PLoS ONE: A Novel Gene Signatur for Molekylær Diagnose af human prostatacancer ved RT-qPCR

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft (CaP) er en af ​​de mest relevante årsager til kræft død i de vestlige lande. Selvom påvisning af CaP på tidligt helbredelig fase er meget ønskeligt, er der behov for egentlige screeningsmetoder nuværende begrænsninger og nye molekylære metoder. Genanalyse øger vores viden om biologi CaP og kan gøre nye molekylære værktøjer, men identifikationen af ​​nøjagtige biomarkører for pålidelig molekylær diagnostik er en reel udfordring. Vi beskriver her den diagnostiske effekt af en roman 8-gener signatur: ornithindecarboxylase (

ODC

), ornithindecarboxylase antizyme (

OAZ

), adenosylmethionin decarboxylase (

AdoMetDC

) , spermidin /spermin N (1) -acetyltransferase (

SSAT

), histon H3 (

H3

), vækst anholdelse specifikt gen (

GAS1

), glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (

GAPDH

) og Clusterin (

CLU

) i tumor detektering /klassificering af menneskelig CaP.

Metode /vigtigste resultater

8-genet signaturen blev opdaget af retrotransskription realtid kvantitativ PCR (RT-qPCR) i frosne prostata kirurgiske prøver opnået fra 41 patienter diagnosticeret med CaP og anbefalede at gennemgå radikal prostatektomi (RP). Ingen terapi blev givet til patienter på noget tidspunkt før RP. Den bio-bank, der anvendes til undersøgelse bestod af 66 enheder: 44 var godartet-CaP parret fra den samme patient. Tredive-fem blev klassificeret som godartet og 31 som CaP efter endelig patologisk undersøgelse. Kun molekylære data blev anvendt til klassificering af prøver. Den Nærmeste Nabo (NN) klassificeringen blev anvendt for at skelne CaP fra godartet væv. Validering af endelige resultater blev opnået med 10-fold crossvalidation procedure. CaP versus godartede prøver blev diskrimineret med (80 ± 5)% nøjagtighed, (81 ± 6)% følsomhed og (78 ± 7)% specificitet. Metoden også korrekt klassificeret 71% af patienter med Gleason score 7 versus ≥7, en vigtig indikator for endelige resultat

Konklusioner /Betydning

Metoden viste høj følsomhed i en samling af prøver. hvor en betydelig del af den samlede (13/31, svarende til 42%) blev anset CaP på grundlag af at have mindre end 15% af cancerceller. Dette resultat understøtter begrebet “kræft feltet effekt”, hvor transformerede celler rækker ud over morfologisk tydelig tumor. Den molekylære diagnose metode her beskrevet er objektiv og mindre udsat for menneskelige fejl. Selv er behov for yderligere bekræftelser, denne metode besidde potentiale til at forbedre konventionel diagnose

Henvisning:. Rizzi F, Belloni L, Crafa P, Lazzaretti M, Remondini D, Ferretti S, et al. (2008) A Novel Gene Signatur for Molekylær Diagnose af human prostatacancer ved RT-qPCR. PLoS ONE 3 (10): e3617. doi: 10,1371 /journal.pone.0003617

Redaktør: Andrew Vickers, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: Juni 3, 2008; Accepteret: 2 okt 2008; Udgivet 31. oktober, 2008

Copyright: © 2008 Rizzi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kontrakt tilskud sponsorer: Genprofiler Srl, Bolzano, Italien; FIL 2005 og FIL 2006, University of Parma, Italien; Istituto Nazionale Biostrutture e Biosistemi (INBB), Roma, Italien

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (CaP) er menes at blive den mest relevante årsag til kræft dødsfald i de vestlige lande i den nærmeste fremtid, fordi dens forekomsten stiger hurtigt med alderen. Da prognosen er generelt ugunstige når sygdommen ikke længere orgel-begrænset, afsløring af CaP på et tidligt helbredelig fase er meget ønskeligt, men desværre tilgængelige metoder såsom serum Prostata Specifikt Antigen (PSA) nuværende begrænsninger [1]. Diagnosen CaP traditionelt opnås ved mætning prostata biopsi og morfologisk undersøgelse af vævssnit. Denne metode er pålidelig, men kræver omhyggelig træning. Ikke desto mindre kan der forekomme inden for og mellem observatør uoverensstemmelser. I princippet ville molekylær diagnostik være mere objektiv og forhåbentlig betydeligt mindre udsat for menneskelige fejl, hvis der opnås med pålidelige metoder. Men den ideelle metode bør også være hurtig, standardiseret og økonomisk praktisk. En sådan præstation er faktisk muligt i teorien, men resultater er offentliggjort er ikke helt tilfredsstillende endnu, også fordi de normalt er baseret på en konventionel tilgang udnytter en enkelt molekylært prædiktor betydeligt op- eller nedreguleret i cancer prøven versus godartet kontrol. En væsentlig hindring for dette mål er, at de molekylære begivenheder forårsager CaP debut og progression er stadig langt fra at være fuldstændig afsløret: meget få kendte onkogener eller tumor-undertrykkere er klart forbundet med prostata tumorigenese, og af denne grund CaP er stadig betragtes en undvigende sygdom. Derfor er der et akut behov for nye molekylære metoder til tidlig screening og diagnose.

genanalyse blev for nylig anvendt til at øge vores viden om biologi CaP [2]. Gene signaturer på RNA-niveau bestemmes og anvendes ofte som prædiktorer at modellere klinisk relevant information (fx prognose, overlevelsestid, følsomhed over for narkotika, etc.). Til dette formål, er de endelige konklusioner om effekt af genet signatur studerede klassificering helt tegnet på grundlag af de molekylære data opnået ved transkriptionel niveau ved anvendelse af metoder såsom DNA microarray eller RT q-PCR. Ved Northern blot-analyse har vi tidligere identificeret 8 informative gener, hvis ekspression ændrer på grundlag af tilstedeværelsen af ​​CaP malignitet hos mennesker [3]. I en 5-års follow-up undersøgelse viste vi også, at niveauerne af ekspression af dette panel af gener stærkt korrelerer med differentiering og endelige resultat (prognose) af Cap-patienter. Dette resultat blev opnået ved at kombinere molekylære data med standard kliniske oplysninger [4]. Men i vores sind den virkelige udfordring var at opdage CaP ved hjælp af molekylære værktøjer alene. Selv om undersøgelsen af ​​specifikt ændret genekspression under CaP tumorigenese er en vanskelig opgave, den videnskabelige oplysninger, der vil i sidste ende opnås er en vigtig belønning, hvilket fører til en bedre forståelse af den molekylære basis for den sygdom, som kan føre til bedre metoder til diagnosticering og terapi. Dette er især vigtigt, når man overvejer heterogenitet CaP og variabiliteten af ​​klinisk progression, med nogle patienter præsentere med langsom voksende indolente tumorer og andre patienter, der har en sygdom, der er hurtigt fremadskridende.

underskrift, at vi har identificeret, er lavet af 4 metabolisk relaterede gener,

ODC

,

OAZ

,

AdoMetDC

,

SSAT

, de regulatoriske gener af polyaminen stofskifte, 2 gener relateret til cellecyklusprogression,

H3

GAS1

, specifikke markører for S- og G

0-faser, henholdsvis [5], [6],

GAPDH

, et enzym af glycolitic vej, og

Clu

en gådefuld protein, hvis biologiske rolle er stadig et spørgsmål om forhandling.

CLU

, også kendt som

SGP-2

,

TRPM-2

eller

APOJ

, er stærkt over-udtrykt under prostata involution og remodellering [7], [8]. Selv om der er generel enighed om inddragelse af CLU i regulering celledød, er stadig kontroversiel, samt i celletransformation dens særlige rolle i den apoptotiske proces. Mere specifikt er det niveau af udtryk og regulering under CaP debut og progression debatteret [9], [10]. En bedre forståelse af dette spørgsmål er af særlig betydning, ikke kun på grund af de ovenstående betragtninger, men også fordi et klinisk forsøg rettet mod at lukke munden på

CLU

gen ved hjælp af antisense-oligonukleotider i Cap patienter pågår [11]. Som en kendsgerning, har vi og andre konstateret, at

CLU

nedreguleres under CaP progression [12] – [15], hvilket antyder, at det kan virke som en tumor-suppressor faktor [16], [ ,,,0],17].

Hvad angår genet signatur beskrevet her, alle de undersøgte har tidligere vist strengt relateret forskydninger i co-ekspression under CaP progression gener [3]. Specifikke ændring af transkription af de regulatoriske enzymer af polyamin metabolisme under CaP progression er også blevet valideret af meta-analyse af microarrays [18]. I Vagabonden mus model af CaP progression, vores gen signatur alene bestemt ved RT-qPCR, foruden at diskriminere CaP fra godartet væv, også forudsagt individuel respons på behandling med grøn tecatechiner (GTCs) [19]. Andre individuelle markørgener er blevet fundet af dokumenteret gyldighed på dette område, såsom α-methylacyl coenzym A racemase (

AMACR

) [20], [21] eller prostatakræft Antigen 3 (

DD3 /PCA3

) [22], men i øjeblikket fandtes ingen relation mellem ekspressionsniveauet af PCA3 og tumorklassificering eller stadieinddeling endnu. Vores gen signatur er lavet af informative gener, hvoraf nogle er godt kendt for at spille vigtige roller i fysiologi prostataceller, såsom generne koder for regulatoriske proteiner af polyamin metabolisme [23] og

CLU

[7] .

Formålet med vores undersøgelse var at vise, at vores gen signatur alene øger følsomheden og specificiteten af ​​molekylær diagnostik af CaP i forhold til enkelt markør identifikation. Vi brugte histopatologisk klassifikation af faste væv prøver som endelig reference, som normalt sker under lignende omstændigheder [24], [25]. Den 8-genet model blev detekteret ved RT-qPCR i frosne vævsprøver opnået ved radikal prostatektomi (RP). Klassificering af vævsprøver (dvs. tilstedeværelse eller fravær af tumor) blev udført uden andre patologiske eller kliniske data. Desuden blev molekylære data anvendt til sub-klassificering af vævsprøver med hensyn til Gleason score, alder og total serum PSA af patienten ved RP.

For prøven klassifikation vi brugt Nærmeste Nabo (NN) klassificeringen, en statistisk multifaktoriel analyse værktøj kendt for at klare sig godt specifikt til klassificering cancer i sammenligning med andre metoder. For validering af ydeevne klassifikation, vi brugte den 10-fold cross valideringsprocedure, gentages 100 gange med forskellige sub-prøvetagninger for at estimere den gennemsnitlige ydeevne af signaturen og konfidensintervallet (resultater er udtrykt som gennemsnit ± 95% konfidensinterval, ca svarende til 2 standardafvigelser).

Resultater

vævsprøverne bio-bank

bio-bank bestod af en samling af 66 humane prøver, se tabel 1, matcher vores kriterierne for undersøgelsen: i) patologiske symptomer på tilstedeværelse eller fravær af CaP i den frosne før og efter RNA-sektioner; ii) godartede prøver fri for prostata intraepitelialneoplasi (PIN) læsioner eller tumor invasion, taget meget langt væk (det vil sige i forskellige områder af prostata, ideelt set i de modsidige sekstant) fra neoplastiske læsion; iii) CaP prøver har en kræftcelle indhold dækker mindst 5% af hele afsnittet området; iv) godt udbytte og høj kvalitet af RNA-fremstilling. Blandt disse 44 prøver var CaP-godartede parrede prøver taget fra den samme patient. Thirthy-fem prøver blev klassificeret som godartet ved patolog, mens 31 var CaP

Sådan får molekylære og morfologiske data fra de samme vævsprøve:. “Sandwich” metode

at opnå en direkte sammenligning mellem molekylære data og patologisk klassifikation vi udviklet en metode “sandwich” (se figur 1 og Metoder: Prostata vævsprøver indsamling og håndtering). RNA-ekstraktion gav et gennemsnit på 50-60 ug totalt RNA fra 20 mg humant prostatavæv. Mængden af ​​total RNA opnået var høj nok til direkte at kontrollere kvaliteten af ​​præparatet ved spektrofotometri, efterfulgt af konventionel elektroforese. Kun god kvalitet RNA blev anvendt til RT-qPCR analyse. Otte informative gener plus 2 husholdere blev analyseret ud fra den samme RNA-prøve.

RT q-PCR og dataanalyse

Relativ kvantificering af målgener blev udført med den velkendte REST softwareværktøj [26]. Ændringer i niveauet af ekspression af 7 ud af 8 informative gener i CaP Versus godartet væv ikke nåede statistisk signifikans (ikke vist), mens

CLU

var signifikant nedreguleret i CaP (p 0,05). I figur 2 er den relative genekspression af signaturen opnået ved 2

∧-ΔΔCT metode rapporteres som en funktion af RP endelig Gleason score. Interessant,

CLU

er betydeligt og omvendt relateret (p 0,01) til Gleason score på tumoren: dvs. lavere ekspressionsniveauer af

CLU

blev fundet i højere Gleason score prøver. I tabel 2 er vist de endelige resultater af klassificering ved hjælp af Nærmeste Nabo (NN) klassifikatør kombineret med 10-fold validering korset. Selvom REST analyse viste, at kun de ændringer i

CLU

udtryk blev statistisk signifikant, NN klassifikation + 10-fold krydsvalidering udført på ACt data viste en meget god præstation, idet forskelsbehandlingen af ​​CaP versus godartede prøver var opnås med en kombination af 7 gener (

H3, GAS1, SSAT, Clu, AdoMetDC, OAZ, ODC

), ved hjælp af 3 naboer og korrelationen-baserede afstand. Denne klassificering er statistisk signifikant

* p-værdi. 0,01 (t-test). Hvide søjler = Gleason score 7; Grå barer = Gleason score≥7. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien.

I dette arbejde, vi betalte den højeste opmærksomhed til at realisere den bedst mulige kvalitet af væv prøvetagning og karakterisering (figur 1). Dette er absolut nødvendigt at give den høje heterogenitet en prostatakræft prøve. Kombinationen af ​​en “robust” og bredt afprøvet metode til statistisk analyse af data med høj kvalitet eksemplar prøveudtagning tilladt os at opnå den endelige valideret resultat med et datasæt af 66 prøver.

overensstemmelse mellem vores gen signatur klassificering og endelige patologisk klassifikation (CaP versus godartet) opnået ved patolog var (80 ± 5)%, med en følsomhed på (81 ± 6)% og en specificitet på (78 ± 7)%. Vævsprøver, der er blevet fejlklassificeres af molekylær metode, i forhold til patologisk klassifikation, er angivet i tabel 1 (fed). Vi bemærke, at i dette tilfælde en Leave-One-Out cross validering er blevet overvejet, da med N-fold procedure fejlklassificeringer af enkelte prøver kan variere ved hver realisering. Med samme kombination af gener, vi korrekt underklassificeres 84% ​​af tumorprøver med hensyn til patientens alder, 71% med hensyn til endelig RP Gleason score og 42% med hensyn til PSA før RP (tabel 2). Den samme signatur ikke klarer sig godt for klassificering med hensyn til TNM mellemstationer.

Inter-laboratorievalidering metode

En anden laboratorium deltog i en inter-lab validering metode. Hver vævsprøve blev analyseret enkeltvis, bestemmelser var i dobbelte brønde og hvert forsøg blev kørt til 6 gange i både uafhængige laboratorier, med Ct linje sat til samme værdi. Inter-laboratorium variabilitet var mindre end en cyklus for hver enkelt bestemmelse. (Data ikke vist). En sådan variation påvirkede ikke signifikant endelige klassificering.

Så lidt som 1 mg kræft væv inden for 20 mg godartede prøve blev detekteret

Som vist i tabel 1, mængden af ​​kræft væv var kun 5% i 7/31 prøver (svarende til 22,5% af de samlede enheder; 6/7 er korrekt klassificeret), og mindre end 15% i 13/31 prøver (svarende til 42% af de samlede prøver; 10/13 er blevet korrekt klassificeret). Derfor er den relative cancervæv komponent udgjorde kun ca. 1-3 mg væv ud af 20 mg total. Tabel 1 giver en komplet liste over de kliniske tilfælde, hvor hver vævsprøve blev opnået, herunder også kliniske data, klassifikation ved patolog og procent af kræftceller til stede i prøven, udtrykt som en middelværdi mellem præ- og post RNA sektioner (se figur 1)

diskussion

identifikation af nye og præcise molekylære biomarkører:. udfordringen

identifikation af nye og præcise biomarkører for pålidelig molekylær diagnosticering af CaP er en reel udfordring. Tidligere undersøgelser af mikromatrice har identificeret molekylære signaturer, der væsentligt korreleret med CaP progression [27] eller sortering [28], hvilket fører til identifikation af informative gener (undertiden med ukendte funktioner), der stadig afventer yderligere undersøgelser til at belyse deres rolle i CaP progression [ ,,,0],29]. Andre succesfulde studier resulterede i molekylær diagnosticering af CaP, men de var kun baseret på nogle få udvalgte, cancer-specifikke gener. PCA3 er den bedste enkelte CaP forudsigelse: Det er yderst specifik, men følsomheden er relativ lav [30]. I øvrigt har følsomhed ikke bedre, selv når to flere prostata-relaterede gener blev tilsat [24], [25].

En ny og pålidelig metode baseret på en solid tilgang

Vores arbejde giver en pålidelig fremgangsmåde til den molekylære diagnose af CaP der drager fordel af en relativt enkel metode. Den 7-genet model her præsenteres er baseret på bestemmelse af gener, der er kendt for at blive udtrykt i både godartede og kræft væv, og udsat for høj individuel variation. Derfor nyhed af vores tilgang består i at opnå en effektiv molekylær klassifikation af CaP med hensyn til den endelige patologisk diagnose uden brug af gener, som er specifikt meget op- eller nedreguleret i godartet versus kræftvæv. Faktisk er vores arbejde baseret på påvisning og analyse af ekspressionen af ​​gener, der er lang tid kendt for at være fysiologisk udtrykkes såvel som væsentlige for biologi prostataceller. For eksempel er alifatiske polyaminer produceres i meget høje niveauer af prostata-epitelceller og frigives derefter i prostata væske i mM mængder [31] – [33], selv er stadig ukendt den præcise rolle af disse forbindelser. Påvisning af polyaminer i urin var allerede forsøgt lang tid siden til diagnosticering af CaP [34].

For at opnå en pålidelig detektering af vores gen signatur i kræft vævsprøver og gennemføre praktisk brug, vi var nødt til at tage fat på flere tekniske spørgsmål. I mangel af en dedikeret særligt redskab eller instrument, udvikling af en “sandwich” procedure var nødvendig for at opnå morfologiske og molekylære data fra de samme vævsprøver (figur 1).

Statistisk analyse

i tidligere udgivelser, der arbejder med både dyr [14] og menneskelige [3], [4] CaP-modeller, vi har demonstreret strengt relaterede forskydninger i ekspressionen af ​​alle gener undersøgt. Ikke desto mindre viste REST analyse, at den relative ekspression af 7 gener udover CLU ikke nåede statistisk signifikans i malignitet. Det var en eller anden måde uventet. Vanskeligheden ved at forfølge en molekylær tilgang til CaP diagnose i den virkelige kliniske indstilling er indlysende. Men dette resultat kan forklares ved det faktum, at polyamin gener ekspression vides at være kendetegnet ved høj individuel variation i vævsprøverne analyseres. Alligevel har dette ikke bringe vores analyse, fordi den molekylære klassificering af vævsprøver her præsenterede tager hensyn til hele genet signatur, detektering af en signifikant forskel i hele genekspressionsprofilen uanset individuelle variationer. Det endelige resultat er, at den integrerede ekspressionsmønster er signifikant forskellig hos CaP versus godartede kontroller. Denne hidtil ukendte fremgangsmåde er lykkedes ved hjælp af NN klassificeringen, en statistisk metode kendt at klare sig godt specifikt til klassificering kræft selv sammenlignet med andre sofistikerede metoder [35], [36]. NN er en parametrisk metode, der tilhører klassen af ​​”robuste” klassificører [37]. NN er kendt for at gøre en god præstation, hvor grænsen mellem de to klasser til at blive diskrimineret, ikke entydig fra det geometriske synspunkt. Denne betingelse sker ofte i kliniske forsøg, hvor individuelle variationer kan være meget højere i forhold til laboratorieprøver opnået fra

in vitro

eksperimenter, der giver “fuzzy” grænser, som kan skyldes komplekse genekspression profiler. NN er næsten ikke fornuftigt at begrænset prøveudtagning af klasserne, der skal diskrimineres på grund af det meget begrænsede antal parametre (nemlig valget af afstanden funktion og antallet af naboer). Ikke desto mindre, NN gør meget gode klassificering forestillinger også i forhold til andre multiparametric velkendte klassificører som neurale netværk eller Support Vector Machines, metoder, som opnår optimal ydeevne, når store datasæt er tilgængelige.

Til dato, at den bedste fremgangsmåde nå en endelig evaluering om udførelsen af ​​selv en “robust” statistisk klassificeringen som NN er at genbruge de indsamlede data både for uddannelse og validering af den valgte klassificeringen: denne procedure er almindeligvis omtales som krydsvalidering (godt beskrevet i mange ” klassiske “statistiske bøger [37]). I N-fold krydsvalidering, er datasættet tilfældigt opdelt i N dele, og hver del anvendes som en validering indstillet med den anden som træningssættet. Under disse arbejdsbetingelser klassificeringen ydeevne varierer for hver tilfældig realisering. Vi anvendte denne procedure både med en 5 gange (ikke vist) og en 10-fold krydsvalidering, og opnåede samme ydeevne. På grund af ovenstående, det opnås ved NN + resultat 10-fold cross valideringsprocedure kan betragtes som meget pålidelige, selv med en lille størrelse datasæt. Den samme statistiske metode er blevet brugt allerede at analysere og validere genekspression signaturer i kræftforskningen [38], [39].

Under disse betingelser blev den bedste klassificering ydeevne opnås med en 7-gen model (

H3

,

GAS1

,

SSAT

,

CLU

,

AdoMetDC

,

OAZ

og

ODC

). Den overensstemmelse mellem molekylære og sidste patologisk klassifikation havde en nøjagtighed (80 ± 5)% med en følsomhed på (81 ± 6)% og en specificitet på (78 ± 7)%. Dette resultat viser, at diagnosticering af CaP af molekylære data alene er muligt

Genet signatur registrerer meget få kræftceller:. Kræften felt effekt

Især vores metode viste en meget høj følsomhed arbejder på en samling af Cap vævsprøver, hvori en væsentlig del af den samlede, nemlig 7/31, blev anset CaP på grundlag af kun 5% af cancerceller. Dette er baggrunden for kun 1 mg kræft væv til stede i alt 20 mg. En begrundelse konsekvens af dette resultat er, at molekylære begivenheder detekteret i præ-malign væv eller i væv støder op til kræft har givet diagnostiske oplysninger, støtter hypotesen om, at en molekylær tilgang til CaP diagnose ville være en mere følsom og kraftfuldt værktøj end morfologisk undersøgelse. Dette resultat er i overensstemmelse med “cancer field effect”, som for nylig hypotese. Ifølge denne ide, transformerede celler rækker ud over morfologisk tydelige tumor. Disse arrangementer vil gå forud udvikling af malignitet, fordi normalt udseende prostata væv kan undergå genetiske ændringer som reaktion på, eller i forventning om, morfologisk kræft [40]. For nylig, felt virkninger baseret på epigenetiske begivenheder [41], matrix ændringer nukleare [42], androgenreceptor immunoreaktivitet i stroma omkring kræft læsion [43] er blevet opdaget. Under anvendelse af oligonukleotid mikroanalyse, en anden bekræftelse afledt ved en undersøgelse, hvor udtrykket profiler af primær prostatacancer, tilstødende normale væv og normalt væv fra tumor free donorer blev sammenlignet [44]. Dette scenario styrker kravet om objektive molekylærbiologiske markører for den aggressive fænotype at løse usikkerhed med hensyn til identifikation af de prækursorer læsioner, der er mest tilbøjelige til at udvikle sig til invasiv og metastatisk prostatacancer. Den mest sandsynlige forklaring på fejltarifering mellem molekylære og morfologiske data opnået i vores undersøgelse er, at meget tidlige molekylære ændringer kan gå forud ændring af morfologi, og derfor disse betingelser ville ikke overlappe (eller være forbundet med) den patologiske respons. Molekylære ændringer foregående ændringer i fænotype ville blive detekteret af den molekylære fremgangsmåde til diagnosticering, øge dens følsomhed og forklare, hvorfor 7 prøver (tabel 1, fed) blev betragtet som kræft af genet signatur metode, mens den patologiske klassifikation var godartede. I denne forbindelse vil højere følsomhed af fremgangsmåden resultere i at reducere antallet af prøver, der skal træffes, med en klar fordel for patienten. Det er kendt, at følsomheden af ​​biopsi er et potentielt problem, der forklarer, hvorfor saturation biopsier skal tages fra patienter. Proceduren for at mætte prostata med biopsier efter volumen for at opretholde en konstant tæthed af sondering blev udviklet for at forbedre CaP opdagelse sats, og prostata biopsier er flere og oftere bliver mætning biopsier [45]. Mætning biopsi kan overvejes til patienter med risiko for kræft, der er villige til at acceptere de bivirkninger, men det er kendt, at der kan påvises klinisk ubetydelige kræftformer [46].

På den anden side, måske det samme rationale også forklare det modsatte resultat. Faktisk er sammenhængen mellem morfologiske læsioner (dvs. HG-PIN) og klinisk CaP er stadig et spørgsmål om forhandling [47], [48]. Også PIN repræsenterer en “feltet effekt” med et potentiale for kræft progression, men kan ikke direkte involveret i eller måske ikke føre til udvikling af invasiv prostatakræft [49]. Derfor kunne vi hypotesen, at visse ændringer i morfologi måske ikke obligatorisk være forbundet til klinisk relevante celle transformation. Således eksemplarer klassificeret som godartet ved den molekylære værktøj, men kræft i stedet af patologen grund af ændret morfologi (5/31, tabel 1, fed kursiv), kan faktisk være forskellige morfologiske enheder eller klinisk indolente læsioner, eventuelt undergår regression, fordi omgivet af omsætning af væv. Hvis det er tilfældet, vil dette materiale ikke være af betydning fra et klinisk synspunkt, men klart adskiller på molekylært grundlag fra aggressiv sygdom, selv om vi ikke har nogen endegyldige bevis for dette i øjeblikket.

Clusterin og prostatakræft

CLU

blev klonet, sekventeret og identificeret som den største opreguleret gen under massiv induktion af apoptose og prostata regression forårsaget af androgen udtynding [7] eller administration af Finasteride [50] og D-vitamin analoger [51], [52]. Den glykosyleret, ekstracellulære form for Clu produceres på højt basalt niveau af prostata celler og udskilles i prostata væske, selv om dens mulige rolle i reproduktion stadig gådefuldt forskerne [53].

Forfattere har foreslået, at CLU måske være over-udtrykkes i celler overlever apoptose, og ikke i celler dømt til at dø. Således er der foreslået en cytobeskyttende rolle for CLU [54]. Debatten om dette spørgsmål er stadig helt åbent. Det har for nylig vist, at forskellige protein former kan stamme fra det samme gen ved stadig ukendt mekanismer [8]. TGF-beta og røntgenstrålebehandling inducere en trunkeret form af CLU der lokaliserer til nucleus [55] – [58]. Det menes, at forskellige former for CLU har forskellige roller i humane celler [8], også afhængigt af deres sub-cellulære lokalisering. Strukturel oplysninger om sådanne protein former er stadig sparsomme. Data om den mulige inddragelse af

CLU

i transformation og tumorvækst er stadig uklart eller selvmodsigende i litteraturen.

REST relative udtryk analyse viste (data ikke vist), at nedregulering af

CLU

i CaP prøver er statistisk signifikant (p = 0,023). Dette er i overensstemmelse med vores tidligere resultater [3], [13]. Selvom det specifikke spørgsmål om, hvorvidt Clu er op- eller nedreguleret i CaP er stadig kontroversiel [3], [13], [15], [59] – [61], bekræftende data understøtter vores hypotese, at Clu er ikke kun ned -regulated i CaP, men også i de fleste kræftformer, kan nemt hentes fra Oncomine websted, der indsamler data fra mere end 20.000 uafhængige microarray eksperimenter (https://www.oncomine.org). Vi har tidligere foreslået, at CLU kunne være en potentiel tumor-suppressor gen [51] gennem sit nukleare formular nCLU [57], [63], [64].

Potentiel prognostisk værdi af metoden

Vi har tidligere fundet, at vores informative gener har prognostisk værdi [3], [4]. Det vides, at Gleason score er den bedste enkelt indikator for CaP prognose [65], men forudsigelse af resultatet i 6-7 score interval, der omfatter de fleste af de kliniske tilfælde, ikke er tilfredsstillende [65]. Vi havde 28/41 patienter i disse betingelser i vores bio-bank (tabel 1). Desværre denne analyse, som gjort før [4], kræver endelige udfald data om hele kohorte af patient, og dermed et minimum af en 5-års follow-up undersøgelse vil være nødvendigt som tidligere gjort [4]. Vi opfordres kraftigt til at forfølge denne mulighed, fordi vores informative gener er blevet allerede fundet af prognostisk værdi, ikke kun i menneskelig CaP [4], men også i Vagabonden musemodel. Disse dyr blev behandlet med grøn tecatechiner (GTCs) til hæmning af CaP progression [19]. I denne eksperimentelle model, vores gen signatur var i stand til effektivt at diskriminere CaP vævsprøver af TRAMP-mus responderede på GTCs behandling fra dem, der ikke-reagerer derfor tyder på, at den biologiske adfærd CaP måske held undersøgt også i mennesker af samme fremgangsmåde.

i tabel 2 er det også vist, at kombinationen af ​​7 gener (

H3

,

GAS1

,

H3

,

SSAT

,

CLU

,

AdoMetDC

,

OAZ

,

ODC

) klassificeres korrekt 84% af kræft prøver med hensyn til patientens alder, 71% med hensyn til RP Gleason score og 42% med hensyn til PSA. Fejlklassificering med hensyn til PSA var faktisk forventet, fordi PSA er ikke en prostata tumor men, mere korrekt, et prostatavæv specifik markør. Som en kendsgerning, også PSA cut-off-værdier og Cap opdagelse satser stadig et spørgsmål om debat [1]. I stedet fik vi en meget god præstation på klassificering af alder og Gleason score, både almindeligt anvendt til klinisk behandling af patienter, med Gleason score er den bedste forudsigelse [65]. Også disse resultater tyder på, at vores tilgang er at opdage vigtige biologiske begivenheder under prostata celletransformation og cancer progression.

Af de ovennævnte grunde vil det være afgørende at fortsætte denne undersøgelse ved at indsamle kliniske opfølgende data, med en