PLoS ONE: Indvirkning på Disease Udvikling, Genomisk Beliggenhed og biologiske funktion af Copy Number Ændringer i ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Lungekræft, hvoraf mere end 80% er ikke-småcellet, er den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA. Kopital ændringer (CNA’er) i lungecancer har vist sig at være

positionsmæssigt

grupperet i visse genomiske regioner. Men det er uklart, om gener med kopi nummerændringer er

funktionelt

klynger. Ved hjælp af en tæt enkelt-nukleotid polymorfisme-array, udførte vi hele genomet kopital analyser af en stor samling af ikke-småcellede tumorer (n = 301). Vi foreslog en formel statistisk test for CNAs mellem forskellige grupper (fx ikke-involveret lunge vs. tumorer, tidlige vs sene stadie tumorer). Vi tilpasset også genet sæt berigelse analyse (GSEA) algoritme til at undersøge overrepræsentation af gener med CNA’erne i foruddefinerede biologiske veje og gen-apparater (dvs.

funktionel

klyngedannelse). Vi fandt, at CNA’er begivenheder stige væsentligt fra kimcellelinje, tidligt til sent stadium tumor. Foruden genomisk position, CNAs tendens til at opstå væk fra genet steder, især i germlinie, ikke-involverede væv og tidlig fase tumorer. En sådan tendens falder fra kimcellelinje til tidligt tidspunkt og derefter til sene fase tumorer, hvilket tyder på en lempelse af udvalg under tumor progression. Endvidere blev gener med CNAs i ikke-småcellet tumorer beriget med visse gensæt og biologiske veje, der spiller afgørende roller i onkogenese og cancer progression, hvilket viser det funktionelle aspekt af CNA’erne i forbindelse med biologiske veje, der tidligere var overses. Vi konkluderer, at CNAs stigning med sygdomsprogression og CNAs er begge

positionelt

og

funktionelt

klynger. De potentielle funktionelle egenskaber erhvervet via CNAs kan være tilstrækkeligt til normale celler til at transformere sig til maligne celler

Henvisning:. Huang Y-T, Lin X, Chirieac LR, McGovern R, Wain JC, Heist RS, et al. (2011) Indvirkning på Disease Udvikling, Genomisk Beliggenhed og biologiske funktion af Copy Number Ændringer i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 6 (8): e22961. doi: 10,1371 /journal.pone.0022961

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: Marts 28, 2011; Accepteret: 2 juli 2011; Udgivet: 2 August, 2011

Copyright: © 2011 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af US National Institutes of Health (https://www.nih.gov/) giver ingen. CA092824 (D.C.C.), CA074386 (D.C.C.), CA090578 (D.C.C.); og norske Cancer Society (https://www.kreftforeningen.no/english)(A.H.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft, hvoraf mere end 80% er ikke-småcellet type (NSCLC), er den anden mest almindelige cancer og den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald i USA [1]. Det har vist sig i tidligere undersøgelser, NSCLC tumor har flere genomiske ændringer i specifik region af kromosomer, herunder kopi nummer gevinster delvise eller hele kromosomale våben på 1q, 3q, 5p og 8Q, og de tab kopi på 3p, 6Q, 8p, 9p, 13q og 17q [2], [3]. Det vil sige, behøver kopi nummer ændringer i lungekræft ikke tilfældigt i genomet, men er

positionelt

grupperet. Men hvor den ikke-tilfældighed kommer fra, og desuden, om de gener med kopi nummerændringer er også

funktionelt

klynger fortsat uklart. Målet med denne undersøgelse er at karakterisere de genom-dækkende kopi nummer profiler i ikke-småcellet lungekræft både

positionelt

og

funktionelt

.

Vi har samlet 301 NSCLC tumor prøver sammen med 63 parrede blodprøver og parrede tilstødende 50 normale vævsprøver. Blandt tumorprøver, en delmængde af dem er senfase (n = 25). Med heterogeniteten af ​​disse prøver, er vi i stand til at etablere en genomisk model af sygdom udvikling fra kimcellelinje genom (blod) eller præ-kræft genom (tilstødende ikke-involveret væv), til tidlig fase tumor genom og derefter til sent stadium tumor genom. Denne model gør det også muligt for os at studere tendenser i genom-dækkende kopi nummer forandringer (CNAs) mønster og dets udvalg effekter. Ud over at fokusere på CNA’er profil i tumorprøver som tidligere undersøgelser, vi her yderligere undersøgt forskellen på CNA’erne i ikke-involveret væv, tidligt stadium og sent tidspunkt samt mellem adenocarcinom og pladecellekræft. For at udføre en formel statistisk test af hele genomet CNAs mønster mellem forskellige grupper, foreslog vi en permutation-baseret global test, ved hvilken multiple sammenligninger, er korrelation af kopiantal og placering af probe loci fuldt justeret.

gensæt berigelse analyse (GSEA) blev oprindeligt udviklet til analyser af ekspressionsvektorer arrays og blev anvendt til at identificere overrepræsentation af gener, der tilhører en bestemt biologisk kategori, der er forbundet med biologiske fænotyper (f.eks stadium, histologi) [4]. Molekylær Signatur Database (MSigDB) er en samling af kurateret gen sæt til brug med GSEA. Her viser vi, at med ændring af permutationen ordning kan GSEA tilpasses til at udforske overrepræsentation af gener med CNAs på foruddefinerede MSigDB gen sæt (dvs. “

funktionel

klynger”).

i “kromosomale teori om kræft”, er tumorigenese initieret af aneuploidi [5], [6]. For tumorigenese, er blevet foreslået seks nødvendige erhvervede kompetencer: selvforsyning med vækstsignaler, ufølsomhed over for anti-vækst-signaler, unddrage apoptose, grænseløs replikativ potentiale, vedvarende angiogenese og væv invasion og metastase [7]. Da vi hypotesen, at der er funktionel gruppering af gener med CNAs, søgte vi at undersøge, om CNAs er tilstrækkelig mekanistisk strategi om at købe de ovennævnte kapaciteter; det vil sige, hvorvidt den funktionelle gruppering af gener med CNAs giver dokumentation for den kromosomale teori om kræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Undersøgelsen blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelser MGH, Harvard School of Public Health, og det norske Datatilsynet, og den lokale regionale udvalg for medicinsk forskning.

Undersøgelse befolkning og prøver

En serie af 301 snap-frosne tumorprøver fra NSCLC patienter blev indsamlet under operation eller biopsi fra Massachusetts General Hospital (MGH), Boston, MA og National Institute of Occupational Health, Oslo, Norge. Vi inkluderede også 50 ekstra eksemplarer af parret ikke-neoplastisk lungeparenkym fra de norske patienter og 63 parrede blodprøver fra MGH patienter, som alle blev brugt som referencegruppe kopi nummer estimering.

DNA kvalitet, histopatologi og GeneChip

DNA-prøver blev ekstraheret fra tumor og ikke-neoplastiske lungeparenkym efter manuel mikrodissektion af 5-u histopatologiske sektioner. For DNA fra MGH patienter, en patolog (L.R.C.) som ikke havde kendskab til den kliniske og genetiske information gennemgået alle sektioner for hver patient. Hver prøve blev evalueret for mængden og kvaliteten af ​​tumorceller og histologisk klassificeres ved anvendelse af WHO kriterier. De norske prøver blev alle resekteres indsamlet og fremstillet på den samme måde. Prøver med mindre end 70% af kræft cellularitet, utilstrækkelig DNA-koncentration ( 50 ng /uL), eller en udtværing mønster i gelelektroforese var ikke medtaget til genotypning. I alt 414 DNA-prøver (301 fra tumorer, 63 fra parrede blodprøver og 50 fra parrede ikke-involverede lunge prøver) blev hybridiseret på Affymetrix 250K Nsp GeneChip®, som indeholder 262,264 prober (256,554 sonder på somatiske kromosomer og 5.710 sonder på sex kromosom).

data forbehandlingsfasen

Kopier numre blev opnået med dChip software [8]. Probe intensiteter blev beregnet ved modelbaseret ekspression efter invariant sæt normalisering. For hver SNP i hver prøve, blev den rå kopi nummer opgjort som signal × 2 ÷ (gennemsnitlig signal af referenceprøver på denne SNP) ved hjælp af blod og vævsprøver ikke-neoplastiske som referent. Afledte kopi tal blev beregnet ud fra de rå kopi numre ved median udglatning med vinduet af 11 SNPs for hvert locus af 262,264 SNPs. Kun 256.554 sonder på somatiske kromosomer blev analyseret. De SNP sonder blev kortlagt til RefSeq gener med 2 kb udvidelse både opstrøms og nedstrøms ved hjælp af UCSC Genome Browser. Blandt de 256,554 sonder på somatiske kromosomer, blev 104,256 sonder kortlagt til 11.700 gener.

Statistisk analyse

Kopiér nummer gevinster og tab blev analyseret separat. Kopier nummer gevinster blev defineret som udledes kopiantal (CN) ≥2.7 og kopiere nummer tab blev defineret som udledes kopiantal ≤1.3. Cut-offs blev valgt til at opdage kopi nummer ≥3 og ≤1 ved at tolerere 30% normalt forurening væv. Bemærk, at 70% kræft cellularitet var grænsen for vores patologisk kontrol af kvaliteten. Udbredelsen af ​​de forsøgspersoner med CNAs blev plottet over genomet. For hvert locus, blev antallet af patienter, der har CNAs antages at følge en binomialfordeling med prøven størrelse som det samlede antal emner og nul sandsynlighed estimeres empirisk fra data: samlede sonder med CN≥2.7 (eller CN≤1.3) ÷ (256.554 × stikprøvestørrelse). Betydning i genom-dækkende kopiantal ændringer blev bestemt ved at beregne de nøjagtige p-værdier for hver af de 256.554 loci, og Q-værdier blev beregnet til at styre for multiple sammenligninger på tværs genomet ved hjælp af falske opdagelse sats [9], [10]. For hvert gen kortlagt af flere sonder, sonden med den højeste andel af prøver med CNAs, eller ækvivalent, blev den mindste p-værdi valgt til at repræsentere CNA’er funktionen af ​​genet.

Her har vi foreslået en permutation-baserede global test for genom-dækkende CNA’er mønstre mellem to grupper var forskellige, vi anvendt to-sample tests for binomial data ved at beregne den standardiserede forskel på to andele for hvert locus som: hvor

p

ji

er den skønnede andel (stabiliseret ved at tilsætte 0,5 i tælleren) til KN gevinster (eller tab) for gruppe

j dele på locus

jeg

og

n

j

er stikprøvestørrelsen i gruppe

j

. Vi opsummerede

d

jeg

2 over

jeg

tværs af de 256,554 loci at beregne den observerede samlede standardiserede kvadreret forskel (

D

observeret

) på tværs af genomet. Ved permutering de to grupper og udføre ovenstående procedure for 10.000 gange, opnåede vi en ikke-parametrisk null distribution (

D

null

). Så p-værdier blev opnået ved at sammenligne

D

observeret

D

null

. Fordelen ved denne foreslåede test er, at det giver et gyldigt global test for den samlede genom-dækkende forskel ved tegner sig for flere sammenligninger og korrelation af CNAs mellem forskellige loci.

Brug den globale test beskrevet ovenfor, testede vi genom-dækkende CNA’er mønstre mellem blod og tumorer, ikke-involveret lunge- og tumorer, tidlig stadie og sene stadie tumorer, tidlig fase adenocarcinom og pladecellecarcinom tumorer (figur 1). For yderligere at bekræfte resultaterne, udførte vi følgende matchede analyser. Da blodet og ikke-involveret lung prøver blev parret med delmængde af tumorprøver, kan vi sammenligne forskellen af ​​genom-dækkende CNAs begrænset til dem med tilgængelige prøver på blod og tumorer eller på ikke-involveret og tumorer. For hver sent stadium tumor, valgte vi en tilsvarende tidlig fase tumor prøve med nærmeste ryger pakke-år. Fordelingen af ​​køn, histologi og rygning pack-år viste ingen signifikant forskel i de matchede tidlige og sene fase tumorer. De matchede analyser viste lignende resultater som dem i figur 1. (Figur S2)

x-aksen repræsenterer genomiske steder, som blev bestilt af de somatiske kromosomer. Y-aksen repræsenterer forekomsten (%) af NSCLC-patienter, der har kopiantal ≥2.7 (rød eller pink) og ≤1.3 (blå eller lyseblå) i ikke-involverede lungevæv og total tumor (A), tidligt stadium tumor og sen fase tumor (B), tidligt stadium tumor adenocarcinom (C) og tidligt stadium tumor af pladecellecarcinom (SCC) (D). De tilsvarende plot af -log

10 (q-værdier) er vist i fig. S1. De p-værdier for sammenligning af genom-dækkende CNA’er mønstre mellem ikke-involverede vævsprøver og totale tumorer er 0,0001 for gevinster og 0,40 for tab ved permutation-baserede globale test med detaljer, der er beskrevet i Methods. De p-værdier, der sammenligner tidligt og sent stadie tumorer er 0,0001 for gevinster og 0,046 for tab; de p-værdier, der sammenligner tidlig fase adenocarcinom (C) og tidligt pladecellekræft (D) er 0,016 for gevinster og 0,027 for tab.

Både de samlede prober (TP) og sonderne lokalisere inden gener (GP), hvori CNAs blev påvist, blev beregnet for hvert individ. Sammenligning af TP og GP tværs af forskellige undergrupper tillader studere mønstret for udvælgelse af genomiske regioner, hvor CNAs forekomme, under den antagelse, at proberne på chippen blev valgt tilfældigt uden hensyntagen bindingsuligevægt. Forholdet mellem GP vs. TP (betegnet som G /T-forhold) blev beregnet til at anslå udvælgelsen af ​​CNA’er i forhold til genet placering. Under nul hypotesen, at CNAs tilfældigt i forhold til hvor gener lokalisere, ville vi forvente, at nul-forhold på 104.256 /256.554 = 40,64%, hvor 104.256 er antallet af sonder i gener på chippen. Ved at sammenligne G /T-forhold til nul-forholdet 40,64%, var vi i stand til at teste, om CNAs forekom fortrinsvis væk fra gener. Sammenligning G /T i forskellige undergrupper (fx kimcellelinje vs. tumor) aktiveret os at undersøge omfanget af denne præferentielle udvælgelse blandt forskellige grupper. Sammenligningerne af TP, GP eller G /T-forhold mellem to grupper blev udført ved anvendelse af uparret tosidet Student t-test under forudsætning af ulige varianser.

gensæt analyser blev udført ved anvendelse af den modificerede Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) algoritme . GSEA blev oprindeligt foreslået til gen-udtryk mellem grupper [4]. Da vi ikke har forsøgt at knytte CNA’er med andre kovariater men blot undersøge berigelse af CNA’erne i en enkelt gruppe, vi ændrede algoritmen vedrørende generering af null fordeling af berigelse score. Vi er interesseret i, om CNAs i et gen sæt er betydeligt højere end andre gen-sæt. I stedet for permutering gruppen etiketten, vi ionbyttet gen etiketter til 20.000 gange for at skabe den null distribution. Opdagelsen (n = 151) og validering sæt (n = 150) tilfældigt plukket fra de 301 tumorerne var ens i mange demografiske og kliniske karakteristika. (Tabel S1) Primær analyse blev udført ved hjælp af de opnåede data og validering blev udført ved hjælp af validering datasæt. Kun gen-apparater, der var signifikant (p 0,05) i begge sæt blev rapporteret. De gen-sæt analyseret i denne undersøgelse blev taget fra Molecular signaturer Database (MSigDB) i Harvard /MIT Broad Institute, herunder gen familier, kurateret gen-apparater og gen-ontologi gen sæt. Kun 1619 gen-sæt med mindst 15 gen medlemmer i vores data blev analyseret for at opnå robusthed.

Resultater

CNAs og sygdom udvikling

En serie af 301 tumorprøver blev opsamlet fra NSCLC patienter, er kendetegnene for hvilke vist i tabel S1. Genomet af blod eller ikke-involveret lungevæv havde væsentligt færre CNA’er begivenheder end gjorde tumoren genomet, især i kopital gevinster (tab: p = 0,038 i blod vs. tumor, p = 0,40 i ikke-involveret væv vs. tumor; gevinster: p 0,0001 i begge) (figur 1A). De falske opdagelse satser (q værdier) på den 256.554 loci for blod, ikke-involveret væv, tumorer (i alt ved klinisk stadium eller ved histologi) er vist i figur S1. Der var betydelige CNAs på kromosomerne 3, 5 og 8, illustreret i figurer S3, S4 og S5. Fordi Affymetrix® 250K NSP GeneChip sonder blev udvalgt tilfældigt på tværs genomet, er det rimeligt at antage, at antallet af sonderne, der registrerer kopital ændringer er proportional med genomisk span CNA’er begivenheder. Det gennemsnitlige antal af prober, der registrerer kopital gevinster var 718 i blod og ikke-involveret væv, hvilket var meget lavere end den 19.469 i tumor (p 2,20 × 10

-16) (figur 2A). Mønstret blev også fundet i kopital tab (950 vs. 2586, p = 0,0029) (Figur 2B). Desuden er der flere kopi nummer gevinster end kopital tab i tumorer (p 2,20 × 10

-16), hvilket tyder på, at kopi nummer tabene er mere skadelig [11]

A, B. , greverne af de samlede sonder (TP), hvor CNA’er begivenheder (A: kopital gevinster, B: kopital tab) forekommer blev plottet for blod og ikke-involveret væv, total tumor, tidligt stadium tumor, sent stadium tumor, tidligt stadium adenocarcinom (ACA) og tidligt pladecellecarcinom (SCC). C, D, greverne af sonderne inden gener (GP), hvor CNA’er arrangementer (C: kopital gevinster, D: kopi nummer tab) blev påvist i de samme seks undergrupper. E, F, Mean og dens 95% konfidensinterval på G /T-forhold i de seks undergrupper for kopi nummer gevinster (E) og tab (F); og de stiplede linier repræsenterer null G /T-forhold på chippen (104.256 /256.554 = 40,64%). Ikke-tumor: blod (n = 63) og ikke-involveret væv (n = 50); Alle tumor: samlede 301 NSCLC tumorer; Tidligt tumor: trin I og II NSCLC tumorer (n = 246); Sent tumor: stage III og IV NSCLC tumorer (n = 25); Tidlig ACA: tidlige fase adenocarcinom tumorer (n = 208); Tidlig SCC: tidlige fase pladecellekræft tumorer (n = 93)

Forekomsten af ​​CNA’er hændelser blandt NSCLC patienter var forbundet med klinisk fase, især i opformering.. Andelen af ​​patienter med kopital ændringer i sent stadium tumor var mere end dobbelt af det i tidligt stadium. (Figur 1B) mellem de to grupper, udførte vi de globale test til parrede forskel på andelen af ​​CNA’er for hvert locus tværs af genomet, og viste meget signifikant forskel i gevinster ( 0,0001) og en marginalt signifikant forskel i tab ( p = 0,046) efter tegner sig for flere sammenligninger. Tilsvarende det gennemsnitlige antal sonder, der registrerer kopital gevinster var 14.029 i tidligt stadium og 45.792 i sent stadium (p = 4,94 × 10

-14) (figur 2A). For kopi nummer tab, de var 2419 og 4395, (p = 0,076) (Figur 2B). Eksklusive dem med adjuverende kemo- eller radio-terapi stadig bevaret den betydelige udvikling og de tilsvarende tal (p-værdi) var 8501 og 41.608 (p = 5,43 × 10

-5) i gevinster og 2099 og 5947 (p = 0,017) . Adenocarcinom og pladecellecarcinom subtyper viser en signifikant forskel i afprøvning parret andel (figur 1C og 1D) (p = 0,016 i gevinster og p = 0,027 i tab), men ingen forskel i den samlede CNA’er hændelser (figur 2A og 2B) (p = 0,44 i gevinster og p = 0,29 i tab), hvilket indikerer, at genom-dækkende CNA’er mønstre af de to celletyper kan være forskellige, selvom antallet af hændelser i alt er ens.

CNAs udvalg af gen placering og sygdom udvikling

Ved at beregne G /T-forhold (se materialer og metoder), undersøgte vi udvælgelsen af ​​CNA’er med hensyn til gen-steder under udviklingen af ​​kræft. I blod eller ikke-involverede væv, G /T-forhold var lavere end nul (40,64%) hos gevinster (31,71%, p = 0,00098) og tab (30,38%, p = 0,0014) (Figur 2E og 2F), der angiver, at CNA’er begivenheder er mere tilbøjelige til at ske uden gener i kimcellelinje som følge af naturlig udvælgelse. I tumor-genomet, findes udvælgelsen virkning stadig, selv om det er blevet lempet til en vis grad. Det vil sige, at G /T-forhold i tumorer var væsentligt højere end i kimcellelinje (p = 3,28 × 10

-5 i gevinster, p = 0,015 i tab), men de var stadig betydeligt lavere end nul forhold (39.16 %, p = 0,0068 i gevinster, 37,17%, p = 0,0052 i underskud). Imidlertid blev sådan en markering effekt ikke er observeret i sene fase tumorer, dvs. CNA’er begivenheder har en lignende chance for at forekomme inden for og uden gener.

CNAs i onkogener og tumorsuppressorgener

104.256 ( 40,64%) ud af 256,554 sonder af somatiske kromosomer på chippen blev kortlagt til 11.700 gener med 2 kb udvidelse både opstrøms og nedstrøms til at omfatte promotoren og flankerende regioner. Der var 32 kendte onkogener i hvilken 10% af patienterne havde kopital gevinster (tabel 1) og 16 tumorsuppressorgener, hvori 1% af patienterne havde kopital tab (tabel 2). Vi identificerede også 45 gener (herunder onkogener og ikke-onkogener) med 35% (p≤1.50 × 10

-42), der har kopi nummer amplifikationer (Tabel S2) og 9 gener (

CSMD1

,

SGCZ

,

PDZRN3

,

nisch

,

CACNA2D3

,

UBE2E2

,

MCPH1

,

PHF7

og

DOCK5

) med 10% (p≤1.53 × 10

-21), der har kopi nummer sletninger |

Gene sæt. beriget med CNA’er gener

Da generne med CNAs var under udvælgelsen, vi hypotese, at disse gener bør inddrages i lignende biologiske funktioner, som efterfølgende favoriserer egnethed celler under tumorigenese og /eller cancer celleproliferation. Derfor undersøgte vi nærmere, om gener med CNAs blev beriget i 1619 foruddefinerede gen sæt. For at undgå falske positive resultater ved test 1619 gen-apparater, blev analyserne udført med en opdagelse-og-valideringsprocessen. I opdagelsen sæt blev gener med kopital amplifikationer væsentligt beriget i 152 gensæt (p 0,05); 119 af dem blev valideret i valideringen indstillet på signifikansniveau på 0,05. For kopi nummer sletninger, blev 109 gen-apparater findes i opdagelsen sæt (p 0,05) og 52 blev valideret. Vi undersøgte også de 119 og 52 validerede gen sæt i tidlig fase og sene fase tumorer og kun dem betydeligt beriget i begge undergrupper er rapporteret (89 i gevinster og 27 i tab Borde S3 og S4) Vi præsenterer 26 gen sæt med særlig relevans for tumor biologi, der har berigelse af kopital gevinster eller tab i vores prøver i tabel 3 og 4 og de tilsvarende gen sæt berigelse parceller i figur S6 og S7. Yderligere undersøger gensæt berigelse i blodet og ikke-involveret lungevæv, fandt vi mange af de 89 og 27 validerede gensæt blev også beriget i genomet af ikke-involverede lungevæv, herunder gevinster i G-protein-signalvejen,

EDG1

vej, integrin-medieret cellemigration vej og tab i reglerne i autophagy og mitotisk cellecyklus. (tabel S3 og S4)

Diskussion

genom-dækkende CNAs mønster fra vores analyser svarer til dem, der offentliggøres i tidligere litteratur [2], [3], [12]. Mange af onkogener med kopi nummer amplifikationer rapporteret her er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [13], [14], [15], [16]. Den største styrke i denne undersøgelse er den store stikprøve, tilgængelighed af parrede blod og vævsprøver ikke-involverede og detaljeret demografiske /kliniske oplysninger, opdagelse-valideringsprocessen og de nye statistiske analyser. Den foreslåede globale test for genom-dækkende CNAs giver os muligheder for at teste CNAs forskel ved samtidig at tage de genomiske steder, korrelation af kopi numre og flere sammenligninger i betragtning. Den tilpassede GSEA for CNAs, på den anden side, kan tjene som et nyttigt redskab til at analysere de genom-dækkende kopiantal i den funktionelle og biologiske sammenhæng, der forbinder de sofistikerede CNA’er data til viden om gen-kategorier, biologiske veje og tidligere undersøgelser. Der er stadig begrænsninger i vores undersøgelse. Først kan der opnås blod- og vævsprøver ikke-involverede fra kun delmængde af de 301 patienter. For det andet, er vi i stand til at indsamle de CNA’er data fra normale individer eller patienter uden lungekræft, som kan give os et bedre indblik i, hvordan det hele genomet CNAs profil i NSCLC patienter adskiller sig fra i normale individer eller ikke-kræftpatienter. For det tredje, selv om genet satte analyser kan tjene til at formulere biologiske hypoteser, yderligere undersøgelser for at studere roller gensæt /veje med CNAs i tumorgenese er påkrævet.

DNA materialer analyseret i denne undersøgelse alle kommer fra NSCLC patienter, så genomet af blod og ikke-involverede væv ikke kan betragtes som en normal genom. Vi bruger DNA fra blod, ikke-involveret lungevæv, tidlige fase tumor og sene tumor til at repræsentere de sekventielle stadier af kræft udvikling og progression. Vi opdagede, at kopi nummer ændringer stige med udvikling af kræft, men valget med hensyn til gen-placering falder. Det vil sige, der er en monoton stigning i kopital ændringer fra blod og ikke-involveret lungevæv, at tidligt stadium og derefter videre til senfase tumorer. (Figur 2A og 2B) På den anden side, kopiantal ændringer tendens til at opstå

væk

fra gen placering i blod eller ikke-involveret væv, men denne tendens aftager i tumorer, især i sent stadium. (Fig 2E og 2F) Stigningen i CNAs afspejler akkumulering af somatiske kopital ændringer som følge af genomisk ustabilitet, i hvilket trådløst hypoxisk stress i cancer kan spille en afgørende rolle via forstyrrelse af DNA-replikation og replikation af ikke-sammenhængende DNA-segmenter [17 ], [18].

Ligeledes forventer vi at se ophobning af antallet af gensæt ramt af CNAs fra blod, ikke-involverede væv og derefter til tumoren, frem for den pludselige forekomst i tumoren. Ud af vores rapporteret 89 gen sæt kopi nummer gevinster, antallet af betydelige gen-apparater er 7 i blod, 46 i ikke-involveret væv, 89 i tumorer. (Tabel S3) Ud af de rapporterede 27 gen sæt kopital tab, tallene er 2 i blod, 8 i ikke-involveret væv, 27 i tumorer. (Tabel S4)

Udvalg af CNAs med hensyn til gen-placering under evolutionen er også rapporteret i

Drosophila

[11]. Her viser vi en lignende udvalg virkning i tumoren genomet selv om det er afslappet til en vis grad. Vi hypotesen, at markeringen i tumor forekommer under tidlig udvikling af kræft oven konsekvensen af ​​evolutionære udvælgelse som afspejlet i kimcellelinje. Disse resultater illustrerer, at den rensende udvælgelse forekommer i kimcellelinje som resultat af arter evolution også kan forekomme i tumor som en udvælgelse virkning under onkogenese og tumorprogression. Vi hypotese ligeledes, at de biologiske veje med CNAs vi observerer i tabel S3 og S4 er følgen af ​​en sådan udvælgelse. Det vil sige, kan de store ombygninger ramt mange forskellige gen og biologiske veje tilfældigt, men kun de celler erhverver væksten fordel via CNAs (fx forstærkes onkogen signalvejen eller slettet tumorsuppressorgen pathway) vil overleve og blive dominerende. Konstateringen af, at CNAs tendens til at opstå fra gen afspejler også den ikke-tilfældighed af CNAs forekomst.

Onkogener kan efterligne normal vækst signalering sådan, at kræftcellen mindsker afhængigheden af ​​eksogen vækst stimulering. Således forstærkning af onkogener er et væsentligt skridt i tumorigenese. I lungekræft,

KRAS

,

MYC

,

EGFR

, og

erbB

familie er velkendte onkogener [19], [20], [21], [22], og alle af dem viste sig at være yderst signifikant i kopital gevinster. Desuden gener med kopi nummer amplifikationer var også overrepræsenteret i onkogener som en kategori defineres ved folketællingen af ​​humane cancer gener [23]. Dette fund tyder på, at onkogenese også kan skyldes forskellige sæt af onkogener ud over de ovenfor kendte dem.

Gener med CNAs i NSCLC er også fundet at være stærkt forbundet med gener involveret i andre cancere, herunder leveren , bryst, nyre og pancreascancer. Vi fandt, at gener med kopital gevinster i NSCLC er mere tilbøjelige til at være de højt udtrykte gener i hepatitis C-relateret hepatocellulært carcinom [24] (p = 0,00005) og nyrecellecarcinom [25], [26] (p = 0,020) . Gener med kopiantal amplifikationer også væsentligt beriget i generne af dårlig prognose underskrift brystcancer [27] (s 0,00005), hvilket kan forklare den dårligere prognose af lungecancer end brystcancer. Desuden viste vores analyse generne med kopital gevinster i lungen blev beriget i generne på kromosomerne 7 og 8, vist sig at have kopital-drevet ekspression i pancreas adenocarcinom [28] (p = 0,0033 og 0,00005 henholdsvis) , og dem med kopital tab blev beriget i generne med CNAs på kromosom 9, også forbundet med genekspression i pancreas tumor (p 0,00005). Dette antyder, at genet dosering, som det var, af gener med CNAs i NSCLC kan også være positivt korreleret med ekspressionsniveau. Disse resultater tyder også på, at kræftceller nye fra forskellige væv oprindelser deler lignende maskiner til onkogenese og tumor invasion

Vores gen sæt analyse viser, at cellerne kan erhverve de fælles kapacitet tumor [7] gennem CNA’er:. Gevinster i onkogener (selvforsyning i vækstsignaler, unddrage apoptose), gevinster i

Calpain

vejen (ufølsomhed over for anti-vækst-signaler, væv invasion og metastase, vedvarende angiogenese), gevinster i

EDG1

vej ( unddrage apoptose og selvforsyning i vækstsignaler), gevinster i

erbB

signalering (selvforsyning i vækstsignaler), gevinster i

WNT

signalering (selvforsyning i vækstsignaler), tab i regulering af autophagy (unddrage apoptose), gevinster i telomerase revers transkriptase (

TERT

) (grænseløs replikativ potentiale), og tab i tight junction og celle sammenvoksninger (væv invasion og metastase). Sådanne resultater giver dokumentation af “kromosomal kræft teori” [5], [6]: kræft er en sygdom forårsaget af aneuploidi eller store forandringer af kromosom. Det er fordi den store overlapning eller deletion er mere tilbøjelige til at ændre kopitallet af et stort antal gener i talrige biologiske veje. Men vores resultater ikke uenig med forestillingen om, at overlapning /sletning af et gen spiller en kritisk rolle i udviklingen af ​​kræft. Forekomsten af ​​aneuploidi eller store ændringer kræver et miljø med genom ustabilitet, som sandsynligvis vil blive lettet ved duplikering /deletion eller mutation af gener kritiske i DNA-reparation, rekombination og overlapning.