PLoS ONE: HDAC Hæmning Mindsker Ekspression af EGFR i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), en receptor tyrosin kinase, som fremmer celledeling og overlevelse, er unormalt overudtrykt i mange tumorer i epitelial oprindelse, herunder colorectal cancer (CRC). EGFR-monoklonale antistoffer har vist sig at øge median overlevelse og er godkendt til behandling af colorektal cancer. Histondeacetylaser (HDAC), ofte overudtrykt i kolorektal cancer og flere maligniteter, er en anden attraktive mål for kræftbehandling. Adskillige inhibitorer af HDAC’er (HDACi) er udviklet og udviser kraftige antitumor evner. I denne undersøgelse, udstillet humane kolorektal cancer celler behandlet med HDACi reduceret EGFR, derved forstyrret ERK EGF-induceret og Akt fosforylering. HDACi faldt også ekspressionen af ​​SGLT1, en aktiv glukosetransportør sig at være stabiliseret af EGFR, og undertrykte glukoseoptagelse af cancerceller. HDACi undertrykte transskription af EGFR og klasse I HDAC’er blev vist sig at være involveret i denne begivenhed. Kromatin immunofældning analyse viste, at HDACi forårsagede dissociation af SP1, HDAC3 og CBP fra EGFR promotor. Vores data foreslog, at HDACi kunne tjene som et enkelt middel til at blokere både EGFR og HDAC, og kan bringe flere fordele for udviklingen af ​​CRC terapi

Henvisning:. Chou CW, Wu MS, Huang WC, Chen CC ( 2011) HDAC hæmning Mindsker Ekspression af EGFR i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 6 (3): e18087. doi: 10,1371 /journal.pone.0018087

Redaktør: Chris Chan, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: August 23, 2010; Accepteret: 24. februar, 2011; Udgivet: 25 Mar 2011

Copyright: © 2011 Chou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en forskningsbevilling fra National Science Council of Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

EGFR (også kendt som ErbB-1 /HER1), som tilhører ErbB-familien af ​​receptortyrosinkinaser, omfatter et ekstracellulært ligandbindende domæne, en enkelt hydrofob transmembrant domæne og et cytoplasmisk tyrosinkinase-holdige domæne [1]. Ligandbinding inducerer homo- eller hetero-dimerisering af receptoren og efterfølgende aktivering af veje, herunder Ras /Raf /MEK /ERK og PI3K /PDK1 /Akt [1]. De fleste af colorektal cancer (CRC) er kendetegnet med overekspression af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) og forudsiges med høj risiko for metastase og tilbagefald [2]. Målretning EGFR synes at være en lovende fremgangsmåde til CRC behandling. Faktisk cetuximab, en human-muse kimært IgG1 antistof binder til det eksterne domæne af EGFR, er blevet godkendt af FDA i 2004 til behandling af metastatisk kolorektal cancer [3]. Efter at et fuldt humaniseret antistof, panitumumab, er også godkendt til behandling af CRC [4]. akkumulerende beviser demonstrerer imidlertid, at virkningerne af at målrette EGFR i kolorektal cancer i høj grad er begrænset på grund af status for KRAS mutation [5]. Kras mutanter omgå EGFR at aktivere Ras /Raf /MEK /ERK-signaler, og betydeligt svække den terapeutiske effekt af cetuximab [6]. Undersøgelse af KRAS-status er nu en forudsætning for brugen af ​​cetuximab [7]. Selv -60% af CRC patienterne udtrykte vildtype-KRAS, men kun halvdelen af ​​dem nyder godt af cetuximab. Derfor KRAS status er ikke den eneste determinant for virkningen af ​​EGFR target terapi [8]. Derfor er der et presserende behov for behandling med et bredt spektrum af genetiske baggrunde og ville gavne de fleste patienter uansvarlige cetuximab-baserede terapier.

Selvom EGFR er en receptortyrosinkinase og leverer signaler efter ligand konjugation, kan dens prosurvival effekten være uafhængig at kinase aktivitet. For eksempel mus, som mangler EGFR er embryonale letale men disse huser kinaseinaktiv mutanter kun udviser nogle epiteliale defekter [9], [10]. Desuden tab af EGFR-kinaseaktivitet decelererer celle proliferaiton men tab af dets ekspression ødelægger glucoseoptagelse og fører til celledød [11] – [13]. Derfor kan hæmning af EGFR være en bedre strategi for CRC-terapi.

HDACi (HDAC), som fjerner acetylgrupper fra histon til tavshed genet transskription er højt udtrykt i forskellige tumorer [14], [15 ]. HDAC’er er blevet en af ​​de nye mål for kræftbehandlingen, og HDAC-hæmmere (HDACi) viser lovende anticancer aktiviteter [15]. Blandt forskellige HDACi, havde SAHA (Vorinostat) blevet godkendt til behandling af kutant T-celle lymfom (CTCL). HDAC familie kan opdeles i fire klasser, og klasse I HDAC’er, som omfatter HDAC1, HDAC2, HDAC3 og HDAC8, er blevet rapporteret at være stærkt udtrykt i tyktarmskræft [16]. De pro-proliferative virkninger af HDAC’er er forbundet til transkriptionel repression af cdk-inhibitor, p21, og knockdown af HDAC 1, 2 og 3 reducerede væksten af ​​adskillige coloncancer-celler [17]. Derfor kan HDAC tjene som et potentielt mål for CRC terapi og SAHA var trådt kliniske forsøg til behandling af CRC [18].

I denne undersøgelse har vi påvist, at signaleringen EGF i KRAS mutant cellelinier, HCT116 og SW480, blev afbrudt af HDACi gennem transkriptionel repression af EGFR, hvilket indikerer, at HDACi tjente som enkeltstof til at blokere EGFR og HDAC samtidigt. Tab af EGFR delvist bidraget til den cytotoksiske virkning af HDAC-inhibitorer. Endvidere blev ekspressionen af ​​SGLT1, et aktivt glukosetransportør som stabiliseres af EGFR, faldt også med HDACi og førte til en reduktion af glucoseoptagelse i colon cancerceller. Mekanismen bag den transkriptionelle undertrykkelse af EGFR af HDACi var involveret med histoner hypoacetylation og dissociation af SP1, HDAC3 og CBP fra EGFR promotor. Vores data foreslog, at HDACi kunne tjene som et enkelt middel til samtidigt at blokere både EGFR og HDAC, og kan være til fordel for CRC patienter med en bredere vifte af genetiske baggrunde.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patient-afledte prøver blev indsamlet og arkiveret under protokoller er godkendt af Institutional Research Board of National Taiwan University Hospital og støttet af National Science Rådet, Taiwan. En fuld verbal forklaring af undersøgelsen blev givet til alle deltagere. De samtykke til at deltage på frivillig basis.

Materialer

TSA blev købt fra Sigma og SAHA blev opnået fra Merck. Myc-mærkede HDAC1, 2 og 3 blev tilvejebragt af Dr. WM Yang (Nchu, Taiwan). Antistoffer specifikke for EGFR, p21, HDAC3, og actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology. Anti-Ac-histon H3, H4, og Sp1-antistoffer blev opnået fra Upstate. Anti-SGLT1 antistof blev købt fra Abcam.

Cell kultur

HCT-116 (fra Van Dyke MW, MD Anderson) og SW480 (fra TH Leu, NCKU) humane coloncarcinomceller blev dyrket i DMEM suppleret med 10% kalvefosterserum; A431 (human epidermoide carcinomaceller) og MDA-MB-468 (human brystadenocarcinom celler) opnået fra ATCC blev opretholdt i RPMI suppleret med 10% FCS.

RNA-isolering, RT-PCR og real time PCR

Totalt RNA blev isoleret fra HCT116 celle under anvendelse af Trizol-reagens (Life Technology). Revers transkription blev udført under anvendelse af 2 ug totalt RNA, revers transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo dT primer. cDNA blev underkastet RT-PCR og amplificeret 30 cykler under anvendelse af to oligonukleotidprimere afledt fra offentliggjorte EGFR eller GAPDH-sekvens, herunder 5’TGGAGCTACGGGGTGACCGT-3 ‘og 5′-GGTTCAGAGGCTGATTGTGAT-3′ (EGFR), 5’-AAGCCCATCACCATCTTC-CAG- 3 ‘og 5′-AGGGGCCATCCACA-GTCTTCT-3′ (GAPDH) og 5’-TGAC-GGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3 ‘og 5′-CTAGAAGCATTTGCG-GGGACGATGGAGGG-3′ (Actin). PCR-produkterne blev underkastet 1,2% agarosegelelektroforese og visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Real time PCR blev udført med cDNA prøver under anvendelse af ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Primere var som følger: EGFR (fremadrettet primer, 5’-TTCCTCCCAGTGCCTGAAT-3 ‘reverse primer, 5′-GGTTCAGAGGCTGAT-TGTGAT-3′); Actin (fremadrettet primer, 5’-CCAACCG-CGAGAAGATGA-3 ‘; revers primer, 5′-TCCATCACGATGCCAGTG-3’). Dataene blev normaliseret ved den Actin housekeeping gentest.

Celleproliferation

I vækstinhibering analyse, HCT116-celler blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 celler pr brønd i 96 Tja plader. Efter podning blev vækstmediet erstattet med medium indeholdende angivne koncentration af TSA. Efter 3 dage blev cellevækst målt ved anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (Sigma, St. Louis, MO) kolorimetrisk metode. Celle cyklus blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse af en propidiumiodid plet puffer og analyseret på en BD FACS Calibur cytometeret med Cellquest software.

Måling af intracellulær Glucose

inden høst adhærente kulturer af kontrol og TSA-behandlede celler i DMEM indeholdende 1 eller 4,5 mg /ml glucose blev vasket to gange med kold phosphat- pufret saltvand (PBS) og lyseres derefter med ion-Freeh

2O i 5 minutter på is. Indholdet glucose blev målt med D-glucose måling kit (GAHK-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ifølge producentens protokol.

Transient transfektion og luciferaseaktivitet assay

EGFR-promotoren plasmid indeholdende et ildflueluciferase blev forbigående transficeret ind i HCT116 celler med arrestin-transfektionsreagens. Kort fortalt blev 0,9 ug af plasmid-DNA, 0,1 ug af Renilla luciferase, og 5 ul transfektionsreagenser blandet, og transfektion protokollen blev udført ifølge producentens anvisninger (Promega). Seks timer efter transfektion blev cellerne dyrket i normal komplet medium i yderligere 16 timer. Derefter blev de transficerede celler udsat for luciferase assay. Ildflue luciferase-aktivitet blev normaliseret til den for Renilla luciferase.

Fremstilling og infektion af shHDAC-udtrykkende lentivirus

Kort fortalt 6 ug pCMV-dR8.91, 3 ug pMD2.G, og 9 ug pLKO-shLuciferase, pLKO-shHDAC1, pLKO-shHDAC2 eller pLKO-shHDAC3 blev cotransficeret ind i HEK293T celler ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). De supernatanter indeholdende smitsomme shLuciferase blev shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 lentivirus indsamlet på dag 3 efter transfektion og opbevaret ved -80 ° C. For lentivirus infektion, 2 × 10

5 HCT116 celler blev inficeret med shLuciferase, shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 lentivirus ved en mangfoldighed af infektion (MOI) af 1.

Patienter og modeller til forberedelse

Enheder af tumorvæv og tilgrænsende normalt væv af colon blev opnået fra 14 patienter, der er patologisk diagnosticeret tyktarmskræft og gennemgik kirurgisk resektion ved National Taiwan University Hospital. Vævsprøver blev formalet, derefter sonikeret i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM EGTA, 150 mM NaCI, 5% Triton X-100) med proteaseinhibitorer. Prøverne blev mikrocentrifugeret at fjerne større rester og underkastet western-analyse.

chromatin immunpræcipitationsassay

Celler blev behandlet med 5 pM SAHA i 6 timer og tværbundet med 1,42% formaldehyd i 15 min. Celler i to 10 cm skåle blev skrabet i 1 ml kold PBS, centrifugeret, og lyseret i 1 ml IP buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40 og 1% Triton X-100) indeholdende proteaseinhibitorer (1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 uM leupeptin og 1 pM aprotinin). Den nukleare pellet blev resuspenderet i IP buffer og sonikeret for forskydning kromatin. De sonikerede lysater blev immunoprecipited med antistoffer mod SP1, AcH3, AcH4, H3K4Me2, CBP og HDAC3 henholdsvis og immunkomplekserne blev udvundet med protein A-Sepharose (Roche). Den immunopræcipiterede DNA og indført DNA blev ekstraheret ved inkubering med 100 pi 10% Chelex (Bio-Rad), kogning at vende den tværbinde, og centrifugering til fjernelse Chelex opslæmning. Real-time PCR blev udført med det oprensede DNA ved anvendelse af følgende primere: A: 5′- GTGAAAAACCCCACCGTTC-3 ‘og 5’TCTGAAGGGGAGCAACCTTA-3′; B: 5’-AAGCTTCCGCGAGTTTCC-3 ‘og 5’GAGGCTAAGTGTCCCACTGC-3′; C: 5’- ACCCTGGCACAGATTTGG-3 ‘og 5’TGAGGAGTTAATTTCCGAGAGG-3′; D: 5’-CCAGTATTGATCGGGAGAGC-3 ‘og 5’TTCCTCCAGAGCCCGACT-3′; E:. 5’-CTGAGGAAGGAACCCAAAAA-3 ‘og 5′-GGGAGGTCCTCTCAGAA AGC-3’

Statistisk analyse

Tredobbelte forsøg blev udført, og resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SE. Den to- tailed Students t-test blev anvendt til at beregne den statistiske signifikans mellem gruppe

Resultater

HDAC-hæmmere forstyrre EGF signalering via lyddæmpende EGF-receptor (EGFR) udtryk

Til undersøge antitumorvirkningen af ​​HDACi i colorektal cancer, KRAS vildtype (WiDr og HT29) og KRAS mutantceller (HCT116 og SW480) blev behandlet med SAHA eller cetuximab i 48 timer, og cellelevedygtighed blev målt. SAHA reduceret overlevelse af disse celler på en dosis-afhængig måde (Fig. 1A), hvilket tyder uafhængighed KRAS status på antitumoraktiviteten af ​​HDACi. I modsætning hertil cetuximab havde ringe virkning på cellelevedygtigheden (fig. 1A). Dette resultat er i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse, colorektale cancerceller behandlet med cetuximab blev dræbt mere effektivt ved antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC), som er fraværende i

in vitro

systemet [19]. Da EGFR spiller en væsentlig rolle i CRC, evnen af ​​dens ligand udløse nedstrøms signal i KRAS mutantceller blev undersøgt. EGF udløst både Akt og ERK-phosphorylering i HCT116-celler og induceret ERK-aktivering i SW480-celler (fig. 1B), hvilket indikerer, at KRAS mutation ikke fuldt ud overtage ligand-medieret ERK-aktivering og også impling betydningen af ​​EGFR i KRAS mutantceller . Desuden forbehandling med HDAC-hæmmere, TSA og SAHA, forstyrret EGF-stimuleret ERK og Akt fosforylering i HCT116 celler og ERK fosforylering i SW480 celler (Fig. 1C). Da HDAC-hæmmere blokeret både Akt og ERK phosphoryleringer, kan meget proksimale del af EGF-signalering målrettes af HDACi. Derfor blev ekspressionen af ​​EGF-receptoren først undersøgt. Efter behandling med TSA blev ekspressionen af ​​EGFR faldt i HCT116, SW480, og HT29-celler. At identificere, om dette er et almindeligt fænomen, blev cellerne stammede fra forskellige organer anvendes. Efter behandling med TSA, blev reduceret EGFR også ses i menneskehud (A431) og bryst (MDA-MB468) kræftceller (Fig.1D).

(A) HCT116, SW480, WiDr og HT29-celler blev opretholdt i DMEM med 1 mg /ml glucose og behandlet med 0,1, 1, 10 ug /ml cetuximab eller 1, 3, 5 pM SAHA den celleoverlevelse blev målt ved MTT-assay efter 48 timers behandling (B) HCT116 og SW480-celler var serum-udsultet i 24 timer og derefter stimuleret med 1 uM EGF for, 1, 5, 15, 30 og 60 minutter. (C) HCT116 og SW480-celler blev præinkuberet med 0,5, 1 uM TSA eller 5 pM SAHA i 24 timer og derefter stimuleret med EGF i 5 minutter. (D) HCT116, SW480, blev A431 og MDA-MB468-celler behandlet med 1 pM TSA i 24 eller 36 timer helcellelysat blev fremstillet og underkastet western blot-analyse med antistoffer der er specifikke for phospho-Akt, fosfor-ERK, Akt og Erk .

HDAC-hæmmere reducerer ekspressionen af ​​SGLT1 og mindske den intracellulære glukose

Ud over EGF-signalering, er EGFR blevet rapporteret at være involveret i glukose transport ved at knytte og stabilisere aktiv glukose transportør, SGLT1 [13], [20]. Eftersom ekspressionen af ​​EGFR blev reduceret med HDACi i CRC celler, blev niveauerne af SGLT1 ekspression og intracellulær glucose som reaktion på HDACi også undersøgt. Som forventet, TSA reducerede SGLT1 ekspression (2A) og den intracellulære glucosekoncentration (fig. 2B). Glucose genopfyldning beholdt den intracellulære glucose (fig. 2C) og reddede celler fra TSA-induceret celledød (fig. 2D). Disse data antydede, at tabet af EGFR og partneren, SGLT1, kan være involveret i den cytotoksiske virkning af HDAC-inhibitorer.

(A) HCT116-celler blev behandlet med 1 pM TSA i 24, 36 eller 48 timer. Helcellelysat blev fremstillet og underkastet western blot-analyse med antistoffer specifikke for SGLT1, EGFR og actin. (B) Celler blev dyrket i DMEM med 1 mg /ml og behandlet med 1 pM TSA i 24 timer. Indholdet glucose blev målt som beskrevet i materiale og metode (Tredobbelte prøver blev anvendt i hver gruppe Stjernen angiver en signifikant forskel med p. .. 0,05 Fejlsøjler indikerer gennemsnit ± SE) (C) Celler blev dyrket i DMEM med 1 mg /ml eller 4,5 mg /ml glucose og behandlet med 1, 3 eller 5 uM TSA i 24 timer. Indholdet glucose blev målt. (D) Celler blev dyrket i DMEM med 1 mg /ml glucose og behandlet med 1 eller 3 pM TSA. Efter 24 eller 48 timers behandling blev glucose justeret til 4,5 mg /ml. Overlevelsen celle blev målt ved MTT-assay efter 72 timers behandling med TSA. Resultaterne blev udtrykt som middel ± SE for tre uafhængige forsøg udført tredobbelt.

Tab af EGFR er impliceret i HDAC inhibitor-medieret cytotoksicitet

HDAC-inhibitorer vist sig at udøve antitumor-aktivitet ved arrestere cellecyklus og udløser apoptose [15]. Konsekvent, SAHA øget sub-G1 befolkning fra 7,72% til 17,23% og G2 /M befolkning fra 16,6% til 24,4% (Fig.3A). For at belyse den rolle, EGFR i antitumoraktiviteten af ​​HDACi blev celler transficeret med myc-EGFR og derefter behandlet med SAHA i 24 timer. Overekspression af myc-tagget EGFR faldt sub-G1 population og G2 /M population (Fig.3A). SAHA-induceret p21-ekspression blev også svækket af den ektopiske ekspression af EGFR (3B). Disse data viste, at SAHA-reduceret EGFR bidraget til SAHA-induceret apoptose og cellecyklusstandsning.

(A) HCT116-celler blev transficeret med Myc-EGFR samt dets vektor kontrol og transficerede celler blev behandlet med 5 pM SAHA i 24 timer. Cellerne blev fikseret med 70% ethanol og farvet med propidiumiodid, og del af cellecyklus blev analyseret ved flowcytometer. (B) HCT116-celler blev transficeret med Myc-EGFR samt dens vektor kontrol og de transficerede celler blev behandlet med 5 pM SAHA i 24 timer. Helcellelysat blev fremstillet og underkastet western blot med Ab specifikt for EGFR, Myc, p21 og tubulin.

HDAC’er er impliceret i transkriptionen af ​​EGFR

Da mængden af ​​EGFR protein er reduceret efter behandling med HDACi blev EGFR gentransskription undersøgt. MRNA niveau af EGFR blev faldet drastisk efter behandling med TSA og SAHA (Fig.4A), hvilket tyder på HDACi transkriptionelt nedregulere EGFR. Denne virkning blev yderligere bekræftet af EGFR reporter assays. Vores Resultatet viste, at TSA og SAHA nedsatte signifikant EGFR promotoraktiviteten (Fig.4B øvre panel). Det er blevet rapporteret, at HDACi faldt EGFR mRNA-stabilitet i ER-negative humane brystcancerceller [21]. Derfor blev stabiliteten af ​​EGFR-mRNA undersøgt.

de novo

transskription blev stoppet af actinomycin D og EGFR mRNA blev målt ved real-time PCR. Hældningen af ​​EGFR mRNA nedbrydning viste ikke en signifikant forskel mellem basal og TSA behandling (fig. 4B nederste panel), hvilket tyder på, at HDACi ikke påvirkede nedbrydningen af ​​EGFR mRNA i kolorektale cancerceller. For yderligere at belyse involveringen af ​​HDAC’er i transkriptionen af ​​EGFR, myc-tagget HDAC1, HDAC2 eller HDAC3 blev ektopisk udtrykt i HCT116-celler, og EGFR-mRNA blev målt ved RT-PCR. En stigning af EGFR-mRNA blev fundet i alle disse HDAC-udtrykkende celler (fig. 4C øvre panel). Omvendt knockdown af HDAC1, HDAC2 eller HDAC3 af shRNA reduceret ekspression af EGFR-protein (Fig.4C nedre panel). Disse data viste, at klasse I HDAC’er er afgørende for EGFR. Den positive korrelation mellem EGFR og HDAC3 ekspression blev også observeret i fjorten par human colon tumor og tilstødende normale væv (Fig. 4D).

(A) HCT116-celler blev behandlet med 1 pM TSA eller 5 pM SAHA for 1 og 8 timer. Totalt RNA (2 ug) blev anvendt til RT-PCR og Real-time PCR som beskrevet. (B, øvre panel) Celler blev behandlet med 1 pM TSA eller 5 pM SAHA i 6 h, derefter transficeret med EGFR-Luc. Luciferaseaktiviteter blev målt som beskrevet under “Materiale og metode”. (B, nederste felt) Celler blev behandlet med 1 pM TSA i 4 timer før RNA-syntese blev standset ved actinomycin D (5 ug /ml) i 0, 2, 4 eller 6 timer. RNA blev fremstillet ved angivne tidspunkter efter tilsætningen af ​​actinomycin D og niveauer af EGFR-mRNA blev målt ved real-time PCR. (C, øvre panel) Celler blev transficeret transient med myc-tagget HDAC1, 2 eller 3, henholdsvis og total RNA (2 ug) blev anvendt til RT-PCR til påvisning af EGFR mRNA-niveauet. (C, lavere panel) Celler blev transficeret med shLuc, shHDAC1, shHDAC2 eller shHDAC3 af lentivirus som beskrevet under “Materiale og metode”. Cellelysater blev høstet på dag 5 efter transfektion og derefter underkastes western blot analyse med antistoffer specifikke for EGFR, HDAC1, HDAC2 og HDAC3. (D) Lysater af parrede humane normale og maligne colonvæv blev underkastet western blotting ved anvendelse af anti-EGFR, anti-HDAC3 og anti-actin-antistoffer. Sammenhængen mellem EGFR og HDAC3 ekspressionsniveauerne blev evalueret ved korrelationskoefficienter.

SP1 er afgørende for EGFR transskription og HDAC-hæmmer forstyrrer bindingen af ​​SP1 til EGFR promotor

Der er flere SP1 bindingssteder på EGFR initiativtagere og vores tidligere undersøgelser viste, at HDACi påvirker bindingen af ​​SP1 til ADAMTS1or p21-initiativtagere [22], [23]. Derfor kan SP1 deltage i HDACs-medieret EGFR. Faktisk inhibering af SP1 ved mithramycin A (MTM) og siRNA nedsatte signifikant EGFR (Fig.5A). Endvidere MTM drastisk reduceret EGFR promotoraktiviteten (Fig.5B), hvilket viser den kritiske rolle SP1 i EGFR gentranskription. Bindingen af ​​SP1 til EGFR promotor er yderligere undersøgt af kromatin immunofældning (chip). Fem primerpar (A, B, C, D og E) blev designet til jævnt dække regioner (-1200 til 1000 bps) omkring transkriptionsstartstedet (Fig.6A). Vores data viser, at bindingen af ​​SP1 til regioner C og D blev signifikant reduceret efter behandling med SAHA (Fig.6B). Endvidere blev acetylering af histon H3 og H4 på EGFR promotor stærkt reduceret, især i regioner nærheden transkriptionsstartsitet (Fig.6B). Status for histon methylering såsom H3K4Me2, H3K9Me3 og H3K27me3 blev også undersøgt. SAHA ændrede ikke residens for disse methylering markører på EGFR promotor trods af beriget H3K4Me2 blev fundet (Fig.6B og data ikke vist). Siden acetylering af histon H3 og H4 faldt dramatisk efter HDAC hæmning, blev belægning af histonacetyltransferase (HAT) eller HDAC på EGFR-promotor undersøgt. Vores resultat viste, at rekrutteringen af ​​CBP til region D blev signifikant reduceret med SAHA (Fig.6B). Interessant bindingen af ​​HDAC3 til regionen D var svækket, også (Fig.6B). Disse data viste dissociationen af ​​SP1, CBP og HDAC3 fra EGFR-promotoren samtidig (fig.7), hvilket indebærer, at disse proteiner kan påvirke hinanden og påvirke deres binding til EGFR-promotoren.

(A) cellerne blev behandlet med 1 pM Mithramycin A (MTM) i 18 eller 36 timer, er det samlede cellelysat blev fremstillet. Celler blev transficeret med 0, 400 eller 800 pmol SP1 siRNA, så de totale cellelysater blev fremstillet og underkastet western blot-analyse med antistoffer specifikke for EGFR og SP1. (B) Celler blev transficeret med EGFR-Luc og derefter behandlet med 0,1, 1 eller 5 uM Mithramycin A (MTM) i 16 timer. Luciferaseaktiviteter blev målt som beskrevet under “Materiale og metode”. Resultaterne blev normaliseret til den Renilla luciferaseaktivitet og udtrykt som middelværdien ± SE. I tre uafhængige forsøg udført tredobbelt.

(A) Illustration af EGFR-promotoren og chippen primeren. (B) Celler blev behandlet med SAHA i 8 timer, derefter fikseret, sonikerede og underkastet chromatin immunoprecipitation under anvendelse Ab specifikt mod SP1 og acetyleret histon H3. Histon H4 acetylering H3K4 dimethylering blev CBP og HDAC3 på EGFR-promotor målt ved chip assays som beskrevet under “Materiale og metode”.

I den basale tilstand, HDAC3, CBP og SP1 blev begge rekrutteret til promotorregion og ansvarlig for transkriptionen af ​​EGFR (A).