UC14, SW780, RT4, RT112 og UM-UC1), der var narkotika-følsomme som defineret af ≥50% væksthæmning ved koncentrationer narkotika af en pmol /l eller lavere (fig. 3A venstre panel og data ikke vist). For at bestemme de relative bidrag til vækst anholdelse og celledød til disse effekter, vi udsættes UM-UC14 og RT4 celler til stigende koncentrationer af bgj-398 i 48 timer og måles direkte cellecyklusstop og apoptose ved propidiumiodidfarvning og FACS-analyse. I begge cellelinier stigende koncentrationer af bgj-398 producerede stigninger i procentdele af celler i G1 fasen og parallelle fald i de procentdele af celler i S-fase. Specifikt procentdelene af celler i G1-fasen steg fra 47,5% og 54% til 74,2% og 69,1%, mens procentdele af celler i S-fase faldt fra 33,5% og 25% til 2,7% og 8,8% i bgj-398- eksponerede UM-UC14 og RT4 celler, (fig. 3A). På den anden side, havde bgj-398 ikke inducere apoptose i enten cellelinie ved koncentrationer under 10 uM (data ikke vist). Derfor bgj-398 udøver primært cytostatiske virkning på BC celler in vitro.

A. Virkninger af bgj-398 på celleproliferation i narkotikarelaterede følsomme celler. I det venstre panel, blev celler inkuberet i 48 timer i nærvær af de angivne koncentrationer af bgj-398 og cellevækst blev målt ved MTT-reduktion. Middelværdi ± SEM, n = 6. I centrum og højre panel, UM-UC14 eller RT4 celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af bgj-398 samt procentdelen af ​​celler i hver celle-cyklus kvadrant blev kvantificeret ved propidiumiodid-farvning og FACS-analyse . Middelværdi ± SEM, n = 3. B. Følsomhed over for de antiproliferative virkninger af bgj-398 korrelerer med FGFR3-ekspression, men ikke med tilstedeværelse af aktiverende FGFR3 mutationer. Niveauet af vækstinhibering observeret efter 48 h udsættelse for 1 uM bgj-398 (som målt i MTT-assays) blev korreleret med det relative niveau af FGFR3 (venstre panel) eller FGFR1 (højre panel) mRNA-ekspression i et panel af 17 humane BC cellelinier .. C. Virkninger af FGFR3 knockdown på celleproliferation. Venstre panel: UM-UC14 eller RT4 celler blev forbigående transficeret med enten ikke-targeting (NT) eller FGFR3-specifikke siRNAs og cellevækst blev målt til 48 h ved MTT-reduktion. Middelværdi ± SEM, n = 6. Center og højre paneler: UM-UC14 eller RT4 celler blev transient transficeret med enten ikke-targeting (NT) eller FGFR3-specifikke siRNA’er og procentdele af celler i hver fase af cellecyklussen blev kvantificeret ved propidium iodidfarvning og FACS-analyse. Middelværdi ± SEM, n = 3. Underpanel: effektiviteten af ​​FGFR3 dæmpning blev målt ved kvantitativ RT-PCR og immunoblotting

Vi undersøgte derefter forholdet mellem bgj-398 sensitivitet og tilstedeværelsen af ​​aktiverende. FGFR3 mutationer. Brug af exon sekventering identificerede vi 5 cellelinier inden for vores panel, der indeholdt aktiverende FGFR3 mutationer (UM-UC6, UM-UC14, UM-UC15, UM-UC16 og UM-UC17) (Fig. S3). Påfaldende, kun en af ​​de FGFR3-mutant cellelinjer (UM-UC14) var også bgj-398 følsomme. På den anden side, observerede vi en god korrelation mellem FGFR3 mRNA-ekspression og lægemiddelfølsomhed (Spearman r = 0,7247 p = 0,01) (fig. 3B venstre panel), hvorimod der ikke var nogen korrelation mellem følsomheden over for bgj-398 og FGFR1 ekspression (Spearman r = -0,2931 p = 0,2536) (fig. 3B højre panel).

i betragtning af den ikke-overlappende mønstre af FGFR1 og FGFR3 udtryk, resultaterne foreslog, at FGFR3 spiller en større rolle end FGFR1 i kørsel spredning menneske BC celler. Til mere direkte teste denne hypotese, vi brugte RNAi til at vælte FGFR1 eller FGFR3 i bgj-398-følsomme UM-UC14 og RT4 celler og måles virkningerne på celleproliferation ved hjælp MTT assays. Kvantitativ RT-PCR viste Knockdown effektivitet på 50% og over 80% i de RT4 og UM-UC14 celler transficeret med FGFR3-specifikke siRNA’er, sammenlignet med celler transficeret med den ikke-specifikke siRNA kontrol, og disse resultater blev også bekræftet på proteinniveau ved immunoblotting (fig. 3C nedre panel). Den tilsvarende virkning på celleproliferation var meget ens, idet proliferation blev reduceret med næsten 50% i de RT4 celler og med over 80% i UM-UC14 transficeret med FGFR3 siRNA (fig. 3C, venstre panel). Cellecyklus analyser bekræftede, at FGFR3 knockdown øgede procentdele af celler i G1-fasen og faldt fraktionerne af celler i S-fasen (fig. 3C center /højre paneler), i overensstemmelse med de MTT resultater og de tidligere observerede virkninger af bgj-398 [ ,,,0],12]. I modsætning hertil knockdown af FGFR1 havde ingen signifikant effekt på proliferation (Fig. S4).

Virkninger af bgj-398 på Invasion

Selv om “mesenkymale” UM-UC3 og UM-UC13 celler udtrykt relativt høje niveauer af FGFR1, de var resistente over for de antiproliferative virkninger af bgj-398 (fig. 4A, venstre panel). Fordi invasion, migration, og metastase er karakteristiske træk ved “mesenkymale” tumorceller [20], vi undersøgt virkningerne af bgj-398 om invasion i UM-UC3 og UM-UC13 celler, ved hjælp af to “epitel”, bgj-398 resistente cellelinier (UM-UC6 og UM-UC9) som kontroller. Vi udsatte cellerne for stigende koncentrationer af bgj-398 og måles invasion anvendelse af modificerede Boyden kamre.