PLoS ONE: Hæmning af c-Abl kinase aktivitet Renders Cancer Cells meget følsomme over for Mitoxantrone

Abstrakt

Selvom c-Abl stigende har vist sig som en central aktør i DNA skade responset, dens rolle i denne sammenhæng er langt fra klart. Vi undersøgte effekten af ​​inhibering af c-Abl-kinaseaktivitet ved imatinib med kemoterapi narkotika og fundet en slående forskel i celle overlevelse efter kombineret mitoxantron (MX) og imatinib behandling sammenlignet med et panel af andre kemoterapeutiske lægemidler. Den kombinatoriske behandling induceret apoptose i HeLa celler og andre kræftceller, men ikke i primære fibroblaster. Forskellen i MX og doxorubicin var relateret til væsentlig forøgelse af DNA-skade. Transkriptionelt aktive p53 akkumuleret i celler, hvor humane papillomavirus E6 normalt forringer p53. Kombinationen behandling resulterede i caspase aktivering og apoptose, men denne effekt ikke afhænge af enten p53 eller p73 aktivitet. Trods øget p53 aktivitet, cellerne anholdt i G2 fase blev defekt i dette checkpoint, så cellecyklusprogression. Effekten efter MX behandling afhang dels på c-Abl: Kort interfererende RNA knockdown af c-Abl afsmeltet HeLa celler mindre følsomme til MX. Virkningen af ​​imatinib blev reduceret med c-Abl siRNA antyder en rolle for katalytisk inaktiv c-Abl i død kaskade. Disse fund indikerer, at MX har en unik cytotoksisk virkning, når kinaseaktiviteten af ​​c-Abl inhiberes. Behandlingen resulterer i øget DNA-skader og c-Abl-afhængige apoptose, hvilket kan give nye muligheder for potensering af kræft kemoterapi

Henvisning:. Alpay K, Farshchian M, Tuomela J, Sandholm J, Aittokallio K, Siljamäki E, et al. (2014) Hæmning af c-Abl kinase aktivitet Renders Cancer Cells meget følsomme over for Mitoxantron. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10,1371 /journal.pone.0105526

Redaktør: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Health Sciences Center, USA

Modtaget: 9. december 2013; Accepteret: 24 Juli 2014; Udgivet: 22 August, 2014

Copyright: © 2014 Alpay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra finsk Medicinsk Selskab, Turku University Foundation og Kræftens Bekæmpelse af sydvestlige Finland, Finlands Akademi (projekter 137.687 og 268.360), den finske Cancer Research Foundation, Sigrid Juselius Foundation, Turku Universitetshospital EVO tilskud (projekt 13336). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kemoterapi i tumor behandling virker hovedsageligt gennem forårsager DNA-skader, som inducerer et komplekst netværk af cellulære responser i sidste ende fører til kræft celledød. Kernen af ​​svaret er veje, der genkender skaden, standse cellecyklus, og vedtage død kaskade. I cancerterapi, strålebehandling og de fleste kemoterapeutiske stoffer fungere ved direkte at beskadige DNA eller interferere med DNA-replikation. DNA beskadigelse respons af maligne og normale celler bestemmer effektivitet og bivirkninger af behandlingen. Den skæbne cellen ligger i de komplekse DNA-reparationsveje fremkaldt af mange typer af DNA-skader, der kan opstå efter genotoksisk behandling [1]. Vellykket reparation er kritisk for normalt væv til at overvinde de bivirkninger af behandlingen, men i tumoren kan føre til en behandling resistens. Cancerceller sædvanligvis har akkumuleret mutationer i gener involveret i DNA-reparation, der tilbyder en række terapeutiske muligheder for midler, som modulerer de resterende funktionelle reparationsveje. Efter DNA ødelæggende behandling, er beskadiget baser, uoverensstemmelser eller DNA addukter normalt tolereres op til en vis kvantitativ tærskel, men kan give anledning til mutationer, hvis de forbliver ikke-udbedret [2].

c-Abl-hæmning er for nylig blevet foreslået at føre til en ændret DNA beskadigelse respons [3]. c-Abl er en ikke-receptortyrosinkinase, der spiller en rolle ved differentiering, adhæsion, celledeling, død og stress reaktioner og binder til flere proteiner involveret i apoptoseveje [4]. Ændringerne i c-Abl protein konformation varierer, og de bindingspartnere adskiller sig derved [4] – [6]. Adskillige proteiner, såsom ATM, DNA-PK, BRCA1, og transkriptionsfaktorer p73 og RFX1 interagere med c-Abl [5]. Mest bemærkelsesværdigt er c-Abl blevet rapporteret at interagere med homolog rekombination-repair protein RAD51, ophøje [7] dets ekspression på genniveau, og aktivere den ved phosphorylering. Aktiv c-Abl kan hæmmes af den lille molekyle lægemiddel imatinib (Gleevec; STI-571), som blev udviklet mod den afvigende BCR /Abl-fusionsprotein findes i kronisk myeloid leukæmi (CML) [8]. I CML-celler, er den første exon af c-Abl erstattes af BCR-gensekvens, hvilket resulterer i konstitutivt aktive c-Abl-ekspression. Denne afvigende kinase aktivitet resulterer i forbedret spredning, der kan hæmmes med imatinib. Imatinib er en ATP-kompetitiv inhibitor stabilisere inaktiv c-Abl kropsbygning [8]. Kinaseaktiviteten af ​​c-Abl forøges efter DNA beskadigelse og derefter øger aktiviteten af ​​ATM og Atr [9]. Behandling med imatinib nedsætter niveauet af forhøjet RAD51 involveret i dobbelt-strenget pause (DSB) reparation og sensibiliserer flere celletyper til kemoterapi [10] – [13]. Direkte interaktion er også påvist mellem c-Abl og DNA-PK, som regulerer ikke-homolog ende sammenføjning [14].

Udviklingen af ​​uterin livmoderhalskræft er en flertrinsproces, der involverer cervikal mucosal celletransformation ved onkogene human papillomavirus (HPV) E6 og E7-proteiner. E7 inaktiverer cellecyklus regulator pRb, inhibering cellecyklusstop, mens E6 inaktiverer tumor suppressor protein p53, nøglen regulator af apoptose og genotoksisk stress respons [15]. Fordi cervicale cancerceller næsten altid bære vildtype p53, der nedbrydes af højrisiko HPV, blev p53 tidligere betragtet som fuldstændig ikke-funktionel i cervicale cancerceller. Imidlertid har arbejdet i flere grupper nylig gjort klart, at p53-inaktivering kan blive omgjort HPV E6-bærende celler og at p53 status i cervicale cancerceller er ikke lig med den for cancerceller med et muteret p53-gen [16]. Vi har tidligere observeret, at chemoradiation reaktiverer p53 i livmoderhalskræft celler og fremmer celledød synergistisk. Men når analyseret i detaljer, p53-proteinet kan enten forøge eller inhibere cytotoksiciteten af ​​kemoterapien lægemidlet [17], [18]. Muse embryonale fibroblaster null for c-Abl er defekte i p53-phosphorylering og modstandsdygtig over for død efter genotoksisk skade. Inhibering af c-Abl af imatinib formindsker hydroxyurinstof-induceret p53 phosphorylering [9]. Vi antager, at den aktive p53 kan forøge DNA-reparation, og således ønskede at undersøge virkningen på celledød for reparation modulation. c-Abl menes generelt at videresende pro-apoptotisk signalering fra ATM og Atr til p53 og p73, blandt andre mål [3]. Vi studerede her effekten af ​​c-Abl hæmning på p53 aktivitet i HPV-positive celler, og hvordan det relaterer til skaden og død svar.

En omfattende panel af lægemidler, der repræsenterer alkylerende midler, platin narkotika, og topoisomerase I og II-hæmmere blev undersøgt sammen med imatinib i livmoderhalskræft celler der bærer HPV og HPV-negative cellelinjer. Vi rapporterer her, at c-Abl hæmning af imatinib i kombination med MX genotoksisk behandling resulterer i nedsat DNA-reparation, ophævelse af G2 fasen checkpoint, og massiv apoptose.

Materialer og metoder

Cellelinjer og cytotoksicitetsassays Salg

humane cervikale cancercellelinier SiHa (HPV 16+), CaSki (HPV 16 +), og HeLa (HPV 18+), brystcancer MCF7, og vulvacancer cellelinje A431 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). De primære humane fibroblaster er blevet beskrevet før [19]. Cellerne blev dyrket som monolag i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ikke-essentielle aminosyrer (Euroclone, Wetherby, UK), og 50 ug /ml gentamycin (Calbiochem, San Diego, CA, USA ). Den HeLa p53 reporter cellelinie, der bærer p53 reporterplasmidet ptkGC3p53-luc, er tidligere blevet beskrevet [18]. Trods tilstedeværelsen af ​​HPV E6, selv de HPV-positive cellelinier vise nogle p53 aktivitet efter genotoksisk stress, men aktiviteten kan nedbrydes af dominant-negativ p53 (DDp53) eller ektopisk E6 drevet af en stærk promotor. The SiHa DDp53, SiHa CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (tom vektor), og SiHa E6 cellelinier er også blevet beskrevet tidligere [18].

dominant negative p53-udtrykkende HeLa-cellelinje (HeLa DD ) blev afledt ved transfektion den parentale cellelinie med et plasmid, som udtrykker en trunkeret muse p53 indeholdende aminosyrerester 1-14 og 302-390 under kontrol af CMV-promotoren. Stabile transfektanter blev selekteret med 0,8 mg /ml G418.

I kortvarige cellelevedygtighedsassays, 1-2 × 10

4 celler per brønd (afhængig cellelinie) blev podet i plader med 96 brønde , og mediet blev erstattet med lægemidler fortyndet med medium. Cellelevedygtigheden blev målt ved WST-1 middel (Roche, Mannheim, Tyskland) eller MTT middel (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA), og absorbansen blev målt ved 450 nm (Multiskan plade microreader; Labsystems, Finland) eller ved 570 nm (Tecan multi-pladelæser;. Tecan, Schweiz) henholdsvis

i klonogene vækst assays, SiHa og HeLa-celler blev podet i plader med 6 brønde 48 timer før behandling. Cellerne blev udsat for behandling i 6 timer og derefter trypsiniseret og suspenderes i frisk medium og podes i plader med 6 brønde med 3 uM imatinib. SiHa-celler blev inkuberet i 14 dage og HeLa-celler i 7 dage. Efter inkubation blev cellerne fikseret med 1:01 acetone-methanol og farvet med Giemsa (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA). Derefter kloner blev enten talt manuelt eller analyseret som tidligere [20] beskrevne. Caspase 3/7 aktivitet af celler undergår apoptose blev bestemt ved anvendelse af Apo-ONE Caspase-3/7 homogent caspase assay (Promega).

Reagenser, narkotika, og antistoffer

kemoterapi forbindelser mitoxantron (MX) (Wyeth-Lederle, Finland), doxorubicin (DXR) (Nycomed, Roskilde, Danmark), cyclophosphamid (Orion Pharma, Espoo, Finland), topotecan (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, UK), etoposid (Pfizer), cisplatin (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA), docetaxel (Aventis), og carboplatin (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA) blev opbevaret og fremstillet som beskrevet [17]. Imatinib var en gave fra Novartis Pharmaceuticals (Basel, Schweiz). Stamopløsningen af ​​imatinib ved 200 mM blev fremstillet ved opløsning af forbindelsen i DMSO. C-kit og PDGF-α og β receptorblokker AG1296 blev indkøbt fra Calbiochem (kat. Nr. 658.551). PDGF-BB blev købt fra Sigma-Aldrich. Følgende antistoffer blev anvendt til Western blotting: monoklonalt muse-DO-1 for p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin-polyklonalt anti-GADD45α (.. Cell Signaling, kat nr 3518), kanin-polyklonalt anti-phospho -PDGF β-receptor (Cell Signaling, kat nr 3161..), monoklonalt muse-anti-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA;. kat nr 35-6500), monoklonalt muse-anti-cyclin B1 (BD Biosciences, kat. nr. 554.178) og monoklonalt anti-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). RNA blev isoleret under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen, Hilden, Tyskland).

lille interfererende RNA’er og transfektioner

c-Abl lille interfererende RNA’er (siRNA’er) blev opnået fra Invitrogen (Stealth, Carlsbad, CA, USA;…. kat nr 1299003), og ikke-targeting siRNA (Qiagen, cat nr 1.027.281) blev anvendt som kontrol. Transfektion af celler blev udført med 75 nM af tre individuelle siRNA’er målretning c-Abl og styre siRNA hjælp af siLentFect Lipid Reagent (Bio-Rad).

p53 reporter assay

Stald ptkGC3p53luc-bsd SiHa, CaSki, og HeLa cellelinier såvel som sammensætningen af ​​p53 reporterplasmidet ptkGC3p53-luc er blevet beskrevet tidligere [17]. Cellerne blev podet i 96-brønds plader (10

4 celler /brønd). Korrigeret for cellebinding i 24 timer blev de behandlinger påbegyndt for de angivne varigheder. De levende celler i hver brønd blev bestemt kolorimetrisk med WST-1 assay. Derefter blev cellerne skyllet med PBS og overlejret med 100 pi af en blanding indeholdende 50% PBS og 50% Bright-Glo luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA). Luciferaseaktiviteten blev kvantificeret ved hjælp af en hybrid capture luminometer (Digene, Gaithersburg, MD, USA). Luciferase aflæsninger blev delt af WST-1 værdi for at opnå normaliseret reporter aktivitet.

Western blotting

Cellerne blev høstet ved hjælp af 200 pi standard 1 × SDS prøve buffer. De resulterende helcelle-ekstrakter blev kogt og derefter separeret ved 10% SDS-PAGE og overført til Immobilon-P-polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Membranerne blev probet med de angivne primære antistoffer, og sekundært detektion blev udført med anti-muse peberrodsperoxidase (HRP) (GE Healthcare, NJ, USA), anti-kanin-HRP (DAKO, Glostrup, DK), og ECL (GE Healthcare , NJ, USA). Beta-actin blev anvendt som en loading kontrol. Western blot filmene blev digitaliseret med en ChemiDoc MP gelanalyse platform (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). og analyseret med Fiji (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, NIH, USA) under anvendelse af gelerne mulighed.

Flowcytometri

Cellecyklusanalyse blev udført ved flowcytometri. Celler blev høstet med trypsinisering sammen med flydende ikke-levedygtige celler. Cellerne blev vasket en gang med PBS og suspenderet i natriumcitratbuffer (40 mM Na-citrat, 0,3% Triton X-100, 0,05 mg /ml propidiumiodid, PBS) 20 minutter før analyse. Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) og CellQuest Pro software (Becton Dickinson). Cellecyklus og apoptose blev udført med ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, ME, USA) og Flowing software ver. 2.5 (Mr. Perttu Terho, Turku Center for Bioteknologi, Finland, www.flowingsoftware.com), hhv. For yderligere at analysere apoptose induktion efter MX og MX + imatinib behandling HeLa-celler blev dyrket på plader med 6 brønde og behandlet med angivne lægemidler i 24 og 48 timer. Medium og celler blev opsamlet, og prøverne blev farvet med Annexin-V-FITC Kit (ab14085; Abcam, Cambridge, UK) ifølge producentens instruktioner. Data blev erhvervet med FACSCalibur flowcytometer, og analyseret med Flowing Software.

Real-time kvantitativ revers transkription PCR

RT-PCR-metode er blevet beskrevet før [18]. Primerne var HPV 18 E6, fremad, 5′-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 ‘, og revers, 5′-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3′; og EF1α, fremad, 5’-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 ‘, og omvendt, 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3’. Mængderne af HPV 18 E6 udskrifter blev normaliseret mod aflæsningerne for EF1α.

Comet assay

DNA-skader blev undersøgt med en enkelt celle gelelektroforese kit (Trivigen, Gaithersburg, MD, USA). Assayet blev udført under alkaliske betingelser til påvisning både enkelt- og dobbeltstrenget DNA beskadigelse. Den encellede gelelektroforese af DNA blev udført som beskrevet af producenten. Billeder blev taget med et Olympus BX60 fluorescens mikroskop (Zeiss Axiovert 200 M) ved × 20 forstørrelse.

Time-lapse mikroskopi

Billeder blev fanget på en time interval i 72 timer med IncuCyte ZOOM kinetisk afbildningssystem (Essen Bioscience, Michigan, USA). Repræsentative brønde blev udvalgt og film blev konstrueret med ImageJ ver 1.47d (Wayne Rasband, NIH, USA). Bar repræsenterer 200 um.

Statistik

For at evaluere forskelle mellem grupperne, vi brugte Students t-test. En p-værdi under 0,05 blev anset for at indikere statistisk signifikans.

Resultater Salg

Inhibering af c-Abl af imatinib potenserer den cytotoksiske virkning af mitoxantron i cancerceller, men ikke i primære fibroblaster

styrken af ​​imatinib i styrkelsen cytotoksicitet blev screenet i et stort panel af kemoterapi narkotika. I de kortsigtede cytotoksicitetsassays, imatinib alene var ikke cytotoksisk for nogen af ​​cellelinierne ved 3 uM til 10 uM. Når HeLa, CaSki, og SiHa-celler blev behandlet med topoisomerase I-inhibitorer (topotecan og etoposid), nukleosidanaloger (gemcitabin, fluoruracil og cytarabin), alkyleringsmidler (cyclophosphamid og dacarbazin) eller cisplatin, imatinib forstærkede ikke cytotoksicitet (data ikke vist). Heller påvirkede det anthracycline- (doxorubicin, DXR) behandlede celler (figur 1A). Virkningen af ​​carboplatin blev forstærket to gange ved tilsætning af imatinib i 48 timer (data ikke vist). I modsætning til alle de andre kemoterapi testede lægemidler viste imatinib en dramatisk effekt sammen med mitoxantron (MX), en topoisomerase II inhibitor (figur 1A). Virkningen af ​​imatinib var lig mellem 3 um og 10 uM indikerer, at kinaseaktiviteten er blokeret i de undersøgte cellelinjer, selv ved 3 uM.

(A) Humant livmoderhalskræft (HeLa) -celler blev behandlet med MX ( 0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinib (10 uM) eller deres kombinationer. WST celleviabilitetstest blev udført ved 12 timer, 24 timer og 48 timer. Resultaterne blev normaliseret med celleantal i medium kun indeholdende brønde. *** P 0,001 uafhængige prøver T-test. (B) Både A-431 vulva carcinom cellelinie, der har en missense mutation i p53-genet og MCF-7 brystcancer cellelinje, som har en vildtype p53-gen viser en forbedret virkning, når MX og imatinib kombineres. Imatinib øger ikke cytotoksicitet af MX i primære fibroblaster. Målinger blev udført ved 48 timer under anvendelse af WST cellelevedygtighed assay. ** P 0,01, *** p 0,001 uafhængige prøver T-test. (C) klongenicitetsassayet. Imatinib øger MX cytotoksicitet både i HeLa CMV-cellelinie med vildtype-p53 og tom vektor og HeLa DDp53 cellelinie bærer en dominant negativ p53. Celler blev behandlet med hvert medikament i 12 timer. Derefter blev mediet erstattet med frisk medium uden lægemidler. Koncentrationen af ​​imatinib var 3 uM henviser MX blev anvendt i forskellige koncentrationer i området fra 1 nM til 40 nM. Kloner blev talt under mikroskop. Forsøg blev udført tre gange, middelværdi ± SD. *** P. 0,001

Den forbedrede effekt blev også set i CaSki og SiHa celler omend i mindre grad (figur S1). Cellelinierne, som vi ønskede primært til test blev afledt fra HPV-positive livmoderhalskræft. synes imidlertid effekten, for ikke at have været begrænset til disse celler. Lægemidlerne blev testet med to cancer cellelinjer af forskellig oprindelse: Den vulva carcinom cellelinje A431 har en missense mutation i p53-genet, og MCF7 brystcancer cellelinje har et vildtype-p53. Overlevelsen var slående lighed med de HPV-positive cellelinier (figur 1b). I modsætning hertil primære ikke-transformerede fibroblaster var ikke mere følsom, når imatinib blev sat til MX behandling (figur 1B). Dette resultat indikerer, at den observerede effekt ikke er begrænset til HPV-positive cancerceller men kan forekomme mere bredt uanset p53-status. Dog kan ikke-transformerede celler udviser modstand mod denne behandling.

forstærket effekt af imatinib blev også set i native og forskelligt modificerede HeLa og SiHa celler på en måde, uafhængigt af enten p53 eller E6 (figur S2). MX blev yderligere undersøgt i klonogene vækst assays til at overvåge langsigtede genopbygning kapacitet af cellerne. MX koncentrationer så lave som 1 nM sammen med 3 uM imatinib inhiberede HeLa celle klonal vækst fuldstændigt begge p53-nul og tom vektor-bærende celler (figur 1C). I SiHa cellelinjer, alene 3 uM imatinib påvirkede ikke klonal vækst. Følsomheden af ​​CaSki celler til imatinib Desuden var mellem den af ​​SiHa og HeLa-celler (Figur S3).

Mitoxantron inducerer caspase 3/7, som forstærkes ved at blokere c-Abl med imatinib

behandlingen med MX øger frigivelsen af ​​caspase 3 og 7 fra mitokondrier vejledende af apoptose. Imatinib alene ikke er i stand til at ændre disse niveauer (figur 2). Celler behandlet med 0,6 uM MX og 0,8 uM DXR øgede caspase aktivitet 2,5 gange, mens MX + imatinib kombinationsbehandling øgede aktivitet 4 gange. Imatinib forøgede ikke aktiviteten induceret af DXR alene.

HeLa-celler blev behandlet med angivne lægemidler i 48 timer. Derefter blev frisk medium udskiftet og caspase 3/7 aktivitet blev målt under anvendelse af ELISA-assay. Forsøg blev udført tre gange, middelværdi ± SD. *** P 0,001 T-test

Hæmning af c-Abl-kinase aktivitet øger DNA skader i MX-behandlede celler

Tilføjelse imatinib til MX øget komet hale i HeLa-celler. mens imatinib alene ikke havde nogen virkning (figur 3A). Imatinib inducerede ikke hale i DXR-behandlede celler. Mængden af ​​GADD45α protein steg en smule, selv i hele cellelysater med MX + imatinib (5 fold, figur 3B). Denne stigning synes at være reguleret på transskriptionelt niveau, fordi vi også har observeret en markant stigning i GADD45α transkriptniveauer efter kombinationsbehandling i microarray RNA analyser (upublicerede data). Ligesom p53 protein ophobning i celle stress, GADD45α transskription stiger under stress, herunder med DNA-skader. Både DXR og MX øget RAD51 niveauer (10 gange), og imatinib forbehandling inhiberede stigningen ligeligt (20%), men øget akkumulering af p53 ved tilsætning til MX (13 fold, figur 4).

(A) DNA-skader i HeLa-celler blev undersøgt under anvendelse Comet assay efter behandling med MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM) og imatinib (5 uM), eller deres kombinationer. Cometting (haledannelse) angiver DNA-skade. (B) Imatinib kombineret med MX øger niveauet af GADD45α. Western blot af GADD45α proteinniveauer fra helcellelysater. HeLa-celler blev behandlet med MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinib (5 uM), eller deres kombinationer i 30 timer.

Western blot af p53 og RAD 51 i HeLa-celler. Imatinib kombineret med MX øger p53 proteinniveauer i HeLa-celler. RAD51 niveau blev let reduceret i celler behandlet med imatinib og MX. Celler blev behandlet med MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinib (5 uM) eller deres kombinationer i 30 timer.

Mitoxantron-induceret p53-aktivering forstærkes ved at inhibere c-Abl kinase aktivitet

kemoterapi lægemidler anvendt i denne undersøgelse fremkalde forskellige former for DNA-skader, som p53 i målcellerne sanser. p53 aktiveres i cervikale celler trods nedbrydningsaktiviteten af ​​E6 [16], [19]. Vi målte p53 reporter aktivitet i HeLa, CaSki, og SiHa cellelinier med DXR, MX, og cisplatin. Da stofferne blev sammenlignet, cisplatin inducerede reporter mere end MX i HeLa og CaSki celler, men på samme måde i SiHa celler, og 0,6 uM MX alene ikke aktivere reporter på alle i HeLa-celler efter 48 timer. DXR inducerede reporter mere end cisplatin og MX i alle cellelinier (tabel 1). Imatinib alene ændrede ikke signifikant aktiviteten i nogen af ​​cellelinjer. Tilføjelse imatinib til cisplatin lidt reduceret aktiviteten, men der var ingen effekt for DXR. I modsætning hertil tilsætning imatinib til 0,6 uM MX steg aktiviteten i alle cellelinjer, med 50% i SiHa-celler, men fire gange i HeLa-celler og otte gange i CaSki-celler. Begrænsningen ved denne fremgangsmåde er, at en direkte sammenligning mellem cellelinier ikke kan fremstilles på grund af forskellige mængder af integreret reporterplasmid. I overensstemmelse med reporter assays, blev p53-protein-niveau også signifikant forøget i Western blot analyser (figur 4). Vi så noget fald i p53 niveau med imatinib alene, resultater, der var i overensstemmelse med de reporter analyse resultater.

P73 er ​​et medlem af p53-protein familien og interagerer med c-Abl direkte og kan også inducere apoptose. De P73 protein niveauer ikke ændre sig efter behandlingerne (figur S4).

Imatinib ændrer ikke HPV E6 niveauer

De fleste af de kemoterapi narkotika reducere mængden af ​​E6 mRNA [17]. Vi ønskede at vide, om imatinib forårsager reduktion i E6-ekspression i HeLa-celler enten alene eller kombineret med MX. Vi fandt, at 1 pM MX nedsætter E6 mRNA-niveauer i HeLa-celler med ca. 50%, og at 5 uM imatinib alene ikke reducerer niveauet af E6 mRNA i disse celler. En kombination af 5 uM imatinib og 1 uM MX ikke reducere niveauet af E6 mRNA i HeLa-celler mere end 1 pM MX alene.

Imatinib ophæver S-fasen anholdelse forårsaget af MX og øger apoptose

i HeLa-celler behandlet med imatinib alene, ved 24 timer, cellecyklusfordeling var den samme som i celler med medium alene, men der var lidt flere celler i S-fase efter 48 timer (figur 5A). Ved 24 timer og især 48 timer DXR akkumuleret cellerne ved G2 fase. Tilføjelse imatinib induceret S fasen anholdelse i softwaren analyse; dog på 48 timer med DXR + imatinib, der syntes at være en lille G2 befolkning, at analysen software ikke har kunnet påvise. MX-behandlede celler skred på 24 timer til S og G2, men den udvidede inkubation efter 48 timer viste en klar G2 anholdelse. Tilføjelse imatinib til MX viste på 24 timer population udvikler sig til G1, hvilket indikerer ophævelse af anholdelsen. Efter 48 timer var der ingen celler ud over S-fasen, men stadig også en klar G1 befolkning. Dette fund tyder på, at cellerne for tidligt var kommet direkte fra S fase til mitose og at imatinib kørte denne effekt. Alternativt kan MX + imatinib fremkalde en forsinkelse fra G1 /S til G2. Imidlertid blev der påvist flere forgæves mitose i time-lapse video af MX + imatinib-behandlede celler fremmer den fortolkning, cellecyklus arrest blev ophævet (Video S1). Vi bestemt også cyclin B1 niveauer, et godt anerkendt mitotisk markør, i narkotika behandlet cellepopulationer til at indsamle yderligere beviser for den forestilling, at MX + imatinib co-behandlede celler er i stand til proceduren i cellecyklus og indtaste M-fasen. Vi fandt, at behandling af HeLa-celler med DXR, DXR + imatinib, MX og MX + imatinib fører til akkumulering af cyclin B1. Proteinet niveau for imatinib-behandlede celler var under niveauet for påvisning på samme måde som de ikke-behandlede kontroller udviser basalt niveau cyclin B1 ekspression (fig S5).

(A) Celler blev behandlet med MX (0,6 uM), DXR (0,8 uM), imatinib (5 uM) eller deres kombinationer til 24 og 48 timer. Efter behandling blev cellerne høstet og farvet med propidiumiodid at kvantificere DNA-indhold under anvendelse af flowcytometri. Histogrammer viser cellecyklus distributioner. (B) Annexin-V (X-akse) kontra PI (Y-akse) farvning af HeLa-celler behandlet med angivne lægemidler i 48 timer. Procenterne angiver tidligt (nederste højre kvadrant) og sene (øverste højre kvadrant) apoptotisk fraktion. MX og imatinib viser en klar synergistisk virkning i apoptose induktion. Emissionen spektre af PI og DXR sammenfaldende på FL2-kanalen, hvilket gør det umuligt at skelne den tidlige apoptotiske befolkning fra slutningen apoptotiske befolkning i DXR-behandlede celler. Men når de rigtige kvadranter blev lagt sammen, var der ingen forskel mellem DXR og DXR + imatinib befolkninger.

Imatinib øgede sub G1 begivenheder i MX-behandlede HeLa celler, dels tegn på apoptose. Den sub G1 befolkning var den største (38,6%) i MX + imatinib-gruppen på 48 timer. Imatinib steg også DXR-inducerede sub G1 men i mindre grad (17,8%) ved 48 timer (tabel S1). For yderligere at analysere den mulige apoptose farvede vi cellerne med annexin V, som er en markør for tidlig apoptose. Vi fandt, at imatinib øger andelen af ​​apoptotiske celler i MX-behandlede celler, men kunne ikke påvise nogen stigning, når imatinib blev sat til DXR (figur 5B) Flowcytometri resultater er i overensstemmelse med caspase eksperiment støtter opfattelsen af, at imatinib med MX er mere potent inducer af celledød end med DXR. Imatinib er tidligere blevet rapporteret at forårsage G1 anholdelse i hoved- og halscancer cellelinjer [21], mens MX og DXR årsag G2 anholdelse [22]. Vi så ingen G1 anholdelse med imatinib alene.

nedregulering af c-Abl med siRNA hæmmer cytotoksicitet af MX + imatinib

Imatinib og MX viste en additiv effekt i at reducere antallet af kontrol siRNA HeLa celler. Når c-Abl blev slået ned med siRNA, fandt vi, at udbredelsen af ​​ubehandlede celler blev reduceret med 30-50% i gentagne forsøg (figur 6, Video S2). Både vækstkurver og time-lapse mikroskopi data viser en svag væksthæmning i c-Abl siRNA HeLa-celler. Men hverken kontrol siRNA eller c-Abl siRNA alene inducerede celledød. Dette resultat antyder, at c-Abl er nødvendig for den normale proliferation af disse celler. Målretning af c-Abl i HeLa-celler ved siRNA afsmeltede cellerne mindre følsomme for MX. CaSki-celler var også mindre følsomme for MX når c-Abl blev nedreguleret med siRNA, men der observeredes ingen hæmning af proliferation. Disse celler var sværere at transficere med siRNA og kun 40% virkningsfuldhed blev opnået. Dette kan også forklare, hvorfor spredning ikke blev inhiberet i disse celler. Desuden blev kombinatoriske virkning af imatinib betydeligt reduceret, implicerer c-Abl som omdrejningspunkt mål for imatinib i dette resultat. Sidstnævnte fund er også i overensstemmelse med eksperimenter med andre mål for imatinib, PDGF og c-Kit. AG1296 vides at hæmme signalering af human PDGF α- og p-receptorerne samt af den tilknyttede stamcellefaktor receptor c-Kit, ved 1 uM og 5 pM koncentrationer hhv. AG1296 kunne ikke efterligne virkningen af ​​imatinib med MX (figur 7A). Desuden MX ikke har nogen effekt på fosforylering af PDGF receptor (Figur 7B). Endvidere siRNA eksperiment indebar, at kinasen-aktive c-Abl er ansvarlig for celleoverlevelse efter MX skade. Af betydning, dette eksperiment peger på forskellige roller for kinase-aktiv og kinase-inaktive c-Abl. Kinase-inaktive c-Abl synes at være nødvendig for apoptose med MX, men kinase-aktiv c-Abl er en nøglespiller for DNA skader reparation efter MX i HeLa-celler.

(A) HeLa og CaSki Celler var transficeret med ikke-målretning eller c-Abl siRNA (75 nM). Western blot-analyse blev udført for at undersøge virkningen af ​​siRNA. Niveau af c-Abl blev kvantificeret og korrigeret for β-actin niveau. Værdier er proportioneret til kontrolniveauer siRNA for hver cellelinie. (B) HeLa, og (C) CaSki-celler blev transficeret med kontrol eller c-Abl siRNA. Efter treansfection celler blev behandlet med MX (0,6 uM), imatinib (5 uM) og deres kombination i 48 timer. Relative mængde af overlevende celler blev bestemt ved WST-1 assay. Resultaterne er fra to uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse. Data er vist som middelværdi ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Wang et al. Chen et al.