PLoS ONE: In vitro og in vivo Anti-Cancer aktiviteter af en standardiseret quassinoider Komposition fra Eurycoma longifolia på LNCaP human prostatakræft Cells

Abstrakt

quassinoider er en gruppe af diterpenoider findes i planter fra Simaroubaceae familien . De er også de store bioaktive stoffer findes i

Eurycoma longifolia

som er almindeligt anvendt som traditionel medicin i Sydøstasien til behandling af forskellige lidelser, herunder seksuel dysfunktion og infertilitet. Disse anvendelser tilskrives dets evne til at forbedre testosteron niveau hos mænd. Kronisk forbrug af

E

.

longifolia

ekstrakter er blevet rapporteret at øge testosteron niveauet hos mænd og dyremodel men dens virkning på prostata vækst er fortsat ukendt. Derfor angår den foreliggende undersøgelse undersøger virkningerne af en standardiseret total quassinoider sammensætning (SQ40) indeholdende 40% af de samlede quassinoider fundet i

E

.

longifolia

på LNCaP human prostatacancer-cellelinje. SQ40 inhiberede LNCaP cellevækst ved IC

50 værdi på 5,97 ug /ml, mens IC

50 på RWPE-1 humane prostata normale celler var 59,26 ug /ml. SQ40 også inhiberede 5α-dihydrotestosteron-stimuleret vækst i LNCaP-celler dosisafhængigt. Den inhiberende virkning af SQ40 i forankringsuafhængig vækst af LNCaP-celler blev også demonstreret under anvendelse af blød agar-assay. SQ40 undertrykt LNCaP cellevækst via G

0 /G

1 fase anholdelse, som blev ledsaget af nedregulering af CDK4, CDK2, Cyclin D1 og cyclin D3 og opregulering af p21

WAF1 /Cip1 protein niveauer. SQ40 ved højere koncentrationer eller længere varighed behandling kan forårsage G

2M vækststandsning fører til apoptotisk celledød som demonstreret ved påvisning af poly (ADP-ribose) polymerase spaltning i LNCaP-celler. Desuden SQ40 inhiberede også androgen receptor translokation til kernen, som er vigtigt for transaktivering af sin målgen, prostata-specifikt antigen (PSA) og resulterede i en signifikant reduktion af PSA-sekretion efter behandlingen. Desuden intraperitoneal injektion af 5 og 10 mg /kg af SQ40 også signifikant undertrykte LNCaP tumorvækst på mus xenograftmodel. Resultater fra denne undersøgelse tyder på, at den standardiserede samlede quassinoider komposition fra

E

.

longifolia

fremmer anti-prostatakræft aktiviteter i LNCaP humane prostata kræftceller

Henvisning:. Tong KL, Chan KL, Abubakar S, Low BS, Ma HQ, Wong PF (2015) Den

In vitro

In Vivo

Anti-Cancer aktiviteter af en standardiseret quassinoider Komposition fra

Eurycoma longifolia

på LNCaP menneskelige prostata cancer celler. PLoS ONE 10 (3): e0121752. doi: 10,1371 /journal.pone.0121752

Academic Redaktør: Keith R. Davis, Indiana University, USA

Modtaget: August 15, 2014 Accepteret: 4 februar 2015; Udgivet: Marts 31, 2015

Copyright: © 2015 Tong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Ministeriet for Landbrug og Agro-industri, Malaysia, NKEA Research Grant Scheme (NRGS) -NH0711S001 og University of Malaya /Ministeriet for videregående Uddannelser (UM /MOHE) High Impact Research Grant (HIRG) E00002-20001. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

quassinoider er en gruppe af diterpenoider findes i planter af familien af ​​Simaroubaceae som besidder bioaktiviteter, såsom anti-tumor [1,2], anti-tuberkulose [3], anti-malaria [4,5], anti-ulcus [6,7], insekt vækstregulerende [8], anti-HIV [9] og anti-inflammatorisk [10,11]. Deres anti-cancer aktivitet blev grundigt diskuteret i tidligere anmeldelser [12,13]. Quassinoider blev rapporteret som de vigtigste komponenter, der findes i

Eurycoma longifolia

[14].

E

.

longifolia

tilhører planten familien Simaroubaceae og er lokalt kendt som “Tongkat Ali” eller “Pasak Bumi” i Malaysia og Indonesien, “Ian-Don” i Thailand og “Cay ba binh” i Vietnam [15] .

E

.

longifolia

er en populær krydderurt bruges traditionelt til at forbedre mandlige libido, seksuel tapperhed og frugtbarhed. På grund af sin unikke testosteron øge ejendom, er de rå ekstrakter af denne plante nu almindeligt markedsføres og bruges til at øge mandlige virilitet og korrekt seksuel dysfunktion [14,15]. Flere undersøgelser har vist, at indtagelse af ekstrakten øget produktion af testosteron og bidrog til den forbedrede sædkvaliteten hos mænd med idiopatisk infertilitet og testosteron niveau for sent indsættende hypogonadisme [16], og i androgen-deficient osteoporose dyremodel [17]. Den øgede produktion af testosteron af

E

.

longifolia

er blevet tilskrevet til stigningen i humant choriongonadotropin niveau [18] og hæmning af aktiviteten af ​​phosphodiesterase og aromatase omdannelse af testosteron til østrogen, som efterfølgende udløser hypothalamus-hypofyse-gonade-aksen for at øge testosteron niveauer [ ,,,0],19,20].

Androgener såsom testosteron og 5α-dihydrotestosteron (DHT), er vigtige for udviklingen, modning og funktion af prostata. Alligevel deregulering af androgen receptor (AR) pathway har været impliceret i benigne og maligne prostata lidelser, såsom godartet prostatahypertrofi (BPH) og prostatacancer [21,22]. Eftersom forøgelse af testosteron er blevet forbundet med en forøget risiko for prostata carcinogenese [23], er mitogent i prostataceller [24-26] og har vist sig at være en stærk tumor promotor i gnaver prostata [27], foretog vi den foreliggende undersøgelse for at afgøre, om

E

.

longifolia

ekstrakt fremmer eller hæmmer prostatakræft cellevækst.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Eksperimenter med mus blev udført i overensstemmelse med den protokol, der er godkendt ved det Sundhedsvidenskabelige Fakultet Institutional Animal Care og brug Udvalg, University of Malaya (Etik Referencenummer: 2013/06/07 /PHAR /WPF). Hele Forsøget blev udført i AAALAC International akkrediteret Animal Experimental Enhed for det medicinske fakultet, University of Malaya.

Udarbejdelse af en standardiserede quassinoider komposition fra

E

.

longifolia

En standardiseret quassinoider sammensætning (SQ40) indeholdende 40% af de samlede quassinoider i

E

.

longifolia

blev fremstillet ifølge fremgangsmåden af ​​Low undersøgelse [28]. Kort fortalt de lufttørrede pulveriserede rødder (15 kg) i

E

.

longifolia

blev ekstraheret med 6 x 4 l 95% methanol i 6 dage ved 60 ° C. Den kombinerede methanol ekstrakt ved inddampning til tørhed under delvist vakuum gav en mørkebrun remanens på 450 g (3% vægt /vægt), som var ud kromatograferet på en forpakket Diaion HP 20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan) harpikssøjle. Den valgte quassinoid fraktion, SQ40 blev afledt ved eluering med en gradient af H

2O-MeOH-blandinger (1: 0 til 0: 1) ved faldende polaritet [20], og efterfølgende tørret under delvist vakuum til 45 g ( 10% vægt /vægt af rå ekstrakt). Den HPLC (HPLC) analyse kvantificeres de store quassinoider som 32,16% vægt /vægt i SQ40, bestående 14,49 ± 0,26% af eurycomanone, 7,39 ± 0,17% epoxyeurycomanone, 0,72 ± 0,06% 13,21-dihydroeurycomanone og 9,54 ± 0,22% vægt /vægt eurycomanol [19]. Disse quassinoider blev isoleret og deres rensede strukturer ( 95%) blev identificeret og bekræftet efter protokollen tidligere [29-31] beskrevet. Renheden af ​​forbindelserne blev bestemt med Empower 2 arbejdsstation software (Waters, Milford, MA, USA) betjenes i et Waters Delta Prep HPLC-system udstyret med en Waters 2996 fotodiodegrupperingsdetektor.

Fremstilling af kul-strippet serum (CSS)

Charcoal-strippet serum (CSS) blev fremstillet som tidligere beskrevet at nedbryder vækstfaktorerne stede i serum [32]. Kort beskrevet blev 5 g dextran-belagt trækul (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tilsat til 500 ml føtalt bovint serum (FBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og blandet forsigtigt i 1 time. FBS blev derefter centrifugeret ved 2500 x g i 10 minutter under sterile betingelser. Serum supernatanten blev derefter opsamlet og underkastet en anden cyklus af dextran-coatet trækul behandling. Endelig blev serummet filtreret gennem et 0,2 um porøs membran (Orange Scientific, Braine-l’Alleud, Belgien) og opbevaret ved -20 ° C til yderligere anvendelse. Den sterilitet CSS blev kontrolleret ved at inkubere del af medierne i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 i 14 dage.

Cell kultur

Menneskelig prostatakræft, LNCaP og PC 3 celler, human normal prostata, RWPE-1-celler og human normal lever, blev WRL 68-celler indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). LNCaP-celler blev afledt fra supraclavicular lymfeknude af patient, hvis prostatacancer blev udviser androgenuafhængig vækst. LNCaP-celler er androgen følsomme og udtrykke prostataspecifikt antigen (PSA), prostatisk sur phosphatase og AR [33]. LNCaP-celler har en enkelt punktmutation af codon 868 (Thr til Ala) i androgen-bindende domæne af AR og svare ikke kun til androgener, men også til antiandrogener, østrogener og progestiner [34]. PC-3-celler blev afledt fra knoglemetastaser af en patient med grad IV prostata-adenocarcinom og reagerer ikke på androgener, glucocorticoider eller epidermal eller fibroblastvækstfaktorer [35]. RWPE-1-celler blev den ikke-neoplastiske voksne humane prostata-epitelceller fra perifert zone af en histologisk normal human prostata voksen og blev udødeliggjort med human papillomavirus 18 [36]. LNCaP og PC-3-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640; Invitrogen, Carlsbad, USA) suppleret med 10% volumen /volumen FBS og 1% v /v penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, USA), mens RWPE -1 celler blev dyrket i keratinocyt-serumfrit medium (K-SFM, Invitrogen, Carlsbad, USA) tilsat 0,5% v /v penicillin-streptomycin. WRL 68-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, USA) suppleret med 10% volumen /volumen FBS og 1% v /v penicillin-streptomycin. Alle cellelinjer blev opretholdt ved 37 ° C i fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luften.

Cell levedygtighed assay

Effekten af ​​SQ40 på levedygtigheden af ​​LNCaP, PC 3 blev RWPE-1 og WRL 68-celler bestemt ved 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT; Invitrogen, Carlsbad, USA) assay. Kort beskrevet blev cellerne udpladet på plader med 96 brønde ved optimal celledensitet på ca. 1,5 x 10

4 LNCaP-celler /brønd; 1,25 x 10

4 PC-3 celler /brønd; 1,5 x 10

4 RWPE-1 celler /brønd; 1,25 x 10

4 WRL 68 celler /brønd. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med stigende koncentrationer (2,5-100 ug /ml) af SQ40 i 72 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev MTT-assay udført som tidligere [37] beskrevne. Cellelevedygtigheden blev beregnet som procentdel af cellelevedygtighed sammenlignet med bærer kontrolceller, formålsbestemte som 100% levedygtighed. Endelig halvmaksimal inhiberende koncentration (IC

50) blev bestemt ved anvendelse af GraphPad Prism software version 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

dihydrotestosteron (DHT) behandling

LNCaP-celler behandlet med 5α-androstan-17β-ol-3-on (DHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt til at undersøge reaktionsevnen af ​​disse celler til mitogen stimulering med DHT. Forud for behandlingen, LNCaP-celler blev dyrket i RPMI suppleret med 5% CSS i 48 timer for at forhindre interferens af androgener og andre vækstfaktorer til stede i komplet FBS. Ca. 1,5 x 10

4 LNCaP-celler /brønd blev podet i 96-brønds plade og behandlet med stigende koncentrationer (20-140 nM) af DHT med eller uden 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 i 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet.

blød agar-kolonidannelse assayet

LNCaP-celler blev forbehandlet med SQ40 på sit IC

50 værdi i 72 timer. Før podning på blød agar, blev enkelt cellesuspension opnået ved at passere cellerne gennem en fin nål. Fem tusinde SQ40-behandlede og vehikelkontrollerede celler blev blandet med vækstmedium indeholdende 0,3% agar og podet oven på et basislag indeholdende 0,5% agar i vækstmedier i 60 mm petriskåle. Kulturerne blev inkuberet ved 37 ° C i fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft i yderligere 3 uger. Medierne blev genopfyldes hver 3. dag med frisk vækstmedium. Ved slutpunktet af eksperimentet, kolonier kun større end 0,5 mm, blev talt under mikroskop.

realtid celleproliferation analyse

vækstkinetikken af ​​LNCaP og RWPE-1 celler blev undersøgt real-time af real-Time Cell Analysis (RTCA) System (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) som beskrevet tidligere [37]. Impedansen øges, når adhærente celler vedhæfte og spredt over sensoroverfladen af ​​en elektrode og fald når cellerne runde op og løsnes. Kort beskrevet blev 50 pi afsluttet dyrkningsmedium tilsat til hver brønd af E-plade blev registreret 16 og baggrund læsning. En cellesuspension af 50 pi ved celledensitet på 3,0 x 10

4 celler /brønd blev derefter tilsat i hver brønd på E-plade 16. De ændringer i impedans som følge af cellevedhæftning, proliferation og spredning blev overvåget natten over. Når cellerne indtastede logaritmiske vækstfase, blev cellerne behandlet med 2,5 til 80 ug /ml SQ40. Cellerne behandlet med komplet vækstmedium blev henvist som kontrol køretøjet, mens 5 pM paclitaxel-behandlede celler blev benævnt som positiv kontrol. Cellerne blev derefter overvåget i yderligere 72 timer. De impedansværdier blev udtrykt som Cell Index (CI). De vækstkurver blev normaliseret til CI i den sidst målte tidspunkt før tilsætning af narkotika eller kontrol køretøj.

trypanblå udelukkelse test

Konfluente LNCaP celler blev behandlet med køretøjets dyrkningsmedium, 3 , 6, 12 og 20 ug /ml SQ40 i 72 og 96 timer. LNCaP-celler behandlet med 1 pM paclitaxel i 72 og 96 timer blev anvendt som positiv kontrol og de ubehandlede celler blev anvendt som negativ kontrol, hhv. De behandlede og kontrol køretøj celler blev høstet ved slutpunktet af inkubationstid og cellerne suspensioner blev blandet med 0,4% trypanblåt-opløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved et forhold på 1: 1 og inkuberet i 3- 5 minutter. De farvede og ufarvede celler blev talt under anvendelse af et hæmocytometer kammer. Procentdelen af ​​døde celler ved hver koncentration blev beregnet i overensstemmelse med nedenstående ligning.

(1)

Cell cyklus analyse

Konfluente LNCaP celler blev behandlet med køretøjets dyrkningsmedium, 3, 6 og 12 pg /ml SQ40 i 24, 48 og 72 timer. Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit (BD Biosciences, New Jersey, USA). Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev de behandlede celler høstet, vasket og farvet med propidiumiodid ifølge producentens anvisninger. Efter farvning blev prøverne analyseret ved FACSCanto II flowcytometri (BD Biosciences, New Jersey, USA). Mindst 20.000 begivenheder pr prøve blev registreret for hver prøve, og dataene blev analyseret ved hjælp af flowcytometri DNA Modeling Software, ModFit LT 3.2 (Verity Software House, USA).

immunoblotanalyse

protein ekspression af G

1 /S regulatorer såsom cyclin-afhængig kinase (CDK), CDK4, CDK2, cyclin D1, cyklin D3, p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1 og spaltes-poly (ADP -ribose) polymerase (PARP) blev analyseret ved immunblotting. Cellelysater blev fremstillet ved anvendelse radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) Lysis Buffer System i nærvær af 1% phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) opløsning, 1% natriumorthovanadat opløsning og 1% protease inhibitor cocktail opløsning. Proteinkoncentrationen af ​​cellelysaterne blev bestemt ved Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Walthan, MA). Lige så stor mængde af proteiner blev underkastet 12% natrium docecyl sulfat-polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) og derefter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (porestørrelse 0,45 um, Milipore, Bedford, MA). Membranerne blev derefter undersøgt med primære antistoffer mod CDK4, CDK2, cyclin D1, cyklin D3, p21

WAF1 /Cip1, p27

Kip1 og kløvet-PARP (Asp214) (D64E10) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA ). Dette trin blev efterfulgt af inkubering med de passende sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase. Efter vasketrinene blev proteinbånd visualiseret kolorimetrisk ved anvendelse 3,3,5,5 tetramethylbenzine (TMB, Sigma-Aldrich, Louis, MO) opløsning og kvantificeres ved hjælp af en gel dokumentationssystem (BioRad, Richmond, Calif)

Androgen receptor (AR) og prostataspecifikt antigen (PSA) ELISA

Kort fortalt LNCaP-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 5% CSS i 48 timer. Cellerne blev derefter behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 med eller uden 100 nM DHT i yderligere 72 timer. DHT blev sat til at stimulere AR translokation. Den nukleare fraktion blev opnået fra cellelysatet hjælp Nuclear Extraction Kit (Cayman Chemical, MI, USA) og det nukleare AR blev målt ved hjælp af Nuclear receptor Sandwich AR ELISA (Active Motif, Carlsbad, USA). AR-niveauet blev normaliseret til det totale proteinniveau nukleare. I det samme eksperiment, blev vækstmediet af vehikelkontrollen og behandlede celler opsamlet, og udskilt PSA-niveau blev kvantificeret ved prostataspecifikt antigen Humant ELISA Kit (Abcam, MA, USA). De PSA-værdierne blev normaliseret mod totale antal celler.

In vivo

LNCaP xenograft undersøgelse

Male NCR immundefekte mus, 5 uger gamle, 20-25 gram blev købt fra InVivos Pte. Ltd (Singapore) og opstaldet i individuelt ventilerede bure under specifikke patogenfrie betingelser og vedligeholdes i en 12 timers lys-mørke cyklus ved 24 ° C. Dyrene blev forsynet med sterilt foder og vand ad libitium. Musene blev bedøvet før injektionen af ​​LNCaP-celler (2 x 10

6) med 50% matrigel (0,1 ml; Becton Dickinson, Jersey, USA) i den højre flanke af nøgne mus subkutant. Behandlingen blev indledt, da tumorerne var håndgribelige. Tumorbærende mus blev randomiseret til 4 grupper. Hver gruppe bestod af 6 dyr. Disse grupper af mus blev derefter givet intraperitoneale injektioner af køretøjets opløsning (saltvand), 5 mg /kg af paclitaxel (positiv kontrol), 5 og 10 mg /kg SQ40 tre gange om ugen i 6 uger. Tumorstørrelse blev palpering og længden og bredden blev målt med en passer. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen, 0,5 x længde x bredde

2. Vægten og tumorvolumen af ​​hver mus blev målt en gang om ugen over en periode på 6 uger. Musene blev aflivet, når de tumorknuder nåede 1,5 cm i diameter.

Statistisk analyse

Alle assays blev udført i mindst tre separate forsøg. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Statistiske analyser blev udført under anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA), med Bonferronis multiple sammenligningstest ved anvendelse af GraphPad Prism software (version 5.0). Statistisk signifikans blev udtrykt som *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001 versus køretøj kontrol og

#,

s

0,05;

##

s

0,01;

###,

s

. 0,001 versus 100 nM DHT-stimulerede celler

Resultater

SQ40 selektivt cytotoksisk over for LNCaP prostatacancerceller og hæmmede DHT stimuleret vækst LNCaP celler

In vitro

cytotoksicitet aktivitet SQ40 blev undersøgt på humant normalt prostata, RWPE-1-celler, humant normalt lever, WRL 68 celler, human prostatacancer, PC 3 og LNCaP-celler. De koncentrationer, der forårsagede halvmaksimal inhiberende virkning (IC

50) på RWPE-1 og WRL 68-celler var 59,26 ug /ml og 27,69 pg /ml, (fig. 1, sort og blå linje). SQ40 inhiberede LNCaP cellevækst ved IC

50 af 5,97 ug /ml i en dosisafhængig måde (fig. 1, rød linje). IC

50 værdier af quassinoider sammensætning på RWPE-1 og WRL-68-celler blev højere sammenlignet med den for LNCaP-celler, hvilket antyder, at SQ40 var mere selektiv til LNCaP-cancerceller end normale celler. På den anden side, SQ40 inhiberede 50% af cellevækst på PC-3-celler ved en koncentration højere end (87,94 ug /ml;. Figur 1, grøn linje), som af LNCaP-celler tyder på, at quassinoid fraktion påvirket LNCaP-celler, men ikke PC-3 prostatacancerceller.

RWPE-1 normale prostata celler (sort), WRL 68 normale leverceller (blå), LNCaP (rød) og PC-3 prostatacancerceller (grøn) blev behandlet med stigende koncentrationer (2,5-100 ug /ml) af SQ40 i 72 timer og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse MTT reduktion assay. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM af fire uafhængige forsøg. IC

50 værdier af SQ40 på RWPE-1, WRL 68, LNCaP og PC-3-celler efter 72 timer behandling var 59,26 pg /ml, 27.69 pg /ml, 5,97 ug /ml og 87,94 pg /ml.

Den cytotoksiske effekt af SQ40 blev yderligere vurderet på androgen-stimuleret LNCaP prostata kræftceller. LNCaP-celler blev først lov til at vokse i vækstmedium, der suppleret med 5% CSS og DHT blev tilsat for at stimulere celleproliferation. I nærvær af stigende koncentrationer af DHT blev LNCaP-celler stimuleres til at vokse eksponentielt. Samtidig behandling med 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 inhiberede LNCaP cellevækst med mere end 50% i forhold til celler stimuleret med DHT alene (fig. 2).

LNCaP-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af DHT med eller uden 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 i 72 timer i RPMI 1640 suppleret med 5% CSS og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse reduktion MTT assay. Procentdelen af ​​levedygtige celler blev beregnet i forhold til køretøjets kontrol celler uden DHT behandling. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg.

SQ40 undertrykt forankringsuafhængig vækst LNCaP celler

Effekten af ​​SQ40 på LNCaP celler forankringsuafhængig vækst blev undersøgt ved hjælp af blød agar-assay. LNCaP-celler blev forbehandlet med SQ40 på sit IC

50 værdi for 3 dage før udpladning på blød agar medier ved et lige antal celler med køretøjet kontrolceller. Størrelsen af ​​quassinoider sammensætning behandlet cellekolonier blev markant reduceret sammenlignet med vehikelkontrol cellekolonier (fig. 3A og 3B). Desuden blev kolonidannelse effektiviteten af ​​SQ40-behandlede LNCaP-celler signifikant reduceret sammenlignet med vehikelkontrollen (figur 3C.

s Restaurant 0,05). Dette fund tyder på, at SQ40 inhiberede forankringsuafhængig vækst af LNCaP prostatacancerceller.

LNCaP-celler blev forbehandlet med SQ40 eller kontrol køretøj i 72 timer og derefter udpladet på den bløde agar medier i yderligere 3 uger. Repræsentative kolonier af (A) vehikelkontrol og (B) SQ40-behandlede LNCaP-celler er vist. (C) Grafiske repræsentationer af blød agar-kolonidannelse effektivitet. Data blev udtrykt som middel ± SEM af tre uafhængige forsøg for køretøjets kontrolceller og seks uafhængige forsøg for SQ40-behandlede celler. * Angiver

s

. 0,05 versus kontrol køretøj

SQ40 hæmmede LNCaP cellevækst ved lav koncentration, men induceret celledød i høj koncentration

Vækst kinetik LNCaP og RWPE-1-celler blev overvåget i realtid under anvendelse af en impedans-baserede celle sensing målesystem. Det blev observeret, at de normaliserede Cl-værdier for SQ40-behandlede LNCaP-celler viste et støt fald efter 6 timers behandling med quassinoider sammensætning. Efter 72 timers behandling blev der observeret det, at LNCaP-celler behandlet med lavere koncentrationer (2,5-10 ug /ml) af SQ40 kun scorede omkring halvdelen af ​​de normaliserede Cl-værdier, hvor vognen kontrolceller og dette tyder på, at SQ40 ved lave koncentrationer udøver cytostatisk effekt på LNCaP-celler. Imidlertid SQ40 ved højere koncentrationer (20-80 ug /ml) resulterede i meget lave normaliserede Cl-værdier svarende til den i den positive kontrol, 5 pM paclitaxel-behandlede celler (fig. 4A). Salg

vækstkinetik af (A) LNCaP og (B) RWPE-1-celler blev undersøgt i realtid ved hjælp RTCA. De impedansværdier blev registreret i realtid og blev udtrykt som Cell Index (CI). Celler behandlet med vækstmedier alene blev henvist som kontrol køretøjet, mens 5 pM paclitaxel-behandlede celler blev benævnt som positiv kontrol. (C) SQ40-behandlede LNCaP-celler blev farvet med 0,4% trypanblåt løsninger i et forhold på 1: 1 efter 72 og 96 timers behandling hhv. Celler behandlet med vækstmedier alene blev henvist som kontrol køretøjet, mens 1 pM paclitaxel-behandlede celler blev benævnt som positiv kontrol. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg. ** Angiver

s

0,01 versus 72-timers behandlet køretøj kontrol.

## angiver

s

0,01;

###,

s

. 0,001 versus 96-timers behandlet kontrol køretøj

I modsætning hertil normal prostata RWPE-1 celler behandlet med 20 pg /ml SQ40 viste normaliserede CI værdier, der var magen til de af køretøjets kontrol celler antyder, at SQ40 ved disse doser inducerede ikke cytotoksisk virkning på normale prostata celler. Imidlertid cytotoksicitet blev observeret på RWPE-1-celler ved meget høje koncentrationer af quassinoider sammensætning (40 og 80 ug /ml;. Figur 4B). I alle efterfølgende undersøgelser, 3, 6, og 12 ug /ml SQ40 blev anvendt til behandling af LNCaP-celler. For at demonstrere at efterfølgende molekylære virkninger af SQ40 ved disse doser blev ikke bidraget med den høje procentdel af døde celler, blev trypanblåteksklusion farvning udført for at bestemme procentdelen af ​​levedygtige celler i kulturerne. Efter 72 timers behandling, procentdelen af ​​døde celler var ~ 20% og 35% i 12 og 20 ug /mL SQ40-behandlede LNCaP-celler i sammenligning med den ubehandlede kontrol. En udvidet behandlingsvarighed på 96 timer steg procentdelen af ​​døde celler til ~ 30% og ~ 60% i 12 og 20 pg /mL SQ40-behandlede LNCaP celler, henholdsvis (figur 4C;.

s

0,001 ).

SQ40 induceret G

0 /G

1 fase anholdelse i LNCaP celler

Cell cyklus analyse blev udført for at undersøge den hæmmende effekt af SQ40 i cellecyklus progression af LNCaP celler. LNCaP-celler ved 70-80% konfluente blev behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml af quassinoider sammensætning til 24, 48 og 72 timer. Som vist i fig. 5, SQ40 betydeligt standset LNCaP-celler ved G

0 /G

1 fase på en dosis- og tidsafhængig måde. Ved 24-timers behandling, viste LNCaP celler højere G

0 /G1 fase celle befolkning 80,22% (

s

0,01) i 3 ug /ml quassinoider sammensætning-behandlede celler og 85,45% (

s

0,001) i 6 mikrogram /ml quassinoider sammensætning-behandlede celler sammenlignet med køretøjets kontrol celler (65,22%;. figur 5A). Cellen befolkning på 6 mikrogram /ml quassinoider sammensætning behandlet LNCaP celler i G

0 /G

1 fase steget markant til 96,15% (

s

0,001) og 93,67% (

s

. 0,001) efter 48- og 72-timers behandling, henholdsvis (figur 5A). Stigningen i andelen af ​​cellepopulationen i G

0 /G

1 fase blev ledsaget af et fald i andelen af ​​cellepopulationen i S-fasen (3,11%;

s

0,01) og G

2 /M fase (3,21%) på LNCaP celler efter 72 timers behandling (fig. 5D). Disse væsentlige ændringer tyder på, at SQ40 hæmmede væksten af ​​LNCaP-celler ved at arrestere cellerne ved G

0 /G

1 fase.

LNCaP-celler blev behandlet med vækstmedie (vehikelkontrol), 3, 6 og 12 ug /ml SQ40. Cellefordeling i (A) G

0 /G

1, (B) S og (C) G

2 /M-fasen ved 24, 48 og 72 timers behandling blev analyseret ved FACSCanto II flowcytometri og evalueret under anvendelse ModFit cellecyklusanalyse software. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg. * Angiver

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001 versus kontrol køretøj. (D) Protein ekspression af spaltet-PARP i LNCaP-celler efter SQ40 behandling i 72 og 96 timer. β-actin tjente som en loading kontrol.

På den anden side, LNCaP-celler behandlet med 12 ug /ml SQ40 viste en betydelig stigning i G

2 /M fase efter 72 timer behandling. G

2 /M fase cellepopulation i 12 pg /mL SQ40-behandlede LNCaP celler var 9,58%, 8,94% og 10,23% (

s

0,01) efter 24-, 48-, og 72- timers behandlinger henholdsvis mens de af køretøjets kontrol cellerne var 10,55%, 7,95% og 4,58% efter 24-, 48-, og 72-timers behandling, henholdsvis (fig. 5C). Desuden spaltes-PARP, blev en apoptotisk markør detekteres, når varigheden behandling med 12 ug /ml SQ40 blev forlænget til 96 timer. Desuden blev spaltet-PARP også signifikant detekteret efter 72 timer, når koncentrationen af ​​SQ40 blev forøget til 20 ug /ml (fig. 5D). Tilsammen tyder disse resultater på, at SQ40 celledød efter G

2 /M anholdelse.

SQ40 hæmmede væksten af ​​LNCaP celler ved nedregulering CDK4, CDK2 og cyclin D1 proteiner, og opregulering p21

WAF1 /Kip1 proteinekspression niveau

Immunoblotanalyse blev udført for at undersøge virkningerne af SQ40 på cellecyklus regulatorisk protein ekspression. Ekspressionsniveauet af G

1 /S regulatorisk protein, herunder CDK4, CDK2, cyclin D1 og cyclin D3 var opreguleret i LNCaP-celler, når de stimuleres til at proliferere med DHT, en metabolit af testosteron (fig. 6). Tilstedeværelsen af ​​SQ40 i 100 nM DHT-stimulerede LNCaP-celler nedreguleret protein ekspressionsniveauer af CDK4, CDK2, cyclin D1 og cyclin D3 på en dosis-afhængig måde (Fig. 6). Desuden SQ40 forøget protein ekspressionsniveauet af cellecyklusinhibitor p21

WAF1 /Kip1 i nærvær af 100 nM DHT imidlertid quassinoider sammensætning påvirkede ikke ekspressionsniveauet af p27

Kip1 efter 72 timers behandling i LNCaP-celler. Disse resultater understøttes yderligere flowcytometri konstateringer, at SQ40 standsede celler ved G

0 /G

1 fase.

LNCaP-celler blev først dyrket i vækstmedium suppleret med 5% CSS i 48 timer og derefter behandlet med 3, 6 og 12 ug /ml SQ40 med nærvær af 100 nM DHT i 72 timer. Immunoblotting blev udført på proteinekstrakter at opdage CDK4, CDK2, cyclin D1, cyklin D3, p21

WAF1 /Cip1 og p27

Kip1. β-actin tjente som en belastning kontrol.

SQ40 undertrykte AR protein niveau og faldt produktionen af ​​PSA i LNCaP celler

Effekten af ​​SQ40 på AR protein af LNCaP blev undersøgt næste. Nuklear AR ekstrakt i 100 nM DHT stimuleret-LNCaP celler steg med 25% i forhold til de ikke-stimulerede celler (Fig. 7A). SQ40 behandling ved 3 og 6 ug /ml alene faldt det basale nukleare AR niveau med 25% så godt, når sammenlignet med de ikke-stimulerede celler (Fig 7A;.

s Restaurant & 0,05).