PLoS ONE: PKM2 subcellulære lokalisering er involveret i Oxaliplatin Resistance Acquisition i HT29 Menneskelig Kolorektal Cancer Cell Lines

Abstrakt

kemoresistens er den vigtigste årsag til behandlingssvigt i fremskreden kolorektal cancer (CRC). Imidlertid molekylære mekanismer bag dette fænomen er endnu ikke klarlagt. I et tidligere arbejde identificerede vi lave niveauer af PKM2 som en formodet oxaliplatin-resistens mærke i HT29 CRC-cellelinjer, og også hos patienter. For at vurdere, hvordan PKM2 påvirker oxaliplatin respons i CRC celler, vi tavshed PKM2 hjælp specifikke siRNA’er i HT29, SW480 og HCT116 celler. MTT test viste, at PKM2 lyddæmpning induceret resistens i HT29 og SW480 celler og følsomhed i HCT116-celler. Samme eksperimenter i isogene HCT116 p53 nul celler og dobbelt lyddæmpning af p53 og PKM2 i HT29-celler ikke påvist en påvirkning af p53. Ved at anvende trypan blåsplint og FITC-Annexin V /PI tests vi har registreret, PKM2 knockdown var forbundet med en stigning i celle levedygtighed, men ikke med et fald i apoptose aktivering i HT29-celler. Fluorescens mikroskopi afslørede PKM2 nuklear translokation som respons på oxaliplatin i HCT116 og HT29-celler, men ikke i oxa-resistent HTOXAR3 celler. Endelig ved at anvende en qPCR Array vi demonstreret, at oxaliplatin og PKM2 silencing ændrede celledød genekspressionsmønstre herunder BMF, som blev signifikant forøget i HT29-celler som respons på oxaliplatin, i en dosis og tidsafhængig måde, men ikke i siPKM2 -HT29 og HTOXAR3 celler. BMF gene silencing i HT29-celler fører til et fald i oxaliplatin-induceret celledød. Afslutningsvis vores data rapporterer nye ikke-glycolytiske roller PKM2 reaktion på genotoksisk skader og foreslår BMF som et muligt mål gen af ​​PKM2 at være involveret i oxaliplatin respons og resistens i CRC celler

Henvisning:. Ginés A , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardus A, et al. (2015) PKM2 subcellulære lokalisering er involveret i Oxaliplatin Resistance Acquisition i HT29 Menneskelig Kolorektal Cancer cellelinier. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10,1371 /journal.pone.0123830

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: September 16, 2014 Accepteret: 7 marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Ginés et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af beca bianual de la Fundación Olga Torres 2008-2009 (https://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) til EMB AGM AA AMC EM JLM

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er stadig en af ​​de mest hyppige. årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Det 5-års samlet overlevelse er mindre end 10% i fremskredne stadier af sygdommen og behandling med kemoterapi er fortsat afgørende for disse patienter. På trods af tilgængeligheden af ​​nye mål behandlingsformer mod EGFR eller VEGF, kombinationer af oxaliplatin (OXA) med fluoropyrimidiner fortsat de mest anvendte frontline regimer i metastatisk indstillingen [1, 2]. Cytotoksicitet af OXA hovedsageligt genereres gennem dannelsen af ​​platin-DNA-addukter resulterer i DNA-transkription og replikation blokade. Derfor er det aktiverer flere signalveje, der fører til DNA-beskadigelse reparation og /eller aktivering af celledød programmer [3], som igen afhænger blandt andet af den mutations status tumorsuppressorgen p53 [4-6]. Det er imidlertid klart, at ikke alle patienter gavn af OXA behandling med resistens processer repræsenterer den vigtigste hindring af behandlingsvirkning. Kemoresistens til platinstoffer er en kompleks og multifaktoriel proces, hvor flere mekanismer, såsom narkotika tilstrømning /efflux modifikationer, forandringer i DNA beskadigelse reparation, nedsat celledød aktivering, autokrin overlevelse signalering eller høj afgiftning aktivitet kunne deltage [7-10]. Desværre er de fleste af de undersøgelser vedrørende platin narkotika modstand har fokuseret på cisplatin og den reelle biologiske adfærd og mekanismer reaktion på OXA i kolorektale celler er for det meste ukendt.

I de sidste par år er mange undersøgelser har rettet deres opmærksomhed på tumorcelle metabolisme som en mekanisme til celle tilpasning til lægemiddelfølsomhed [11, 12]. I denne linje, fandt vi i en tidligere undersøgelse, isoform M2 af pyruvat kinase-enzym (PKM2) er knyttet til OXA modstand erhvervelse i en

in vitro

model og vi var i stand til at omsætte vores resultater i en lille gruppe af metastatiske CRC patienter, som havde modtaget OXA /5-FU kemoterapi [8]. Andre forfattere har rapporteret, at PKM2 udtryk og aktivitet er knyttet til cisplatin modstand i gastriske tumorceller [13] og i kolorektal cancer celler med erhvervet resistens til 5-FU behandling [14]. Disse kendsgerninger viser, at dette enzym kan have en vigtig rolle i erhvervelse modstand processer til forskellige kemoterapeutiske lægemidler. Endvidere er det blevet vist, at nogle af de PKM2 biologiske funktioner afhænger af enzymets cellekernetranslokering som fremmes af forskellige post-translationelle modifikationer såsom tyrosinphosphorylering [15-17], lysin acetylering [18], eller sumoylation [19] i reaktion på faktorer EGFR [20], IL-3 [21] eller Oct-4 [22] hhv. Mens der i de fleste af de ovennævnte tilfælde PKM2 translokation resulterer i stimulering af celleproliferation, er det blevet påvist, at efter andre former for stimuli, såsom DNA-beskadigelse eller oxidativt stress, PKM2 translokerer til kernen af ​​celler fører til aktivering af celledød i et caspaser og Bcl-2 uafhængig måde [23].

i arbejdet præsenteres her, ønskede vi at belyse PKM2-relaterede molekylære mekanismer, der er ansvarlige for OXA modstand erhvervelse i en

in vitro

model tidligere beskrevet af os [24]. Som det vil blive vist, modulation af PKM2 udtryk ændrede OXA følsomhed ikke kun i denne cellulære model, men også i andre humane CRC cellelinjer. Vi viser, at PKM2 translokerer til kernen i afhængighed af genotoksisk skader forårsaget af OXA i følsomme, men ikke i cellelinier med erhvervet resistens over for lægemidlet, og det regulerer ekspressionen mønster af celledød gener, såsom BMF, som er blevet vist at være involveret i aktiveringen af ​​apoptotiske og ikke-apoptotisk celledød.

Materialer og metoder

Underskrevet informeret samtykke blev opnået fra hver patient, og Clinical Research Etisk Udvalg fra Hospital tyskere Trias i Pujol forudsat godkendelse til undersøgelsen.

Cellelinjer

HCT116 coloncarcinomaceller og dens isogene derivat med en målrettet inaktivering af p53 var en gave fra Dr. Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine). SW480 og HT29 blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Sidstnævnte blev anvendt som de parentale celler i oxa-resistente sublinie HTOXAR3, der blev opnået som følge af kontinuerlig og øget eksponering for OXA som tidligere beskrevet [9]. Cellelinier blev dyrket som monolag i DMEM (HT29, SW480 og HTOXAR3; Invitrogen, Life Technologies) eller RPMI 1640 (HCT116 og HCT116 p53 null; Invitrogen, Life Technologies) suppleret med 10% varmeinaktiveret FCS (Reactiva), 400 enheder /ml penicillin, 40 ug /ml gentamycin og 2 mM L-glutamin (Sigma) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Cellerne blev periodisk testet for forurening med

Mycoplasma

og blev bekræftet af kort tandem repeat profilering.

Narkotika

OXA udarbejdet i vand (1 mM) som stamopløsning og opbevares ved -20 ° C. Yderligere fortyndinger af lægemidlet blev foretaget i dyrkningsmedium til slutkoncentrationer inden brug.

siRNA transfektioner

Celler blev podet ved 60% konfluens i serum og antibiotika-fri OptiMem medium (Invitrogen) i 6 , 12 og 96-brønds plader, afhængigt af de følgende forsøg. PKM2 blev forbigående tavshed ved hjælp af tre forskellige siRNAs målrettet PKM2 (seq NM_002654,. NM_182470, NM_182471; Ambion). P53 og BMF hæmning blev udført med puljer af 4 forskellige siRNAs (Smartpool On-target plus:

TP53

, # L-003.329;

BMF

, # L-004.393-00, Dhamacon, GE). Som transfektion agent vi bruges Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. En lyddæmper negativ transcription kontrol (katalog nr AM4611; Ambion) blev indført i hvert eksperiment. Efter 24 timers transfektion blev mediet erstattet med fuld DMEM eller RPMI 1640 medier suppleret med serum og antibiotikum. Validering af PKM2, p53 og BMF knockdown blev vurderet ved qPCR og Western blot (WB), kun af WB og kun ved qPCR, hhv. I finjustere eksperimenter, siGAPDH 3 nM positiv kontrol; blev (NM_002046 Ambion) og ikke-transficerede celler (Mock) indført for at sikre, at transfektion havde minimale virkninger på genekspression, proliferation og cellernes levedygtighed (S1 Fig)

Western blot

Celler blev homogeniseret i RIPA plus buffer [phosphatbufret saltvand (PBS); NP-40 1%; Na deoxycolate 0,5%; SDS 0,1%; EDTA 1 mM; NaF 50 mM; Navo

3 5 mM] indeholdende en cocktail af EDTA-fri proteaseinhibitorer (Roche). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-metoden ved anvendelse af BCA Protein Assay Kit (Pierce) og bovint serumalbumin som en standard. Tyve mikrogram protein blev påsat og underkastet elektroforese i 10% SDS-PAGE geler (Invitrogen) og overført til PVDF-membraner (Bio Rad). Efter 1 time for at blokere (LICOR Biosciences) membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med et kanin polyklonalt anti-PKM2 primære antistof (cellesignalering; 1: 1000) eller med et monoklonalt muse-anti-p53 (Abcam; 1: 500). Kanin monoklonalt anti-Actin (1: 2000) og monoklonale muse-anti-a-tubulin-antistoffer (1: 15000) (begge fra Sigma-Aldrich) blev anvendt som intern kontrol. Membraner blev inkuberet med IRDye kanin og mus sekundære antistoffer (1: 15000) (LICOR Biosciences) i 45 minutter beskyttet mod lys. Membraner blev scannet ved hjælp af Odyssey Imaging System og analyseret med Odyssey v2.0 software (Licor Biosciences).

qPCR

blev udført genekspression eksperimenter som beskrevet i et tidligere arbejde [24]. Retrotransskription blev udført med MMLV revers transkriptase (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Primere og prober til PKM2 (assay nr. Hs00762869_s1) og BMF (Hs.00372938_m1) mRNA-ekspression analyse blev købt forhåndsudformede fra Applied Biosystems. PCR-produktet størrelse genereret med disse primere var 62 bp for PKM2 og 59 bp for BMF. Relativ genekspression kvantificering blev beregnet ifølge den sammenlignende Ct fremgangsmåde som beskrevet andetsteds hjælp 18S (Stratagene) eller β-actin-(Applied Biosystems) som endogene kontroller. I alle eksperimenter, tre eksemplarer kun med en Ct-værdi lavere end 0,20 SD blev accepteret. Hertil kommer, for hver prøve analyseret, blev en retrotranscriptase minus kontrol kørt i den samme plade for at sikre fravær af genomisk DNA-kontaminering.

MTT

cytotoksicitet af OXA blev vurderet af 3- ( 4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) test. Celler blev podet og transficeret i 96-brønds mikrotiterplader (Nunc) med en densitet på 1,000 (HT29 og SW480) og 2000 celler /brønd (HCT116). Fyrre timer efter siRNA transfektion blev OXA tilsat ved forskellige koncentrationer; cellelevedygtigheden blev bestemt 24 timer efter inkubation ved MTT-assayet (Roche Diagnostics) [25]. Inhibitoriske koncentrationer (ICs, der spænder fra 10% til 90% af cellelevedygtighed) blev bestemt i hver cellelinie ved medianen-effekt line metode. De rapporterede data repræsenterer middelværdien ± SD af mindst tre uafhængige forsøg.

Trypan Blue-farve

Celler blev dyrket i 12 brønds plader og behandlet med 15 pM OXA i 24 timer. Efter eksponering lægemiddel celler blev høstet og resuspenderet i DMEM-medium i en koncentration 1×10

5 celler /ml. Cytotoksicitet blev vurderet ved anvendelse af trypan blue-farvning. Ti mikroliter 0,05% trypanblåt (Invitrogen) blev blandet med 10 pi af cellesuspensionen, spredt på en Neubauer kammer og dækket med et dækglas. Mens levedygtige celler udelukker farvestoffet og fremtræder gennemskinnelige, ikke-levedygtige celler synes blå farves. Levedygtighed og dødelighed på mindst 3 gentagelser af hver eksperimentel betingelse blev kvantificeret.

Annexin V /propidiumiodid test

Apoptose blev bestemt ved anvendelse FITC Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen) ifølge til producentens anvisninger. Mindst 10

4 celler pr prøve blev analyseret ved anvendelse af FACS Canto II flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). Mindst 3 replikater pr eksperimentel betingelse blev analyseret. Positive og negative kontroller (bindende buffer kun, propidiumiodid (PI) kun, kun FITC-Annexin V) blev brugt til at oprette passende betingelser for at kompensere detektorer og kvadranter. Oxa-induceret celledød efter BMF gendæmpning blev målt ved hjælp af PI. BMF blev stille ved hjælp siRNA målrettet BMF som beskrevet ovenfor. Efter 72 timer Oxaliplatin behandling blev HT29-celler høstet med Accutase (Ref. A11105-01, Invitrogen) og resuspenderet i kold PBS med en PI koncentration på 3 uM. PI fluorescens blev bestemt på en FACSCanto II flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). BMF gen silencing blev bekræftet af qPCR.

Cell cyklus analyse

For at vurdere cellecyklusfordeling celler blev høstet, vasket i PBS, fikseret i 1 ml 70% iskold ethanol og opbevares ved 4 ° C i mindst 30 min. Pellets blev resuspenderet i 0,5 ml 0,1 M HCI-buffer og inkuberet i 10 minutter ved 37 ° C. Reaktioner blev standset med 2,5 ml PBS. Celler blev inkuberet i 1 ml PI farveopløsning (30 uM (AppliChem); RNAse A 200 ug /ml (Sigma)) i mindst 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Et minimum på 10.000 celler blev analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af en FACS Canto II flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry System). Andelen af ​​celler i G1, S-fase og G2 /M blev bestemt under anvendelse Flowjo Software v9.2.

Immunofluorescensanalyse

PKM2 subcellulære lokalisering påvistes ved immunofluorescens. Efter 24 timers fastgørelse i celle chamber slides (Millipore), blev celler behandlet med OXA og fastgjort til dækglas i kold acetone i 10 minutter ved stuetemperatur. Blokering og permeabilisering blev udført med PBS-T /FBS 10%. Cellerne blev inkuberet ved stuetemperatur med et kanin polyklonalt anti-PKM2 primære antistof (Cell Signaling; 1: 100) i 1,5 time og efterfølgende, med sekundært antistof-anti-kanin Alexa-568 (Invitrogen; 1: 200). Kerner blev farvet med DAPI guld-antifade reagens (Invitrogen). Dækglas blev observeret med et fluorescensmikroskop Axiovision Z1 ved hjælp Apotome system på 40x olieimmersionslinse linse (Carl Zeiss, Heidelberg, Tyskland). Flere billeder blev taget ved forskellige fokus afstande ved hjælp af z-stabling (tykkelse interval: 0,750-1 um). At lokalisere PKM2 ved forskellige fokale dybder

qPCR array

Kvantitativ real-time PCR ( QRT-PCR) blev udført ved hjælp af menneskelige Cell Død Pathway Finder PCR Array 384 HT (PAH’er-212Z, SA Biosciences), et qPCR Array indeholdende 84 celledød-relaterede gener. Kort fortalt blev Totalt RNA opsamlet fra celler under anvendelse af EZNA total RNA Kit I (Omega) og behandlet med DNAse (Ambion). RNA blev kvantificeret med en NanoDrop TM ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). RNA integritet og mangel på genomisk forurening blev vurderet ved at køre prøver på 1% agarosegeler. I alt 500 ng RNA blev anvendt til revers transkription med RT

2 First Strand Kit (SA Biosciences). PCR-reaktioner blev udført under anvendelse af RT

2 profiler PCR-array nævnt før og RT

2 realtid SYBR Green PCR Master Mix (SA Biosciences) på en 7900HT Hurtig Real-time PCR-system (Applied Biosciences) og ifølge fabrikantens instruktioner. Relative ændringer i genekspression blev beregnet under anvendelse af 2

^ – ACt (tærskelcyklus) metode. Disse husholdning gener, der ikke udviste variabilitet mellem eksperimentelle betingelser blev udvalgt til at indgå i array (RPLP0 og ACTB) at normalisere cDNA beløb. Tre uafhængige biologiske gentagelser blev udført.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af PASW statistik 18 (IBM), undtagen for dosis-respons kurver analyse, der blev gennemført med PRISM4 program ( Graphpad Software). Statistiske forskelle mellem IC

50 blev bestemt ved grafisk afbildning af dosis-respons kurver og efterfølgende ikke-lineær regressionsanalyse og F-test. U-Mann Whitney testen blev anvendt til bestemmelse cellecyklusfordeling forskelle. Sammenligninger mellem forskellige eksperimentelle betingelser i qPCR Array og BMF ekspressionseksperimenter blev udført gennem T-Student-test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

P 0

.

05

.

Resultater

PKM2 gen silencing ændrer OXA følsomhed af humane kolorektal kræftceller

I et tidligere arbejde, vi fundet lavere niveauer af PKM2 protein og mRNA-ekspression i CRC celler med erhvervet resistens til oXA (HTOXAR3) og i tumorer fra oXA ikke-responderende patienter, især i dem med muteret p53 [8]. For at vurdere virkningen af ​​nedregulering PKM2 på OXA respons i parentale celler, vi specifikt inhiberede PKM2 genekspression ved hjælp siRNA oligonukleotider i HT29-celler. Følsomhed over for OXA i kontrol (siNTC) og PKM2 Knockdown celler (siPKM2) blev sammenlignet med MTT-analysen. Otteogfyrre timer efter gendæmpning blev celler podet i 96-brønds plader og behandlet i 24 timer med oxa doser i området 0-30 uM. PKM2 knockdown effektivitet var højere end 95% på både mRNA og protein niveauer og varede i 96 timer eller mere (S1 Fig). Som det kan ses i figur 1, i HT29-celler, PKM2 silencing førte til mere end 40% stigning i OXA resistens sammenlignet med siNTC celler (fold = 1,42; p 0,0001) bekræfter indflydelsen af ​​PKM2 nedregulering i oxaliplatin resistens i disse celler. Disse resultater blev valideret i SW480 celler (fold = 1,61 p 0,0001), men ikke i HCT116 hvor PKM2 knockdown var forbundet med højere følsomhed til OXA (fold = 0,80; p = 0,007) (figur 1). Vi antager, at PKM2 påvirket tumorcellerne reaktion på OXA afhængigt af yderligere faktor /s. Én en mulighed kunne være den mutationsstatus af p53, eftersom alle disse cellelinjer har unormal EGFR signalvejen (HT29 huser mutationer i BRAF og PI3K, HCT116 i KRAS og PI3K og SW480 i KRAS), men til stede forskellige p53 mutationsstatus (HT29 og SW480 er p53 muteret og HCT116 er p53 vægt). For at demonstrere denne hypotese, brugte vi en HCT116 isogen derivat med målrettet inaktivering af p53 (HCT116 p53 – /-) [26]. p53 nul-celler var meget modstandsdygtig over for oxaliplatin som tidligere rapporteret [27], men inhiberingen af ​​PKM2 genekspression igen førte til et fald i oxaliplatin resistens (figur 2). Disse resultater indikerede en mulig virkning ikke afhængigt af vildtype p53, men på en gevinst af funktion (GOF) mutation af p53. Ifølge denne, forventede vi en ændring i oxaliplatin følsomhed i HT29-siPKM2 celler efter lyddæmpende p53 genekspression. Som det er vist i fig 2, p53-gen knockdown i HT29-celler (siNTC) førte til en formindsket modstand mod oxaliplatin, men under disse betingelser manglen på PKM2 ekspression også øget resistens i disse celler. Tilsammen tyder disse resultater på, at rollen som PKM2 i oxaliplatin følsomhed er cellelinie-afhængige, og at andre faktorer, forskellige fra muteret p53

per se

, men sandsynligvis er forbundet med en p53-muteret kræftfremkaldende sammenhæng kunne være at påvirke de forskellige opførsel observeret i disse cellelinier efter PKM2 gendæmpning. Yderligere eksperimenter er berettiget for at demonstrere dette punkt.

Dosis-respons kurver for HT29, SW480 og HCT116 cellelinjer efter PKM2 gendæmpning og OXA behandling på 0-140 uM og 0-32 uM i 24 timer. Kurver repræsenterer middelværdierne fra mindst tre uafhængige forsøg. Celleproliferation blev målt ved MTT-assayet. Lodrette barer i grafikken repræsenterer ± SD. Mellemværker viser PKM2 inmunoblotting efter siRNA-directed inhibition. Specifikke IC50-værdierne for oxaliplatin i alle forhold, vises i tabellen. IC50-værdierne for Mock betingelser (uden transfektion) var meget lig dem af siNTC og er ikke vist. * p-værdier er resultat af sammenligning med siNTC tilstand.

Barer repræsenterer IC50 ± SD (gennemsnitsværdier fra mindst tre uafhængige forsøg) for oxaliplatin for hver tilstand. Mellemværker viser PKM2 og p53 inmunoblotting efter PKM2 gendæmpning. Specifikke IC50-værdierne for oxaliplatin i alle forhold, vises i tabellen. IC50-værdierne for Mock betingelser (uden transfektion) var meget lig dem af siNTC og er ikke vist. * P-værdier er resultatet af sammenligningen til siNTC tilstand. *

P- værdi

0,05. **

P-værdi

0,01; ***

P-værdi

0.001

PKM2 gendæmpning i HT29-celler er forbundet med en stigning i celle levedygtighed, men ikke med et fald i apoptose efter OXA eksponering

Efter vores vigtigste mål, vi ønskede at vide, om effekten af ​​PKM2 gen silencing på oxaliplatin modstand i vores

in vitro

model, skyldtes en stigning i celle levedygtighed, et fald i apoptose eller begge. PKM2 blev stille i HT29-celler før behandle dem med 15 pM OXA i 24 timer. Virkningerne blev sammenlignet med kontrolceller behandlet på samme måde. Ved at anvende trypanblå-farvning, levedygtighed satserne mellem OXA behandlede (T) og ubehandlede (NT) celler blev beregnet for 0, 24 og 48 timer recovery gange (efter behandling med oxalplatin blev cellerne efterladt til at komme sig 0, 24 og 48 h, henholdsvis). Fireogtyve timer efter behandling (tidspunkt 0h) blev registreret en klar effekt af OXA. Cell befolkning siNTC og siPKM2 celler formindsket progressivt efter 48 timers behandling. , Levedygtighed var dog lidt højere i siPKM2 celler i forhold til siNTC celler på alle tidspunkter, hvilket var statistisk signifikant ved 0 timer (Fig 3A og 3B). Dette faktum indikerer, at PKM2 påvirker OXA respons i disse celler. For yderligere at undersøge downstream mekanismer forbundet med PKM2-relateret stigning i levedygtighed som reaktion på OXA analyserede vi virkningerne for apoptose ved hjælp af Annexin V /PI dobbelt farvning-assay (figur 3C). Cytotoksicitet induceret af OXA ikke markant ændrer niveauer af induceret tidlig apoptose indtil 48 timer efter kontinuerlig eksponering (Fig 2D). Desuden fandt vi ikke signifikante forskelle i apoptose aktivering mellem tavshed PKM2 og kontrol celler i tilstedeværelse af OXA men der var en tendens til, at siNTC celler døde i en større andel end siPKM2 celler. Disse resultater forstærker ideen om, at PKM2 deltager i OXA resistens og at apoptose er ikke den vigtigste pathway impliceret i celledød aktiveres efter OXA eksponering i denne cellelinie.

Efter siRNA transfektion blev celler behandlet med 15 pM OXA i 24 h periode, observeret ved optisk mikroskopi ved 0, 24 og 48 timer efter afslutningen af ​​eksponering lægemiddel (0 h refererer til celler behandlet for 24 timer, 24 timer refererer til celler behandlet i 24 timer og til venstre for at komme sig efter yderligere 24 timer) (A ) og kvantificeres ved trypanblåt-farvning (B). Apoptose aktivering efter 24 og 48 timer af 10 uM OXA eksponering blev bestemt ved FITC-Annexin V /PI dobbelt farvning (C) og måles som et forhold mellem procentdele af apoptotiske behandlet (T) og ubehandlede (NT) celler (D) . Lodrette barer i grafikken repræsenterer ± SD. *

P-værdi

0,05. NT: ikke-behandlede celler. Optisk mikroskopi:. Mål 10x forstørrelse

Cell cyklus fordeling efter OXA eksponering ændres ved PKM2 knockdown i HT29 men ikke HCT116 celler

OXA er blevet rapporteret til at ændre proteinekspression og stabilitet p53 fører til en anholdelse af celler i G1 og /eller G2 /M hovedsageligt afhængigt af dens mutationsstatus [5, 27-29]. For at vurdere, om PKM2 udtryk OXA og p53 mutationsstatus, førte til forskelle i cellecyklusprogression, vi studerede cellecyklusfordeling hele 72 timer i PKM2 tavshed og kontrol HT29 og HCT116 celler efter kontinuerlig behandling med 10 pM OXA. Som det er vist i figur 4, ubehandlede celler udviste samme cellecyklusfordeling, i nærvær eller fravær af PKM2, hvilket betyder, at dette protein har nogen virkning på cellecyklusregulering

per se

. Imidlertid OXA inducerede forskellige reaktioner i cellecyklus kontrol mellem de to cellelinier. HCT116 celler behandlet med OXA blev primært bibeholdt i G1 og G2 /M-faser i hele 72 timers kontinuerlig eksponering til platin narkotika og PKM2 ablation ikke havde en signifikant effekt på cellecyklus distribution. I modsætning hertil behandling HT29-celler, førte dem der skal tilbageholdes i S og G2 /M faser hovedsagelig. Disse celler blev væsentligt påvirket af PKM2 knockdown i de sidste 48 og 72 timers eksponering (S-fase celler: 67.2% siNTC vs 48% siPKM2; p = 0,05; G2 /M fase celler: 66,5% siNTC vs 39,7% siPKM2; p = 0,05). siPKM2-HT29-celler ikke holde mere end 24 timer i en given fase af cellecyklus, således at man undgår cellecyklus checkpoints. Disse resultater bekræfter, at CRC-celler reagerer på OXA ændre deres cellecyklus afhængig p53 mutationsstatus og PKM2 ekspression.

Begge cellelinier blev transfekteret og /eller udsættes for 10 uM OXA til 8, 24, 48 og 72 timer . Efter propidiumiodidfarvning, andelen af ​​celler i cellecyklusfaser G1, S og G2 /M blev målt ved flowcytometri og kvantificeres ved Flowjo v9.2 software. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg.

P-værdier

≤ 0.05 er repræsenteret som en *.

PKM2 translokerer til kernen som reaktion på OXA i følsomme, men ikke i resistente celler

Det har blevet påvist, at genotoksisk skader forårsaget af UV og oxidativ stress stimulerer PKM2 nukleare translokation for at fremme celledød [23]. På grund af de farmakologiske egenskaber og virkningsmekanisme OXA, vi ønskede at vide, om det kunne fremkalde lignende ændringer i PKM2 subcellulære lokalisering. Vi behandlede HCT116, HT29 og HTOXAR3 celler med forskellige doser af lægemidlet (1,65, 10 og 30 uM) i hele 72 timer og vi observerede PKM2 lokalisering ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Som det er vist i figur 5, ved basale betingelser PKM2 blev fordelt i cytoplasmaet af alle analyserede cellelinier. Men udsættelse for OXA inducerede væsentlige ændringer i PKM2 lokalisering i HCT116 og HT29 cellelinjer, men påfaldende, blev disse ændringer ikke observeret i HTOXAR3 celler. Forbigående nuklear translokation af PKM2 blev observeret i HCT116-celler i de første 24 timer efter 1,65 uM OXA eksponering. Otteogfyrre timer senere, PKM2 blev flyttet igen i cytoplasmaet. På dette tidspunkt, optrådte de fleste celler skrumpet og fritliggende korrelerede med en stigning i mængden af ​​celledød induceret af de medikament. I HT29-celler, OXA inducerede en progressiv og øge den nukleare akkumulering af PKM2 langs 72 timer både ved 10 eller 30 uM. Celler med PKM2 i kernen viste en markant stigning i størrelse og vises en punkteret ekspressionsmønster af proteinet. I modsætning hertil PKM2 forblev i cytoplasmaet i HTOXAR3 celler gennem alle behandlingsgrupper tidspunkter ved lav (10 uM) og IC

50 (30 uM) doser af platin agent. Vigtigt er det, viste HTOXAR3 celler mindre PKM2 farvning end HT29-celler underbygger vores tidligere resultater [8]. HT29 siPKM2 celler blev anvendt som en kontrol af antistof-farvning specificitet (S2 Fig).

Immunoflourescence farvning af PKM2 (rød) viser nuklear akkumulering i HCT116 og HT29-celler efter behandling med OXA i en tid og dosisafhængig måde men ikke hos resistente HTOXAR3 celler. Kerner blev farvet i blåt. NT: Ikke-behandlede celler. Objektiv: 40x nedsænkning olie. Målestok:. 10 um

Det er blevet rapporteret, at nuklear PKM2 og niveauer af β-catenin phosphorylering korrelerer med kvaliteter af gliom malignitet og prognose [30]. Andre forfattere har også rapporteret basal PKM2 nukleare lokalisering i humane cellelinjer fra forskellig oprindelse, herunder kolorektal cancer [31]. For at bekræfte PKM2 subcellulære lokalisering i humane kolorektale tumorer og dens mulige forbindelse med total β-catenin, vi analyserede deres respektive immunohystochemical farvning i et væv microarray af 41 tumorprøver fra metastatiske CRC patienter, der tidligere blev brugt af os [8]. Vores resultater klart bekræftet PKM2 cytoplasmatisk plet i alle de analyserede tumorer (S3 Fig). Det er bemærkelsesværdigt, at disse observationer blev udført med anvendelse af 2 forskellige antistoffer (se S1 fil). PKM2 og β-catenin blev stærkt udtrykt i de fleste af de analyserede tumorer, men vi kunne ikke finde nogen positiv sammenhæng mellem PKM2 og β-catenin nukleare lokalisering.

PKM2 gendæmpning ændrer udtrykket mønstre af celledød gener i CRC cellelinier i respons på oXA

Som det er blevet vist i dette arbejde, PKM2 translokerer til kernen af ​​HT29-celler som respons på denne platin agent mens i sine oxa-resistent afledte celler det ikke. Hensyntagen til tidligere resultater associere nuklear translokation af PKM2 og aktiveringen af ​​caspase-uafhængig celledødsveje [23], vi spekuleret på, at PKM2 fremmer transkription af gener involveret i respons på OXA. Ved at bruge en RT

2 profiler qPCR Array analyserede vi ekspression af 84 centrale gener relateret til forskellige celle død mekanismer (apoptose, nekrose og autofagi) for at afklare, hvilke celledød vej /s eller gen /s spiller en stor rolle som reaktion på OXA og om PKM2 gendæmpning påvirker de tilknyttede transskription mønstre. For at gøre dette, HT29-celler blev transficeret med specifikke siRNA’er som beskrevet før, og blev behandlet med OXA 10 uM i 48 timer for at sikre et højt niveau af nuklear PKM2 (figur 5). Som det er vist i fig 6A, mønstre af genekspression som reaktion på OXA var helt anderledes blandt HT29, siPKM2-HT29 og HTOXAR3 celler. Som vi forventede, at andelen af ​​deregulerede gener som følge af OXA eksponering var betydeligt højere i HT29-celler i sammenligning med HTOXAR3 siden 10 uM OXA svarer til IC

50 af de følsomme celler og omtrent til IC

25 for HTOXAR3 celler. Interessant siPKM2 celler udviste et “mellemprodukt” mønster af celledød gener ekspression. Som det klart er vist i varmen kortet i fig 6B, efter OXA behandling, genekspression profil siPKM2 celler var tættere på HTOXAR3 celler end med den for de følsomme celler. Otteogtyve af disse gener viste den højeste (fold-ændring) og /eller statistisk signifikante forskelle blandt de eksperimentelle betingelser analyseres (tabel 1 og S1 Table). 0,05.