PLoS ONE: microRNA-9 Undertrykker spredning, invasion og metastase af Gastric Cancer Cells gennem Målretning cyclin D1 og Ets1

Abstrakt

De seneste tal viser, at ændrede microRNA-9 (miR-9) udtryk er impliceret i udviklingen af ​​mavekræft. Men de nøjagtige roller og underliggende mekanismer i miR-9 i spredning, invasion og metastase af mavekræft stadig ukendt. I denne undersøgelse blev MIR-9 sig at være nedreguleret og omvendt korreleret med ekspressionen af ​​cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (Ets1) i gastrisk cancer væv og cellelinier. Bioinformatik analyse afslørede de formodede MIR-9 bindingssteder i de 3′-utranslaterede regioner (3′-UTR) af cyclin D1 og Ets1 mRNA. Ektopisk udtryk eller knockdown af miR-9 resulterede i responsivt ændret udtryk for cyklin D1, Ets1 og deres downstream mål phosphoryleret retinoblastom og matrixmetalloproteinase 9 i dyrkede gastrisk cancer cellelinjer SGC-7901 og AGS. I det luciferase reporter systemet, miR-9 direkte målrettet 3′-UTR af cyklin D1 og Ets1, og disse effekter blev afskaffet ved at mutere MIR-9 bindingssteder. Over-ekspressionen af ​​miR-9 undertrykt spredning, invasion, og metastase af SGC-7901 og AGS celler

in vitro

og

in vivo

. Genoprettelse af MIR-9-medieret nedregulering af cyclin D1 og Ets1 ved transient transfektion, reddede cancercellerne fra fald i proliferation, migration og invasion. Endvidere anti-MIR-9 inhibitor fremmet proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller, mens vælte af cyclin D1 eller Ets1 delvist phenocopied virkningerne af MIR-9 overekspression. Disse data indikerer, at MIR-9 undertrykker ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 via bindingssteder i deres 3′-UTR, således inhibere proliferation, invasion og metastase af mavekræft

Henvisning:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 Undertrykker spredning, invasion og metastase af Gastric Cancer Cells gennem Målretning cyclin D1 og Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: December 29, 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.600.278, No. 30.772.359, No. 81.071.997, No. 81.072.073, No. 81.272.779), Program for New Century Excellent Talenter i University (NCET-06-0641), Videnskabelig Forskning Institut til returneret Overseas Chinese Lærde (2008-889), og grundlæggende forskningsmidler for de centralasiatiske universiteter (2012QN224). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i verden [1]. På trods af den forbedrede kirurgiske og multimodal terapi, prognosen for fremskreden mavekræft stadig dårlig på grund af gentagelse, invasion og metastase, med en 5-års overlevelse under 30% [1]. Et bedre kendskab til mekanismerne bag tumor progression er berettiget til at opdage nye paradigmer for diagnosticering og behandling af gastrisk kræft [2]. MikroRNA’er (miRNA), en nylig identificeret kategori af små og højt konserverede ikke-kodende RNA’er, kan deltage i den post-transkriptionel regulering af genekspression gennem delvis komplementær binding med 3 ‘utranslaterede regioner (3’-UTR’er) af mål-mRNA, hvilket resulterer i translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [3]. Ny dokumentation viser, at miRNA er involveret i de biologiske processer relateret til apoptose, proliferation, differentiering, invasion og metastase, mens deregulering af som er afgørende for kræft initiering og progression [3]. Det er i øjeblikket presserende at undersøge rollerne for miRNA og deres målgener i tumorprogression ved forsøgsmodeller.

I human gastrisk cancer, en række miRNA er blevet rapporteret at være aberrant overudtrykt eller nedreguleret under progression af gastrisk cancer, herunder mIR-21 [4], mIR-15b [5], mIR-16 [5], og mIR-101 [6]. Disse miRNA spille onkogene eller tumor-undertrykkende roller i reguleringen af ​​cellevækst, migration og invasion ved at undertrykke deres målgener. For eksempel onkogen MIR-21 er aberrant overudtrykt i gastrisk cancer, og forbedrer proliferation og invasivitet af gastriske cancerceller ved målretning af reversion-inducerende cystein-rige protein med Kazal-motiver [4]. I mellemtiden MIR-15b og MIR-16 er nedreguleret i gastrisk cancer, og bidrage til multiresistens af gastriske cancerceller ved modulering af apoptose via målretning B-celle leukæmi /lymfom 2 [5]. MIR-101 er nedreguleret i gastrisk cancer væv og cellelinier, mens ektopisk ekspression af MIR-101 signifikant inhiberer proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller ved målretning forstærker af Zeste homolog 2, cytochrom c-oxidase subunit II, og myeloid celle-leukæmi sekvens 1 [6]. Derfor har det været fokus til yderligere at udforske udtryk og funktion af miRNA i tumor biologi mavekræft.

MicroRNA-9 (miR-9) er først identificeret som en af ​​de afgørende regulatorer til udvikling , fysiologi og patologi nervesystem i flere organismer, herunder

Drosophila

, zebrafisk, og pattedyr [7] – [9]. En række efterfølgende undersøgelser har vist, at ændret MIR-9-ekspression er associeret med udviklingen og progressionen af ​​cancere [10] – [14]. Tidligere undersøgelser viser, at MIR-9 er betydeligt nedreguleret i gastrisk cancer, hvilket indebærer dets potentielle roller i tumorudvikling [15] – [18]. Det er også angivet, at MIR-9 kan modulere proliferationen af ​​gastriske cancerceller via målretning den kaudale typen homeobox 2 (CDX2) [19] og NF-kappa B (NF-KB) [16]. Men den nøjagtige funktion og underliggende mekanismer af miR-9 i udviklingen af ​​mavekræft stadig berettige til yderligere undersøgelser. I denne undersøgelse, viser vi, for første gang, at miR-9 direkte henvender cyklin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (Ets1), og undertrykker proliferation, invasion og metastase af gastriske kræftceller

i vitro

in vivo

.

Resultater

miR-9 var nedreguleret og omvendt korreleret med ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i mavekræft væv og cellelinjer

for at undersøge miR-9 udtryk i gastrisk kræft, gastrisk kræft væv og tilstødende ikke-neoplastisk slimhinde blev indsamlet fra 86 primære tilfælde. Real-time kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR) afslørede, at MIR-9 blev nedreguleret i gastrisk cancer væv end i tilstødende ikke-neoplastisk mucosa (

P

= 0,001, Fig. 1A). MIR-9 udtryk var signifikant lavere i gastrisk kræfttilfælde med dybere gastrisk væg invasion (

P

0,001), lymfeknude metastaser (

P

0,001), fjernmetastaser (

P

= 0,022), og avancerede TNM stadie (

P

= 0,01) (tabel S1). I modsætning hertil blev højere cyklin D1 og Ets1 transkriptniveauer påvist i mavekræft væv (

P

0,0001 og

P

. . 0,0001 henholdsvis figur 1B og figur 1C). Der var en omvendt korrelation mellem miR-9-ekspression og cyclin D1 transkriptniveauer i mavekræft væv (

P

. 0,001, figur 1D). Desuden blev en omvendt korrelation mellem miR-9-ekspression og Ets1 transkriptniveauer også bemærket i disse kræft væv (

P

. 0,001, figur 1E). Lower MIR-9-ekspression og højere transkriptniveauer af cyclin D1 og Ets1 blev observeret i gastriske cancercellelinier end i normale gastriske epitel GES-1-celler [20] (fig. 1F). Immunhistokemisk farvning blev udført for at observere ekspression af cyclin D1 og Ets1 i disse cancerpatienter prøver (fig. S1). Nuklear cyklin D1 blev bemærket i 26/86 (30,2%) tilfælde, mens der blev observeret nukleare og cytoplasma farvning af Ets1 i 58/86 (67,4%) tilfælde (tabel S1). Immunoreaktiviteten af ​​cyklin D1 og Ets1 var signifikant højere i gastrisk kræfttilfælde med dybere gastrisk væg invasion (

P

0,001 og

P

= 0,001), lymfeknude metastaser (

P

0,001 og

P

0,001), fjernmetastaser (

P

0,001 og

P

0,001), og avancerede TNM stadie (

P

0,001 og

P

= 0,004) (tabel S1). Lavere miR-9-ekspression blev observeret i mavekræft væv med højere immunfarvning af cyclin D1 (

P

0,0001, figur 1G.) Eller Ets1 (

P

. 0,0001, Fig 1H ). Disse resultater indikerede, at MIR-9 blev nedreguleret og omvendt korreleret med ekspression af cyclin D1 og Ets1 i gastrisk cancer væv og cellelinier.

A, B og C, real-time kvantitativ RT-PCR viste, at sammenlignet med tilstødende ikke-neoplastiske mucosa (n = 86), nedregulering af mIR-9 og højere transkriptniveauer af cyclin D1 og Ets1 blev påvist i gastrisk cancer væv (n = 86). D og E, der var en omvendt korrelation mellem miR-9-ekspression og transcript niveauer af cyklin D1 eller Ets1 i mavekræft væv. F, lavere MIR-9 ekspression og højere cyclin D1 og Ets1 transkriptniveauer blev observeret i gastriske cancercellelinier (MKN-74, SGC-7901 og AGS), sammenlignet med dem i normale gastriske epitel GES-1-celler. G og H, lavere MIR-9 ekspression blev observeret i gastrisk cancer væv med højere immunfarvning af cyclin D1 eller Ets1. Symbolerne (* og #) indikerer et betydeligt fald og en betydelig stigning fra GES-1 hhv.

miR-9 nedreguleret ekspression af cyklin D1 og Ets1 gennem post-transkriptionel repression

for at undersøge den hypotese, at miR-9 kan påvirke ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i gastrisk kræft, var beregningsmæssige forudsigelse udført af miRNA-databaser. Potentielle bindingssteder af MIR-9 med høj komplementaritet blev bemærket ved baser 2974-2995 af cyclin D1 3′-UTR og 2648-2670 af Ets1 3′-UTR (fig. 2A). For at undersøge de direkte virkninger af miR-9 på ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i gastriske kræftceller, vi udførte miRNA overekspression eksperimenter. Stabil transfektion af miR-9 forløber i SGC-7901 og AGS celler resulterede i stigning i miR-9 niveauer (fig. S2). Western blot, RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at overekspression af MIR-9 resulterede i nedsat protein og transkriptionelle niveauer af cyclin D1 og Ets1 i gastriske cancerceller end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock) ( fig. 2B, fig. 2C og fig. 2D). Desuden niveauerne af phosphoryleret retinoblastoma (pRB, en nedstrøms effektor af cyclin D1) [21] og matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9, en nedstrøms gen af ​​Ets1) [22] var nedsat i MIR-9 over-udtrykkende cancerceller (fig. 2B, fig. 2C og fig. 2D). For yderligere at undersøge undertrykkende rolle miR-9 i ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1, vi udførte miR-9 Knockdown eksperimenter ved transfektion af anti-miR-9 eller inhibitorer negativ kontrol (anti-NC) i GES-1, SGC -7901 og AGS celler. Transfektion af anti-MIR-9 inhibitor naturligvis faldt det endogene MIR-9-ekspression (fig. S3A), og opreguleret protein niveauer af cyclin D1, pRb, Ets1 og MMP-9 end dem transficeret med anti-NC (fig. 2E og fig. S4A). Real-time kvantitativ RT-PCR-analyserne viste de forbedrede transkriptniveauer af cyclin D1, Ets1 og MMP-9 i dyrkede celler transficeret med anti-MIR-9 inhibitor, når der sammenlignes med dem, transficeret med anti-NC (fig. 2F og fig. s4b). Samlet disse resultater viste, at miR-9 betydeligt hæmmet udtryk for cyklin D1 og Ets1 gennem post-transkriptionel repression.

A, skema af de potentielle bindingssteder af miR-9 i 3′-UTR af cyklin D1 og Ets1, lokalisering ved baserne 2974-2995 og 2648-2670, henholdsvis. B, stabil transfektion af MIR-9 precursor resulterede i nedsat proteinniveauer af cyclin D1, Ets1 og deres nedstrøms mål pRB og MMP-9 i gastrisk cancer SGC-7901 og AGS celler end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock). C og D, transkriptet niveauer af cyclin D1, Ets1 og MMP-9 blev reduceret i MIR-9 precursor-transficerede SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med dem i mock celler. E, transfektion af anti-miR-9-hæmmer (100 nmol /l) resulterede i øgede protein niveauer af cyklin D1, Ets1 og deres downstream mål pRB og MMP-9 i SGC-7901 og AGS celler end dem transficeret med negativ kontrol-hæmmer ( anti-NC, 100 nmol /l). F, Transcript niveauer af cyclin D1, Ets1, og MMP-9 blev forøget i SGC-7901 og AGS celler transficeret med anti-MIR-9 inhibitor (100 nmol /l), når der sammenlignes med dem, transficeret med anti-NC (100 nmol /l). Symbolerne (* og #) indikerer et betydeligt fald og en betydelig stigning fra mock eller anti-NC, henholdsvis.

miR-9 direkte målrettet cyclin D1 og Ets1 i gastriske kræftceller

for at bestemme om mIR-9 kunne undertrykke ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 ved at målrette sine bindingssteder i 3′-UTR, PCR produkter, der indeholder intakte målsteder eller mutation af mIR-9 frø genkendelsessekvenser (fig. 3A) blev indsat i luciferase reporter vektor. Plasmiderne blev transficeret i gastriske cancerceller stabilt transficeret med negativ kontrolvektor (mock) eller MIR-9 precursor.

Renilla

luciferaseaktiviteter normaliseret til de af ildflue blev væsentligt reduceret i SGC-7901 og AGS celler stabilt transficeret med miR-9 forløber (fig. 3B), og disse effekter blev afskaffet ved at mutere den formodede miR-9 bindingssteder i 3′-UTR af cyclin D1 og Ets1 (fig. 3B). Endvidere knockdown af MIR-9 med anti-MIR-9 inhibitor øgede luciferaseaktiviteterne i GES-1, SGC-7901 og AGS celler (fig. 3C og Fig. S4C), mens mutation af MIR-9 genkendelsessted afskaffet disse virkninger (fig. 3C og fig. S4C). Disse resultater viste, at miR-9 direkte og specifikt interageret med målet sites i 3′-UTR af cyklin D1 og Ets1.

A, skema og sekvens af den intakte miR-9 bindingssted (Wt) og dens mutation (Mut) inden luciferasereporteren vektorer. B, stabil transfektion af miR-9 forløber i SGC-7901 og AGS celler resulterede i nedsat luciferaseaktiviteter af 3′-UTR reporter af cyklin D1 og Ets1 end dem transficeret med negativ kontrol vektor (mock), som blev ophævet ved mutation i formodede miR-9 bindingssteder. C, transfektion af anti-MIR-9 inhibitor (100 nmol /l) i SGC-7901 og AGS celler øgede luciferaseaktiviteterne end dem transficeret med anti-NC (100 nmol /l), mens mutation af MIR-9 genkendelsessted afskaffet disse effekter. Symbolerne (* og #) indikerer et betydeligt fald og en betydelig stigning fra mock eller anti-NC, henholdsvis.

miR-9 undertrykte

in vitro

spredning af mavekræft celler gennem målrettet cyclin D1

Da ovenstående beviser viste, at miR-9 hæmmede cyklin D1 udtryk, og kombinere de kendsgerninger, cyklin D1 spiller en kritisk rolle i cellecyklusprogression og spredning af kræftceller [21], vi yderligere undersøgt virkningerne af mIR-9 overekspression og målgen restaurering på dyrkede gastriske kræftceller. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1, reddede MIR-9-induceret nedregulering af cyclin D1 (fig. 4A og fig. 4B). I kolonidannelse assayet, MIR-9 overekspression svækket væksten af ​​SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med dem, transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 4C). Flowcytometri viste, at miR-9 overekspression induceret cellecyklusstop på G

0 /G

1 fase i SGC-7901 og AGS-celler (Fig. 4D). Desuden transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1, i SGC-7901 og AGS celler gendannet spredning hæmning og cellecyklusstandsning induceret af overekspression af MIR-9 (fig. 4C og fig. 4D). På den anden side, vi undersøgt virkningerne af miR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Indførelse af anti-miR-9-hæmmer ind i disse celler resulterede i forbedrede evner i proliferation (Fig. S3B) og cellecyklusprogression (fig. S3C). Disse resultater indikerede, at MIR-9 bemærkelsesværdigt undertrykt

in vitro

proliferation og cellecyklusprogression af gastriske cancerceller gennem målretning cyclin D1.

A og B, Western blot og real-time kvantitativ RT -PCR indikerede, at transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1, restaureret nedreguleringen af ​​cyclin D1 induceret af mIR-9 over-ekspression i gastrisk cancer SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med dem, transficeret med negativ kontrolvektor ( mock). C, i kolonidannelse assayet, MIR-9 overekspression svækket væksten af ​​SGC-7901 og AGS celler end af fingeret celler, som blev reddet ved transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1. D, flowcytometri viste, at MIR-9 overekspression inducerede cellecyklusstandsningen på G

0 /G

1 fase i SGC-7901 og AGS celler end i mock celler, der blev reddet ved transfektion af cyclin D1 , men ikke af Ets1. Symbolet (*) angiver et signifikant fald fra mock.

miR-9 svækket

in vitro

migration og invasion af gastriske kræftceller ved at målrette Ets1

da tidligere undersøgelser viser de vigtige roller Ets1 i invasionen og metastase af cancerceller [23], [24], vi yderligere undersøgt virkningerne af miR-9 overekspression og målgen restaurering på migration og invasion af mavekræft SGC -7901 og AGS celler. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1, reddede MIR-9-induceret nedregulering af Ets1 (fig. 5A og fig. 5B). I Transwell migration assay gastriske cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor præsenteret en forringet kapacitet migration end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 5C). I matrigel invasion assay, miR-9 overekspression svækket invasiviteten af ​​SGC-7901 og AGS-celler (Fig. 5D). Desuden transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1, ind SGC-7901 og AGS cellelinier genoprettede MIR-9-meditaed inhibering på migration og invasion (fig. 5C og fig. 5D). Desuden har vi undersøgt virkningerne af miR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Transfektion af anti-MIR-9-inhibitor resulterede i øget migration og invasion af disse celler (fig. S3D og fig. S3E). Disse resultater indikerede, at MIR-9 bemærkelsesværdigt svækkede

in vitro

migration og invasion af gastriske cancerceller gennem målretning Ets1.

A og B, Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR indikerede at transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1, restaureret nedreguleringen af ​​Ets1 induceret af mIR-9 over-ekspression i gastrisk cancer SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med dem, transficeret med negativ kontrolvektor (mock). C, i Transwell migration assay gastriske cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor præsenteret en forringet kapacitet migration end den mock-celler, som blev reddet ved transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1. D, i matrigel invasion assay MIR-9 overekspression svækkede invasionen kapaciteter af SGC-7901 og AGS celler end dem af mock-celler, som blev reddet ved transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1. Symbolet (*) angiver et signifikant fald fra mock.

miR-9 svækket vækst og metastase af gastriske kræftceller

in vivo

Vi næste undersøgt effekten af ​​miR-9 mod tumorvækst og metastase

in vivo

. Stabil transfektion af MIR-9 precursor i SGC-7901 eller AGS celler resulterede i nedsat vækst og vægt af subkutane xenotransplantattumorer i athymiske nøgne mus, sammenlignet med dem, stabilt transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 6A og Fig. 6B ). Endvidere blev ekspressionen af ​​cyclin D1, Ets1 og nedstrøms MMP-9 reduceres ved stabil transfektion af MIR-9 precursor (Fig. 6C). Den CD31-positive gennemsnitlig kardensitet blev reduceret inden tumorer dannet ved injektion af cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor (Fig. 6D). I de eksperimentelle metastase undersøgelser, SGC-7901 eller AGS celler stabilt transficeret med MIR-9 precursor etableret statistisk færre lung metastatiske kolonier end mock gruppe (fig. 6E). Disse resultater antydede, at MIR-9 hæmmede væksten og metastasen af ​​gastriske cancerceller

in vivo

.

A og B, hypodermisk injektion af SGC-7901 eller AGS celler stabilt transficeret med MIR-9 forstadium til athymiske nøgne mus (n = 5) resulterede i nedsat størrelse og vægt af subkutane xenotransplantattumorer end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock, n = 5). C, hematoxylin og eosin (H & E) og immunhistokemisk farvning viste, at stabil transfektion af MIR-9 precursor resulterede i nedsat ekspression af cyclin D1, Ets1, og MMP-9 i tumorer. Scale barer: 100 um. D, den CD31-positive gennemsnitlig kardensitet blev reduceret inden tumorer dannet af kræftceller stabilt transficerede af MIR-9 precursor. Scale barer: 100 um. E, i den eksperimentelle metastase assay cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor etableret signifikant færre metastatiske lunge- kolonier (pilespidser) i athymiske nøgne mus (n = 6). Scale barer: 100 um. Symbolet (*) angiver et signifikant fald fra mock.

Knockdown af cyklin D1 og Ets1 phenocopied miR-9 overekspression-medieret hæmning af proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller

in vitro

Da ovenstående resultater viste den negative regulering af cyklin D1 og Ets1 udtryk af miR-9, vi hypotese, at knockdown af cyklin D1 og Ets1 kunne udøve lignende virkninger på dyrkede gastriske kræftceller. De små interfererende RNA (siRNA’er) rettet mod kodning region cyklin D1 og Ets1, si-CCND1 og si-Ets1, designet og transficeret ind SGC-7901 og AGS celler. Transfektion af si-CCND1 og si-Ets1 resulterede i nedsat ekspression af cyclin D1, pRB, Ets1 og MMP-9 i gastriske cancerceller, når det blev sammenlignet med dem transfekteret med scramble siRNA (si-SCB) (fig. 7A, Fig . 7D og fig. S5). Knockdown af cyklin D1 undertrykte spredning og induceret cellecyklusstop på G

0 /G

1 fase i SGC-7901 og AGS celler (Fig. 7B og fig. 7C). Desuden knockdown af Ets1 i SGC-7901 og AGS celler resulterede i nedsat kapaciteter af migration og invasion (fig. 7E og fig. 7F). Disse resultater antydede, at knockdown af cyklin D1 og Ets1 phenocopied (besad de fænotyper svarende til) miR-9 overekspression hæmme proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller

in vitro

.

A, transfektion af si-CCND1 (100 nmol /l) i mavekræft SGC-7901 og AGS celler resulterede i nedsat udtryk for cyklin D1 og et nedstrøms mål pRB end dem transficeret med scramble siRNA (si-SCB, 100 nmol /l ). B, knockdown af cyklin D1 undertrykte spredning af SGC-7901 og AGS celler end dem transficeret med si-SCB. C, knockdown af cyklin D1-induceret cellecyklusstop på G

0 /G

1 fase end dem transficeret med si-SCB. D, transfektion af si-Ets1 (100 nmol /l) i gastriske cancerceller resulterede i nedsat ekspression af Ets1 og dets nedstrøms gen MMP-9 end dem transficeret med si-SCB (100 nmol /l). E, migrationen kapaciteter SGC-7901 og AGS celler blev nedsat med transfektion af si-Ets1 end dem transficeret med si-SCB. F, de invasion kapaciteter SGC-7901 og AGS celler blev reduceret med transfektion af si-Ets1 end dem transficeret med si-SCB. Symbolet (*) angiver et signifikant fald fra si-SCB.

Diskussion

Det er blevet veletableret, at miR-9 udtryk profil i kræft afhængig vævsdistribution. I primære hjernetumorer, er miR-9 forhøjet, og fungerer som en væsentlig faktor for neurale carcinogenese [10]. MIR-9 er også overudtrykt i livmoderhalskræft [11], tyder på tumorpromotoren rolle i tumorudvikling og progression. Men MIR-9 nedreguleres i flere humane cancere, herunder pancreascancer [12], ovariecancer [13] og kolorektal cancer [14], og er forbundet med den maligne progression af brystcancer [25] og kolorektal cancer ( 14). Luo

et al.

Bemærkede nedregulering af miR-9 i 24 mavekræft prøver [15], som efterfølgende blev bekræftet i 9 [16], 72 [17], og 13 [18] mavekræft tilfælde. Men Inoue

et al.

Rapporterede opregulering af miR-9 i 5 mavecancerpatienter ved real-time PCR-baserede miRNA arrays [26], og denne anden vurdering i miR-9 udtryk profil kan skyldes til heterogenitet begrænsede eksemplarer. I denne undersøgelse viser vi, at MIR-9 er betydeligt nedreguleret i 86 primære gastrisk cancer prøver end i tilstødende ikke neoplastiske væv, hvilket er konsistent med tidligere resultater [15] – [18]. Vigtigt er det, vi også bekræfte, at miR-9 udtryk omvendt er forbundet med de kliniske faser, invasion og metastase af mavekræft. Hos mennesker er det modne MIR-9 kodes af tre uafhængige gener, MIR-9-1, MIR-9-2 og MIR-9-3, lokalisering på kromosomerne 1, 5 og 15, henholdsvis [27]. Tidligere undersøgelser viser, at nedreguleret MIR-9 ekspression i gastrisk cancer skyldes afvigende hypermethylering af promotorregionen af ​​MIR-9 kodende gener [17]. Tilsvarende er afvigende hypermethylering af MIR-9 familiemedlemmer gener også rapporteret i nogle primære tumorer med lymfeknudemetastaser, såsom coloncancer, lungecancer, brystcancer og melanom [14], [28]. Vigtigt er det, den nuværende undersøgelse rapporteret den inverse korrelation mellem MIR-9 niveauer og ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 i gastrisk cancer væv, hvilket indebærer, at cyclin D1 og Ets1 kan blive negativt reguleret af MIR-9.

Funktionen og målgener af mIR-9 er tumor-specifikke og afhængige af cellulær sammenhæng. MIR-9 er i stand til at undertrykke E-cadherin ekspression ved brystcancer [29], hvilket resulterer i den nukleare translokation af β-catenin og dens binding med transkriptionsfaktorer T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor 1, og efterfølgende opreguleret transkription af gener, der letter celleproliferation og angiogenese [29]. Tvungen MIR-9 ekspression i brystcancercellelinier resulterer også i væsentlige ekspressionssystemer ændringer af multiple gener i p53-relaterede apoptosecyklus [30]. Gennem direkte rettet mod NF-KB, ektopisk udtryk for miR-9 hæmmer

in vitro

in vivo

væksten af ​​kræft i æggestokkene celler [31] samt vækst og metastaser af melanom [32] . I neuroblatoma, overekspression af MIR-9 inhiberer invasion, metastase, og angiogenese af tumorceller ved at målrette matrixmetalloproteinase 14 [33]. Wan

et al.

Rapporterede, at overekspression af miR-9 hæmmede

in vitro

in vivo

vækst af gastrisk adenocarcinom cellelinje MGC803 gennem undertrykke NF-KB på post-transkriptionelle niveau [16]. Men i en nylig undersøgelse, Rotkrua

et al.

Indikerede, at miR-9 kan være involveret i gastrisk carcinogenese gennem nedregulere CDX2, og knockdown af miR-9 faldt,

in vitro

spredning af gastrisk kræft MKN-45 celler [19], mens deres resultater behøver at blive yderligere styrket med miR-9 over-udtryk, målgen redning, og

in vivo

undersøgelser. Desuden, i øjeblikket er kontroversiel, om CDX2 spiller en onkogen eller tumor-suppressor rolle i gastrisk carcinogenese [34], [35]. Desuden er de potentielle roller MIR-9 i invasionen og metastase af mavekræft ikke klarlagt indtil videre. , Funktionen og direkte mål for miR-9 i mavekræft garanterer yderligere undersøgelse.

I denne undersøgelse viste vi, at overekspression af miR-9 svækkede proliferation, migration og invasion af gastrisk kræftceller, som var ligner cyklin D1 eller Ets1 knockdown, hvilket tyder på den potentielle anvendelse af miR-9 som mål for de terapeutiske af mavekræft. Derudover vores data bekræftede, at MIR-9 direkte målrettet cyclin D1 og Ets1 i gastriske cancerceller gennem 3′-UTR luciferase reporter assay. Siden seneste beviser for, at visse miRNA alternativt kan modulere genekspression ved at interagere med initiativtagerne [36] – [38], de potentielle roller miR-9 i regulering af transskription af cyklin D1 og Ets1 gennem interaktion med initiativtagere fortsat uklare og garanterer vores videre undersøgelse. Cyclin D1 er et proto-onkogen, der hører til familien af ​​G

1 cykliner, og spiller en vigtig rolle i cellecyklus G

1 til S overgang ved at binde dets partnere cyclin-afhængig kinase 4 og 6 til at phosphorylere og inaktivere RB protein [21]. Over-ekspressionen af ​​cyklin D1 er en tidlig begivenhed i carcinogenese i humane kolorektale, esophageal og galdeblære kræft [39], og er en prognostisk indikator forbundet med dårlig overlevelse i esophageal, bryst, og urinveje kræft [39]. Cyclin D1 overekspression i humane kræftformer belyses af flere mekanismer, herunder genomiske forandringer, post-transkriptionel regulering og protein stabilisering posttranslationel [39]. De seneste tal viser, at miR-16-1 undertrykker cyklin D1 udtryk ved post-transkriptionel niveau via binding sin 3′-UTR i mantlecellelymfom [40]. I den aktuelle undersøgelse, viste vores resultater, at MIR-9-medieret inhibering på cellecyklusprogression og celleproliferation blev reddet ved restaurering af cyclin D1-ekspression i gastriske cancerceller, hvilket antyder, at identifikationen af ​​cyclin D1 som MIR-9 målgen, kan forklare, i det mindste delvis, hvorfor overekspression af mIR-9 undertrykte proliferationen af ​​gastriske cancerceller.

Ets1, et medlem af ETS-familien af ​​transkriptionsfaktorer, binder til specifikke DNA-sekvenser indeholdende en GGAA /T core motiv [22], og deltager i tumorinvasion og metastase gennem transkriptionel regulering af adskillige gener, der er ansvarlige for ekstracellulær matrix remodellering, migration og invasion, såsom matrixmetalloproteinase og urokinaseplasminogenaktivator [22]. Til dato har et stigende antal kliniske undersøgelser vist de vigtige roller Ets1 i tumor udvikling og progression af forskellige solide tumorer [23], [24].