PLoS ONE: Gene Expression of Human Lung Cancer Cell Linje CL1-5 i svar på en direkte Current Electric Field

Abstrakt

Baggrund

Electrotaxis er flytning af vedhængende levende celler som respons på en jævnstrøm (dc) elektrisk felt (EF) fysiologisk styrke. Meget metastatiske humane lunge cancerceller, CL1-5, udviser retningsbestemt migration og orientering under dcEFs. For at forstå den transskriptionelle respons CL1-5 celler til en dcEF blev microarray analyse udført i denne undersøgelse.

Metodologi /vigtigste resultater

En stor elektrisk felt chip (LEFC) er designet, fremstillet og anvendt i dette studie. CL1-5 celler blev behandlet med EF styrken af ​​0mV /mm (kontrolgruppen) og 300mV /mm (ved EF-behandlede gruppe) i to timer. Signalveje, der omfatter de gener, som udtrykkes forskelligt mellem de to grupper blev afsløret. Det blev vist, at de er EF-regulerede gener stærkt korreleret til adherens krydset, telomerase RNA komponent genregulering, og tight junction. Nogle opreguleret gener, såsom

ACVR1B

og

CTTN

, og nogle ned-regulerede gener, såsom

PTEN

, er kendt for at være positivt og negativt korreleret til cellemigrering , henholdsvis. De protein-protein interaktioner af adherens junction-associeret ELEMENTÆRFILEN-regulerede gener antydede, at blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) -receptorer og Ephrin receptorer kan deltage i sensing ekstracellulære elektriske stimuli. Vi bemærkede endvidere en høj procentdel af signifikant regulerede gener, der koder cellemembranproteiner, hvilket antyder, at dcEF direkte kan påvirke aktiviteten af ​​cellemembranproteiner i signaltransduktion.

Konklusioner /Signifikans

I denne undersøgelse nogle af EFs-regulerede gener er blevet rapporteret at være afgørende, mens andre er hidtil ukendte for electrotaxis. Vores resultat bekræfter, at reguleringen af ​​genekspression er involveret i mekanismen for electrotactic respons

Henvisning:. Huang CW, Chen HY, Yen MH, Chen JJW, Young TH, Cheng JY (2011) Gene Expression of Human Lung Cancer Cell Linje CL1-5 i svar på en direkte Current Electric Field. PLoS ONE 6 (10): e25928. doi: 10,1371 /journal.pone.0025928

Redaktør: Eshel Ben-Jacob, Tel Aviv University, Israel

Modtaget: Februar 16, 2011; Accepteret: September 13, 2011; Udgivet: 5 oktober 2011

Copyright: © 2011 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er delvist finansieret af National Science Rådet for Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw/) (kontrakt nr. 98-2113-M-001-013-MY2 og 100-2113-M-001 -014 -MY3 ). Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Electrotaxis, også kendt som galvanotaxis, er flytning af organismer eller celler som reaktion på et elektrisk felt (EF). Fysiologisk EF eksisterer ekstracellulært, såsom i sår, embryo hud, og kanalerne [1], [2]. Det kan også eksistere i grænsefladen mellem tumorer og normale væv [3], [4]. Flere typer af cancerceller, såsom prostata kræftceller, brystkræftceller, og lungekræft celler, er kendt for at migrere retningsbestemt under dcEF, og graden af ​​electrotaxis af disse cancerceller har vist sig at korrelere med deres metastatiske evner [5] – [8]. Living celle electrotaxis er forskellig fra celle elektroforese da sidstnævnte kræver løsrivelse af dyrkede celler fra underlaget på forhånd [9]. Desuden er EF styrke for celle-elektroforese er omkring 100 gange højere end for electrotaxis [9]. Desuden har det vist sig, at den retningsbestemte migration af celler forårsaget af elementærfiler men ikke EFs-induceret begivenheder såsom elektro-osmotiske strømme [10].

Mekanismen for electrotaxis er blevet undersøgt i mere end 10 år. Flere vigtige proteiner og gener er rapporteret at være involveret. Det vides, at fysiologisk EF omfordeler epidermal vækstfaktor receptorer (EGFR’er), der fører til katodisk polarisering og aktiveringen af ​​EGFR-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) signaling pathway [11], [12]. EGFR-signalering er væsentlig for EF-dirigeret migration af brystcancerceller [6]. Desuden, cyklisk AMP (cAMP) og cAMP-afhængig proteinkinase A mediere retningsbestemt vandring af humane keratinocytter i en dcEF [13], [14]. Beta-4 integrin sammen med epidermal vækstfaktor (EGF) også mediere electrotaxis af humane keratinocytter gennem en Rac-afhængig signaleringsvej [15]. Elektriske signaler styrer sårheling gennem phosphatidylinositol-3-OH-kinase (PI3K) -γ og phosphatase og tensin homolog (PTEN) [16]. Elementærfilen stimulation udløser aktiveringen af ​​Src og inositol-phospholipid signalering, som polariserer i retning af epithelcellevandring den [16]. I

Xenopus

embryonale spinale neuroner, GTPaser Cdc42, Rac og Rho mægle væksten kegle styring i en fysiologisk EF gennem Spatiotemporal regulering af GTPase aktivitet og deres effektorer [17], [18]. Det er EF-styret migration af rotte hippocampale neuroner medieres ved aktivering af Rho-associeret protein kinase (ROCK) og PI3K [19]. Desuden retningen af ​​EF-inducerede migration af

Dictyostelium

celler er slået af cGMP og phosphatidylinositol signalering [20]. Det er også rapporteret, at calciumionerne spiller vigtige roller i dirigeret migration af

Dictyostelium

celler og osteoblast-lignende celler [21], [22], hvilket antyder, at calcium-signalvejen kan deltage i electrotaxis.

de fleste undersøgelser udforsker den mekanisme af electrotaxis er fokuseret på specifikke gener, proteiner og signalveje. Den globale genekspressionsprofilering kunne være en tilgang for at afsløre hele af mekanismen. Mikromatrice er en velkendt teknologi til hele genomet genekspressionsprofilering. For nylig er microarray analyse for electrotaxis undersøgelse udført hos humane dermale fibroblaster og epidermiskeratinocytter [23], [24]. I humane dermale fibroblaster, er de er EF-regulerede gener associeret med cellulære signalveje, herunder TGF-β, G-proteiner, og inhibering af apoptose [23]. I humane epidermale keratinocytter, er er EF-regulerede gener vist at korrelere med chemokin, apoptose, JAK-STAT, Wnt, og G-protein-MAPK aktivering signalveje [24]. Indtil videre er der ingen forskning diskutere den globale effekt af EF på genekspression af kræftceller.

Tumor celle invasion og metastase er de hyppigste årsager resulterer i den høje dødelighed af lungekræftpatienter i fem år. Invasion er den mest kritiske trin i den metastatiske proces, og det sker gennem interaktionen mellem tumorcellerne og det omgivne miljø. Humane lunge adenocarcinomceller, CL1-5, som er en delaktionslinje afledt af CL1-0, har højere invasionsevne end CL1-0 [25]. I vores tidligere undersøgelse har vi vist, at CL1-5 celler migrerer mod anoden og orientere vinkelret på retningen af ​​den dcEF. I modsætning hertil CL1-0 ikke vise indlysende electrotactic respons [8]. Da den positive sammenhæng mellem den metastatiske evne og electrotactic respons er observeret i niveauet af celle bevægelse, er det vigtigt at undersøge indflydelsen af ​​fysiologiske EF på genekspression. I dette arbejde blev de stærkt metastatiske CL1-5 celler undersøgt ved hjælp af DNA-mikroarray. Gennem analyse af EFs-regulerede gener og deres tilsvarende signalveje, kan vi forstå mere om den rolle, fysiologiske EF i tumormetastaser.

For electrotaxis studiet, har vi designet og fabrikeret en mikrofluid elektrisk-felt chip (EFC), som tilvejebringer ensartet dcEF i cellekultur mikro-kammer [8]. Tykkelsen af ​​den mikro-kammer er kun 70 um og dermed joule opvarmning kan udelades [8]. Begrænsningen af ​​EFC er, at cellekulturen region er for lille til at give nok celler til microarray analyse i engangs-eksperiment. Derfor blev en stor elektrisk felt chip (LEFC) giver ensartet dcEF designet og fabrikeret i dette arbejde for prøvetagning (figur 1).

LEFC havde forbinder huller på mellemlang indløb /udløb og agar salt broer. Celler blev dyrket i mikro-kammer (cellekulturen region). Bredden, længde og tykkelse af mikro-kammer var 24mm, 75mm, og 70 um, hhv.

Resultater

LEFC og EF stimulation

Til opbygge en EF med styrken af ​​300mV /mm i cellekultur region, blev strømmen af ​​696 uA indføres i LEFC ved anvendelse af spænding på omkring 21V på elektroderne (figur 2). Den elektriske effekt, der forbruges i cellekultur region blev anslået til at være P = IV = 15.7mW (696 uA × 75mm × 300mV /mm). Det var forventet, at joule-opvarmning kunne udelades med så lav elektrisk strøm. Den numeriske simulering af dcEF viste en ensartet fordeling i cellekultur region (figur 3). Mere end 85% kultur region blev afsløret i EF styrke på 300 +/- 15mV /mm.

En LEFC blev integreret med en transparent ITO varmer chip, to Ag /AgCl elektroder med phosphatpufret saltvand (PBS ) som elektrolyt, to agar salt broer (1,5% agar i PBS), en sprøjte pumpe, en DC strømforsyning, en ampere-meter, og en omvendt mikroskop.

EF styrke langs den stiplede line (mellem de to pile) blev vist. Mere end 85% kultur området blev udsat for EF styrke på 300 +/- 15mV /mm.

I microarray analyse, er 20-30 ug total RNA kræves for en GeneChip, hvilket betyder, at ca. der er behov for 10

6 CL1-5 celler for hver gentagelse. Cellekulturen region af et LEFC er 75 × 24 mm

2, omkring 40 gange større end for en EFC (3 x 15 mm

2). Det blev testet, at CL1-5 celler høstet fra en LEFC kunne nå til 10

6 celler pr chip. Med andre ord kan en LEFC give nok mængde af total RNA for en microarray eksperiment.

signalvejen analyse

Gennem ANOVA-test, 1631 probesæt af Affymetrix HG-U133 plus2.0 Array blev identificeret med statistisk forskellen udtryk mellem kontrolgruppen og EF-behandlede gruppe (p 0,05). Blandt dem, 431 probesæt havde alle signalintensiteter for de to grupper større end det globale median intensitet af de seks arrays (= 66,5, fra signalet intensiteter af 54675 probesæt × 3 replikater × 2 grupper). De 431 probesæt blev behandlet i signalvejen analyse. Antallet af disse probe sæt tiltrædelse blev forelagt CRSD hjemmeside, hvor hele genomet iterativ berigelse analyse blev udført. De øverste tre signalveje, der viser signifikant sammenhæng til EFs-regulerede gener var adherens krydset, telomerase RNA komponent gen

hTerc

transskription regulering, og tight junction (tabel 1).

Subcellulær lokalisering og biologisk funktion analyse

de EFs-regulerede gener blev kategoriseret baseret på subcellulære placering af deres proteinprodukter. Proteinet database Swiss-Prot og Ensembl blev henvist til. Hvis et protein var placeret i “cellemembranen” vist i Swiss-Prot, eller den indeholdt “signalpeptid og transmembrane domæne” vist i Ensembl, blev det kategoriseret som et cellemembranprotein i denne undersøgelse. Baseret på definitionen, blev 6545 probesæt af HG-U133 Plus2.0 matrix anses for at repræsentere de gener, der koder cellemembranproteiner. Her undersøgte vi de væsentligt regulerede gener med fold-change større end 1,5 eller mindre end 1 /1,5 (ved EF-behandlede gruppe /kontrolgruppen). Blandt 88 gener, som opfyldte kriterierne blev 18 gener anerkendt til at kode cellemembranprotein. Procentdelen er 18,2% (= 16/88). Til sammenligning valgte vi tilfældigt 88 probesæt fra sonden sæt HG-U133 plus2.0 array (med undtagelse af probe-sæt kontrolsekvenser) og undersøgt procentdelen af ​​gener, der koder cellemembranprotein. Den gennemsnitlige procentdel fra 10000-tid operation er 12%.

Kategoriseringen af ​​de 88 signifikant regulerede gener blev vist i tabel 2 (opreguleret) og tabel 3 (nedreguleret). Bortset fra de gener, der koder cellemembranproteiner, andre blev kategoriseret baseret på “cellulær komponent” i Swiss-Prot. Desuden blev generne anført i tabel 2 og tabel 3 analyseret med deres biologiske funktion ifølge Gene Ontology annotation (figur 4). Den microarray analyse resultat blev delvist valideret af real-time RT-PCR. De 20 udvalgte gener viste positiv sammenhæng mellem real-time RT-PCR og resulterer microarray analyse i deres udtryk ændring (tabel 2 og 3).

De markant regulerede gener, der er anført i tabel 2 (opreguleret) og tabel 3 (ned-reguleret) blev kategoriseret med deres biologiske funktion i henhold til Gene ontologi annotation. Vejviser

Gen-ekspression af de indberettede electrotaxis-relaterede gener /proteiner

Vi undersøgte også microarray analyseresultaterne af de gener, der er blevet rapporteret at være korreleret til electrotaxis. Blandt de 1631 probesæt identificeret ved ANOVA, dem, der har alle intensiteter over baggrundsniveauet (dvs. større end det globale median) i mindst én af de to grupper blev overvejet. Udtrykket af electrotaxis gener /proteiner blev diskuteret nedenfor.

Diskussion

EF stimulation

Under EF styrken af ​​300mV /mm, vores tidligere arbejde har vist, at CL1 -5 celler har en betydelig tendens til retningsbestemt migration og orientering mens CL1-0 celler bevæger tilfældigt [8]. CL1-5 celler udgør en næsten konstant bevægelse mod anoden umiddelbart efter dcEF tændes. Men orienteringen af ​​CL1-5 celler er ikke indlysende indtil 2 timers eksponering i dcEF. De forskellige reaktionstid EF-inducerede retningsbestemt migration og cellen krop orientering CL1-5 celler tyder inddragelse af forskellige signalveje i electrotaxis. Dette synspunkt er også foreslået i en nylig arbejde af Hammerick et al.

Vi formodede, at genekspression ændring associere med de to electrotactic svar, den retningsbestemte migration og orientering, kunne alle blive opdaget [26] efter 2 timers behandling af dcEF. Således i denne undersøgelse blev udført microarray analyse for CL1-5 celler stimuleret af 300mV /mm i 2 timer. Resultaterne viste, at adskillige gener blev væsentligt reguleret. I betragtning af den høje pris på DNA microarray analyse (omkring US $ 1000 × 3 replikater × 2 grupper for hvert tidspunkt), startede vi med at vælge den tid periode på 2 timer i denne indledende undersøgelse. For yderligere at skelne, om det regulerede genet blev korreleret til retningsbestemt migration eller orientering, microarray analyse af kortsigtet EF stimulering (måske 10 min) vil blive videreført i vores fremtidige arbejde.

I denne undersøgelse celledyrkningsmediet blev erstattet med serumfrit DMEM medium inden dcEF blev påført. Serum er en kompleks forbindelse, som indeholder forskellige proteiner, såsom vækstfaktorer, cytokiner og vedhæftningsfaktorer. Under en anvendt dcEF i celledyrkningskamret kan kemisk gradient af disse proteiner dannes ved elektroforese. Derfor kan reaktionen af ​​celler under dcEF blive påvirket af kemotaksi. For at minimere de mulige virkninger af den kemiske gradient, når de efterforsker indflydelse dcEF på cellerne, blev serum fjernet på forhånd. Vores tidligere arbejde har vist, at dcEF inducerer den retningsbestemte migration og orienteringen af ​​CL1-5 celler i serumfrit [8] medium. Resultaterne antyder, at dcEF kunne inducere electrotactic respons af levende celler uden kemisk stimulering. Nogle forskellige typer af celler viser også electrotactic respons i serum-frit medium, såsom neurale kamceller, hippocampale neuroner, og CHO-celler [27] – [29]

Ikke desto mindre er celler omgivet af en række forskellige. vækstfaktorer og cytokiner

in vivo

som også kan spille roller i electrotaxis af celler. I vores tidligere undersøgelse har CL1-5 celler blevet observeret at migrere mod anoden både i serumfrit [8] og i serum-holdige (Film S1) medium under et påført dcEF. Det er et vigtigt fremtidigt arbejde at sammenligne EF-reguleret genekspression i serumholdigt medium, og at i serum-frit medium. Den samtidige effekt af EF og den kemiske gradient kunne således undersøges. Et sådant arbejde kan hjælpe os med at finde ud af kandidat vækstfaktorer og cytokiner, der deltager i mekanismen for electrotaxis.

signalvej analyse

Under behandlingen af ​​dcEF, vi observerede forskellen regulering af seks gener, der var kendt for at være involveret i adherens krydset vejen (hsa04520, Kegg) (tabel 1). Fire gener

ACVR1B

(1,51 gange),

FYN

(1,21 gange),

WASF3 Hotel (1,2 gange), og

ACP1

( 1.18 gange) blev vist at være opreguleret.

ACVR1B

(activin A receptor, type IB) koder for et type I activin receptoren, som er et transmembrant serin /threonin kinase receptoren og er essentiel for signalering. Activinreceptoren signalering regulerer prostataepitelcellelinie celleadhæsion og er forbundet med prostatacancer metastaser [30]. Den proteintyrosinkinase Fyn (kodet af

FYN, FYN

onkogen relateret til

SRC

,

FGR

,

YES

) er et medlem af Src familien af ​​kinaser, som er vigtige i integrin-medieret celleadhæsion og migrering [31]. Aktivering af Fyn fremmer migrationen af ​​skællede carcinomceller [32].

WASF3

(WAS protein familie, medlem 3), også kendt som

WAVE3

, koder for et protein medlem af WAVE familien, der medierer actin reorganisering og celle bevægelse. Det er blevet rapporteret, at WAVE3, som reguleres nedstrøms PI3K, koncentrerer i lamellipodia på forkant og medierer celle migration og lamellipodia dannelse [33].

udtryk for

PVRL1

( 1 /1,97-fold) og

ACTG1

(1 /1,05 gange) blev vist at blive undertrykt af den påførte dcEF.

PVRL1

(Poliovirus receptor-relateret 1), også kaldet

nectin-1

, koder for et calcium-uafhængig celle-celleadhæsion-protein. Nectin-1 spiller en rolle i organiseringen af ​​adherensovergange i epitel og endotelceller [34], [35].

ACTG1

(Actin, gamma 1) koder en cytoplasmatisk actin findes i nonmuscle celler. Aktinerne er velkendte for at være involveret i forskellige typer af cellemotilitet, og vedligeholdelse af cytoskelettet. Den anvendte dcEF forbedret udtryk for

ACVR1B

,

FYN

, og

WASF3

, hvilket igen kan øge migrationen af ​​CL1-5. Det blev foreslået, at EF-reduceret friktion (

PVRL1

↓) bidrog til den forbedrede motilitet. Undertrykkelsen af ​​

ATCG1

var mindre i forhold til ændringen af ​​de andre gener. Det har vist sig, at migration på CL1-5 forstærkes ved anvendelsen en dcEF til cellekultur-regionen [8].

Vi yderligere undersøgt forholdet mellem protein produkter fra disse seks gener. Den analytiske værktøj MetaCore (GeneGo) blev anvendt til at opbygge netværk af direkte eller indirekte protein-protein interaktion. Samspillet og den subcellulære lokalisering af proteinerne blev vist i figur 5. Det blev observeret, at Fyn, ACP1, og c-Src har direkte interaktion med to slags receptorer, blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF) receptorer og Ephrin receptorer [36 ] – [43].

C-Src

blev vist at være 1,3 gange opreguleret ved dcEF i denne undersøgelse. PDGF-receptorer har været impliceret at blive aktiveret af fysiske kræfter, som ændrer receptorkonformation [44]. Netværkene foreslog, at PDGF-receptorer kan stimuleres af dcEF og aktiveres derefter Fyn, c-Src og c-Abl, der påvirkede den aktivering af WAVE3 [45] – [47]. Den aktiverede WAVE3 efterfølgende reguleres reorganisering af actincytoskelettet og dermed påvirket cellens morfologi og motilitet [48]. Resultaterne foreslog også, at ephrin-A receptorer og ephrin-B-receptorer kan spille roller i at konvertere de elektriske stimuli i biologiske signaler. Imidlertid blev genekspression ændringen ikke observeret i PDGF-receptorer, ephrin-receptorer og c-Abl i denne undersøgelse. Udtrykket niveau og den rolle af disse proteiner i electrotaxis skal undersøges yderligere.

Diagrammet viste, at EF opreguleret Fyn, ACP1, og c-Src måske direkte interagerer med to slags membran receptorer, PDGF-receptorer og ephrin receptorer. Grøn pil: positiv effekt; Rød pil: negativ effekt; grå pil:. uspecificeret effekt

Flere EF-regulerede gener var involveret i den transkriptionelle regulering af telomerase RNA komponent gen

hTerc

(h_terc, BioCarta), som koder for RNA-komponent human telomerase. RNA-komponenten tjener som en template for telomer repeat [49]. Gennem behandlingen af ​​EF, vi observeret, at

NFYA

(Nuclear transkriptionsfaktor Y, alpha) og

NFYC

(Nuclear transkriptionsfaktor Y, gamma) blev nedreguleret med 1 /1.16- fold og 1 /1,27-gange.

NFYA

og

NFYC

indkode to underenheder af en trimer kompleks NF-Y protein, hvilket er en aktivator af

hTerc

gen. Den nedregulering af

NFYA

og

NFYC

foreslog, at ekspressionen af ​​

hTerc

kan falde på grund af den anvendte dcEF. Da der ikke er indstillet til

hTerc

gen i HG-U133 Plus 2,0 vifte sonde blev ekspressionen af ​​dette gen ikke vist på microarray resultat.

Anvendelsen af ​​dcEF til CL1 -5 celler ændres også ekspressionen af ​​vigtige gener involveret i tight junction-vejen (hsa04530, Kegg). Fire korrelerede gener

F11R

(1,52 gange),

CTTN

(1,51 gange),

RAB13

(1,25 gange), og

EPB41

(1,23 gange) blev vist at være opreguleret.

F11R

gen (F11 receptor), også kaldet vejkryds adhæsionsmolekyle-A (JAM-A), er en vigtig regulator af tight junction samling og celle migration [50].

CTTN

gen (Cortactin) koder for et protein cortactin der regulerer samspillet mellem komponenter i vedhængende-type vejkryds. Det organiserer cytoskelettet og celle vedhæftning strukturer epiteler og carcinomceller. Mange undersøgelser har dokumenteret en rolle for cortactin at fremme cellemotilitet og cancer invasion [51].

RAB13

genet (medlems RAS oncogen familie) koder en af ​​de små guanosin triphosphatases (GTPaser) af RAB-underfamilien, der vides at lokalisere til den tight junction. Dette protein er blevet vist at spille en kritisk rolle ved regulering både strukturen og funktionen af ​​tætte overgange i polariserede epithelceller [52]. Rab13 protein er også vist at blive aktiveret i løbet af epitelcelle spredning-processen, der omfatter de første trin i carcinoma invasion /metastase [53]. Genet

EPB41

(erythrocyt membranprotein band 4.1) koder et af de 4,1 proteiner kaldet 4.1R. De 4,1 familieproteiner er komponenter i det kortikale cytoskelet underliggende cellemembranen. De bidrager til tilrettelæggelsen af ​​cellepolaritet, vedhæftning og motilitet. De påvirker også transport gennem membranen og respons på vækstfaktorer [54]. På den anden side,

PTEN

(1 /1.19-fold) og

ACTG1

(1 /1,05 gange) blev vist at være nedreguleret.

PTEN

identificeres som en tumorsuppressor og koder for et phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat 3 (PtdIns (3,4,5) P3) – phosphatase. PTEN nedregulerer intracellulære niveauer af PtdIns (3,4,5) P3 og derved have en negativ regulerer PI3K /Akt pathway. Under den påførte dcEF, at PtdIns (3,4,5) P3 blev rapporteret være polariseret til forkanten af ​​differentierede HL60-celler migrerer mod katoden [16]. Det er kendt, at PTEN inhiberer cellemigration, spredning, og fokale adhæsioner [55]. Kort sagt,

F11R

,

CTTN

,

RAB13

,

EPB41

,

PTEN

ACTG1

var kendt for at mediere celle motilitet og /eller cytoskelettet organisation, hvilket tyder på, at de kan spille roller i electrotactic reaktion CL1-5.

sammenflydende CL1-5 cellemonolag kunne observeres efter inkubation natten over (~20hrs ) i kulturen kammer LEFC. Det forlyder, at udvikling af høj modstand elektriske sæler tager 48-timers plating at nå steady-state i tight junction dannelse [56]. Da blev observeret de tight junction-associerede gener skal EF-reguleret, vi udledes, at den dcEF kan påvirke tight junction dannelse under stimulering periode. Således har vi undersøgt yderligere genekspressionen af ​​andre større tight junctions komponenter, såsom de transmembrane protein occludins og claudins og det cytoplasmatiske ZO familien. Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem kontrolgruppen og EF-behandlede gruppe. Resultaterne antydede, at dcEF kunne have indflydelse på tight junction samling gennem regulering af JAM-A i stedet for occludins, claudins og ZO familie i transskription niveau.

For at opsummere, EF kan påvirke bevægelsen af ​​CL1-5 ved regulere adherens junction og tight junction i transskription niveau. Mange regulerede gener i disse to signalveje vides at korrelere med cellemigrering. Bortset fra

PTEN

ACTG1

, de fleste af de gener er ikke blevet rapporteret at være EF-korreleret endnu.

Subcellulær lokalisering analyse

En kendt mekanisme electrotaxis er, at membranreceptorer omfordeler under den påførte dcEF og forårsage den asymmetriske signalering af cellen [1]. Det foreslås også, at elementærfiler kan transduceres ind mekaniske signaler ved den mekaniske moment udøver på glycoproteiner på cellemembranen [57]. Da celle membranproteiner kan være direkte påvirket af dcEF, vil vi gerne undersøge deres andel i produkterne af EFs-regulerede gener. Ca. 18,2% af de væsentligt regulerede gener (fold ændring 1,5 eller 1 /1.5) blev observeret at kode cellemembranprotein. Men kun 12% af tilfældigt udvalgte gener kodet cellemembranprotein. Resultatet viste, at en relativt høj procentdel af membranproteiner blev væsentligt reguleret af dcEF i transkriptionsniveauet. De EFs-ramte membranprotein gener opdaget i dette arbejde kunne være kandidater til yderligere glycomic undersøgelse af electrotaxis.

Biologisk funktion af EF-regulerede gener

Ud over den biologiske vedhæftning, vi kunne se, at dcEF regulerede gener fungerer i de biologiske processer, såsom biologisk regulering, cellulær proces, signalering, metaboliske proces, etc. (figur 4). Adskillige gener var kendt for at deltage i apoptose, herunder de up-regulerede gener

SRGN

og

TP53INP1

(tabel 2), og de ned-regulerede gener

BIRC7

,

TRAF2

,

UNC5B

, og

GCLM Hotel (tabel 3). Desuden er nogle andre betydeligt regulerede gener kodede proteiner korrelerede til G-protein-signalering, herunder op-regulerede gener

F2R

DOCK9

, og ned-regulerede gener

GNA11

,

GPR156

, og

RAPGEF1

. Det er kendt, at G-proteiner er signaltransducere, der sender kemiske signaler uden for cellen, såsom hormoner, neurotransmittere og kemokiner, og forårsage ændringer inde i cellen [58]. Resultatet betød, at G-proteiner også kan spille roller i transmission mekaniske signaler i EF-stimulering. Nogle andre EF-regulerede gener forbundet med G-protein-signalering observeres i humane dermale fibroblaster og voksne epidermiskeratinocytter [23], [24].

Gen-ekspression af de indberettede electrotaxis-relaterede gener /proteiner

EGFR’er er blevet rapporteret til at polarisere i katoden vendende side af lungekræft cellelinier A549 og CL1-5 der vandrede mod katoden og anoden under dcEF henholdsvis [7], [59]. Det er også kendt, at EF-forstærket retningsbestemt migration korrelerer godt med ekspressionsniveauet af EGFR /ErbB1 i brystcancerceller. Transfektion af MTLn3 celler og MDA-MB-435 celler med ekspressionsvektorer for ErbB familiemedlemmer ErbB1, ErbB2 og ErbB3 også væsentligt forbedre EF-induceret migration [6]. I vores microarray analyse, udtrykket ændring af

ErbB1

ErbB2

under EF stimulation blev ikke observeret. Udtrykket af

ErbB3

syntes at være nedreguleret af det ansøgte dcEF, da signalstyrken af ​​kontrolgruppen (71,3 i gennemsnit med alle replikater 66,5) er større end den for EF-behandlede gruppe (48,7 i gennemsnit med alle replikater 66,5).

Beta-4 integrin, der kodes af

ITGB4

, er forbundet med a-6 integrin at være en receptor for lamininer. Det er blevet rapporteret, at beta-4 integrin og EGF koordineret regulere EF-medierede retningsbestemt migration via Rac1 i humane keratinocytter [15]. Fra microarray analyse resultat, ser vi ikke reguleringen af ​​

EGF

,

ITGB4

, og

Rac1

under dcEF. Men

ITGB5 Hoteller, som koder for beta-5 integrin, et andet medlem af integrin familien, viste signifikant opregulering af dcEF (1,55 gange, tabel 2),. Beta-5-integrin er associeret med alfa-V-integrin til at være en receptor for fibronektiner. Det er blevet rapporteret, at RNA-interferens knockdown af beta-5 integrin udtryk reducerer migration celle

in vitro

og metastase

in vivo

[60]. Vores resultat foreslog positiv sammenhæng mellem opregulering af

ITGB5

og forbedrede migration af CL1-5 celler under den anvendte dcEF.

Rac og Cdc42 er GTPaser der regulerer lamellipodia og filopodia dannelse , henholdsvis. De er blevet foreslået at dominere styringen af ​​vækst- kegler cathodally i

Xenopus

embryonale spinal neuroner. Det har også vist sig, at RhoA, hvis aktivering fører til vækstkonuskollaps, hæver anodally i ELEMENTÆRFILEN-behandlede vækstkegler [17], [18]. Rho-proteiner regulerer den dynamiske samling af cytoskeletale komponenter i adskillige fysiologiske processer, herunder cellemotilitet. De er kendt for at være involveret i celle transformation og cancermetastase. I vores microarray analyse, ser vi ikke udtrykket ændring af

Rac

,

Cdc42

, og

RhoA

under dcEF. Imidlertid

DOCK9

, der koder for en specifik guanin-nukleotid udveksling faktor (GEF), som genkender og aktiverer Cdc42, blev vist at være opreguleret af 1,94 gange (tabel 2) [61]. Desuden

RhoJ

, som koder et andet medlem af Rho familie, syntes at være opreguleret af EF-behandling (tiltrædelse # BC025770). For

RhoJ

, signalstyrken af ​​EF-behandlede gruppe (alle gentagelser 66,5, 91,4 i gennemsnit) er større end for kontrolgruppen (alle gentagelser 66,5, 32,4 i gennemsnit).