PLoS ONE: Integrativ Opdagelsen af ​​epigenetisk derepresseret Cancer testis Antigener i NSCLC

Abstrakt

Baggrund

Kræft /testis-antigener (CTA’er) blev først opdaget som immunogene mål normalt udtrykkes i germlinie celler, men udtrykkes forskelligt i forskellige humane cancerformer. I denne undersøgelse anvendte vi en integrativ epigenetisk screening tilgang til at identificere koordineret udtrykte gener i human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), hvis transkription drives af promotor demethylering.

Metode /vigtigste resultater

Vores screening tilgang fundet 290 betydelige gener fra de over 47.000 udskrifter indarbejdet i Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 udtryk array. Af de øverste 55 kandidater, 10 viste både differential overekspression og promoter region hypometylering i NSCLC. Overraskende 6 af de 10 gener opdaget af denne tilgang var CTA’er. Anvendelse af en separat kohorte af primær tumor og normalt væv, vi valideret NSCLC promotor hypometylering og forøget ekspression ved kvantitativ RT-PCR for alle 10 gener. Vi bemærkede betydelig, koordineret coekspression af flere målgener, samt koordineret promotor demethylering, i et stort sæt af individuelle tumorer, der var forbundet med SCC undertype af NSCLC. Desuden har vi identificeret 2 roman målgener som udviste vækstfremmende virkninger i flere cellelinjer.

Konklusioner /Betydning

Koordineret promotor demethylering i NSCLC er associeret med afvigende ekspression af CTA’er og potentiale, nye kandidat protoonkogener der kan identificeres ved hjælp af integrative opdagelse teknikker. Disse resultater har stor betydning for opdagelsen af ​​nye CTA’er og CT-antigen rettet immunterapi

Henvisning:. Glazer CA, Smith IM, Ochs MF, Begum S, Westra W, Chang SS, et al. (2009) Integrativ Opdagelsen af ​​epigenetisk derepresseret Cancer testis Antigener i NSCLC. PLoS ONE 4 (12): e8189. doi: 10,1371 /journal.pone.0008189

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: September 18, 2009; Accepteret: November 16, 2009; Udgivet: December 4, 2009

Copyright: © 2009 Glazer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. Califano understøttes af en klinisk Innovator Award fra Flight Attendant Medical Research Institute, og National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05) og EDRN U01CA084986. Dr. Glazer er finansieret delvist af en NIH T32 Research Training Grant. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Det er velkendt, at CTA’er overudtrykkes i forskellige tumortyper, med ringe eller ingen ekspression i normalt humant væv; imidlertid er mekanismen af ​​denne differentielle ekspression ikke godt forstået [1]. Epigenetiske ændringer, herunder ændringer i promotor methylering er blevet associeret med cancer-specifikke udtryk forskelle i humane maligniteter, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Promotor hypermethylering har primært været betragtet som en mekanisme af tumorsuppressorgen inaktivering; dog er den globale genomisk hypometylering blevet rapporteret i næsten alle tumorer [2], [4], [8], [9]. Det er også kendt, at CTA’er, især dem der kodes af X-kromosomet (CT-X antigener), udtrykkes sammen med promotor demethylering eller hele genomisk hypometylering [10], [11], [12].

lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med over 213.000 nye tilfælde og 160.000 dødsfald rapporteret i 2007; NSCLC udgør ca. 75% af disse tilfælde [13]. Den høje dødelighed i NSCLC skyldes diagnosen på et fremskredent stadium, en høj sats for fornyet trods endelige locoregional ledelse, og at der ikke behandlinger for tilbagevendende lungekræft har været forbundet med forbedret overlevelse på lang sigt [6].

en måde at forbedre NSCLC dødelighed har været udviklingen af ​​cancervacciner som sigter mod at inducere et immunrespons hos værten mod tumorceller. CTA’er er attraktive mål for tumorimmunterapi grund af deres begrænsede ekspressionsmønstre i normalt humant væv. For eksempel er NY-ESO-1 og MAGEA3 øjeblikket undergår kliniske forsøg i forskellige humane maligniteter, herunder NSCLC. Forskere har foreslået, at kombineret anvendelse af koordineret udtrykte CTA’er og andre associerede antigener kan støtte i udformningen af ​​mere effektive, polyvalente immunoterapeutiske protokoller i NSCLC og andre typer tumorer; men der er i øjeblikket meget lidt kendt om coekspression mønstre af disse gener [14], [15], [16].

Til dato, en omfattende, genom-dækkende tilgang til at identificere koordineret udtrykte CTA’er og andre differentielt udtrykte gener aktiveres af promotor demethylering i NSCLC er ikke blevet udført. I denne undersøgelse anvendte vi en hidtil ukendt, integrativ epigenetisk screening tilgang, der kombinerer 5-aza-deoxycytidin og Trichostatin A (5-aza /TSA) behandling af normale lungeceller og mRNA microarray ekspression analyse af primært væv for at identificere gener, som begge aktiveres af DNA hypometylering og forskelligt opreguleret i en koordineret måde i NSCLC. Vi var i stand til at definere et sæt koordineret udtrykte CTA’er og roman, vækstfremmende gener, der aktiveres i forbindelse med en koordineret promotor demethylering. Disse data har betydning for mekanismen for aktivering af CTA’er, design af immunterapeutiske strategier, samt identifikation af potentielle protoonkogener og nye biologiske mål for gen rettet behandlinger for NSCLC.

Materialer og metoder

histopatologi

Alle prøver blev analyseret af patologi afdeling på Johns Hopkins Hospital. Væv blev opnået via Johns Hopkins Institutional Review Board godkendte protokol NA_00001911. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra før anvende deres væv til videnskabelig forskning hvert individ. Tumor og normal lungevæv fra kirurgiske prøver blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk resektion og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Normale prøver blev mikrodissekeres og DNA fremstillet fra normal lungeparenkym. Tumorprøver blev bekræftet at være NSCLC og efterfølgende mikrodissekeres hvilket gav mindst 80% tumorceller. Tissue DNA og RNA blev ekstraheret som beskrevet nedenfor.

5Aza-dC og TSA behandling af celler

Vi behandlede normale humane lunge-cellelinier (NHBE og SAEC, Lonza, Walkersville, MD) i tre eksemplarer med 5-aza-deoxycytidin (a cytosin analog, som ikke kan være methyleret) og trichostatin a (a histondeacetylaseinhibitor) som beskrevet tidligere [17]. Kort fortalt blev cellerne delt til lav densitet (2,5 x 10

5 celler og 6 x 10

5/100 mm skål for SAEC og NHBE henholdsvis) 24 timer før behandlingen. Stamopløsninger af 5Aza-dC (Sigma, St. Louis, MO) og TSA (Sigma) blev opløst i 50% eddikesyre og 100% ethanol, hhv. Cellerne blev behandlet med 5 uM 5Aza-deoxycytidin i 72 timer og 300 nmol /l TSA for de sidste 24 timer. Baseline ekspression blev etableret af mock-behandlede celler med det samme volumen af ​​eddikesyre eller ethanol i tre eksemplarer.

RNA-ekstraktion og Oligonukleotid microarray analyse

Totalt cellulært RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) og af RNeasy kittet (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Vi udførte oligonukleotid microarray analyse under anvendelse af GeneChip U133 Plus 2.0 Affymetrix ekspression microarray (Affymetrix, Santa Clara, CA). Prøverne blev konverteret til mærket, fragmenteret, cRNA pr Affymetrix protokol til brug på udtrykket microarray. Signal intensitet og statistisk signifikans blev fastsat for hver udskrift hjælp dChip udgave 2005 i første omgang at analysere og normalisere array data og derefter Betydning Analyse af microarrays (SAM) [18]. SAM udgang er beregnet til en d-værdi på 1,126, hvilket giver en falsk opdagelse sats og d-score cutoff på 5,065% og 1,885. Dette identificerede i alt 12,132 opregulerede kandidatgener efter 5Aza-dC /TSA behandling. Alle microarray data MIAME kompatibel, og de rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database, GEO, som beskrevet af MGED Society.

Offentlige Datasæt

De offentlige databaser, der anvendes i denne undersøgelse var University of California Santa Cruz (UCSC) human Genome henvisning sekvens og databasen annotation fra og med marts 2006 fryse (hg18) den. Vi opnåede 40 normal lunge og 111 NSCLC udtryk microarrays fra Expo datasæt (alle udføres på Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform) tilgængelige online som en del af Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Tiltrædelsespartnerskaber numre for disse arrays er GSE1643 og GSE3141 hhv. De microarrays fra normalt væv og tumor var først normaliseret for COPA analyse ved hjælp dChip udgave 2005.

Kræft Outlier Profil Analyse (COPA)

Vi anvendte COPA til vores kohorte af 151 væv (111 tumorer, 40 raske), med hver genekspression datasæt indeholdende 54,613 probe sæt fra Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform. Kort fortalt blev genekspression værdier median centreret, indstilling hvert gen midterplan udtryk værdi til nul. Den mediane absolutte afvigelse (MAD) blev beregnet og skaleres til 1 ved at dividere hver genekspression værdi ved sin MAD. Notatet blev median og MAD anvendt til transformation i modsætning til gennemsnit og standardafvigelse, således at outlier udtryk værdier ikke har urimelig indflydelse skøn distributionsomkostninger, og derfor bevaret efter normalisering. Endelig er den 75., 90., og 95 percentiler af de transformerede udtryk værdier beregnes for hvert gen og derefter gener blev rangordnet efter deres percentil scorer, hvilket giver en prioriteret liste over outlier profiler. Med henblik på vores rang-liste, blev den 90. percentil for tumorer valgt ud fra stikprøve-størrelse analyse (111 tumorer, 40 normals). Normal væv, der havde en 95-percentil 2 blev slået ud vores rang liste. I alt 35,764 udskrifter mødte ovenstående kriterier og blev rangeret. For nærmere oplysninger om metoden henvises til Tomlins et. al [19].

Integrativ Epigenetik

Vi rangeret målgener fra Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform ved COPA opregulering ved 90

percentil (fra 111 tumorer og 40 normal væv). The U133 Plus 2.0-mRNA-ekspression platform (Affymetrix, Santa Clara Californien) har cirka 55.000 probesæt. En anden rang liste blev produceret ved rangordning gener i faldende rækkefølge efter d-score som beregnet af SAM følgende 5-aza /TSA behandling af normale lunge cellelinier (NHBE og SAEC). En tredje rang liste blev beregnet ved hjælp af 111 NSCLC og en ekstra expo datasæt med 79 ekstra NSCLC primære tumorvæv også køre på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform. I disse 190 primære NSCLC prøver, vi korreleret BORIS ekspressionsmønstre inden for hver tumor med udtryk for alle udskrifter er inkorporeret i U133 Plus 2,0 array ved at beregne en korrelationskoefficient hjælp af Excel. Alle gener blev derefter rangeret baseret på styrken af ​​sammenhængen mellem deres udtryk og af BORIS udtryk på tværs af alle 190 prøver. Disse tre informationskilder (gen sæt viser opregulering med 5-aza, COPA score, og BORIS korrelation) blev kombineret ved hjælp af en rang produkt (x * y * z). Disse tre placeringer blev kombineret for at rangere alle mål og permutation af dataene blev anvendt til at etablere betydning med en tærskel på α = 0,005, hvilket gav 290 betydelige gener. Genomiske sekvenser blev opnået for 122 af disse gener ved anvendelse UCSC genom browser, og tilstedeværelsen af ​​CpG-øer i de promotorer eller første intron af disse gener blev bestemt ved MethPrimer som bygger på GC indhold 50%, 100 bp, 0,6 observeret til forventet CG s [20]

DNA Extraction

Prøverne blev centrifugeret og fordøjet i en opløsning af rengøringsmiddel (natriumdodecylsulfat) og proteinase K, til fjernelse af proteiner bundet til. DNA. DNA blev oprenset ved phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. DNA’et blev efterfølgende resuspenderet i 500 pi Lote (EDTA 2,5 mmol /L og Tris-HCI 10 mmol /l) og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

bisulfitbehandling og sekventering

2 ug DNA fra 28 NSCLCs og 11 normale lungevæv blev underkastet behandling med bisulfit hjælp af EpiTect® bisulfit Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Dette bisulfit-modificerede DNA blev derefter opbevaret ved -80 ° C. Efterfølgende blev behandlet med bisulfit DNA amplificeret under anvendelse af primere designet af MethPrimer at spænde områder af CpG-øer i promotoren eller første intron [20]. Primersekvenser blev udformet til ikke indeholde CG dinukleotider. Primersekvenser er tilgængelige i tabel S1. Touch down PCR blev udført og produkterne blev geloprenset under anvendelse af QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Hver forstærket DNA-prøve blev anvendt med indlejrede primere til Applied Biosystems 3700 DNA analysator bruger BD terminator farvestof (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Kvantitativ RT-PCR

Total RNA udvindes som beskrevet ovenfor, og koncentrationen for hver prøve blev målt. 1 ug RNA blev derefter anvendt til cDNA-syntese udført under anvendelse af oligo-dt med SuperScript First-Strand Synthesis kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). De endelige cDNA produkter blev anvendt som skabeloner til efterfølgende RT-PCR med primere designet specielt til hver kandidat gen. 18s rRNA blev undersøgt for at sikre nøjagtig relativ kvantificering i kvantitativ RT-PCR. Hvert forsøg blev udført tredobbelt under anvendelse af Taqman 7900 (ABI) real-time PCR-maskine og QuantiFast SYBR Green PCR-kittet (Qiagen, Valencia, CA) ifølge producentens instruktioner. Primer sekvenser findes i tabel S1.

Kvantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP)

For selektivt forstærke demethylerede promotorområder i gener af interesse, blev primere designet ved hjælp af data fra bisulfit sekventering af primære tumorer som er gratis kun bisulfit-konverterede sekvenser vides at være demethyleres i tumorer. Primer kombinationer valideret ved anvendelse

in vitro

methylerede og demethylerede kontroller. Disse forsøg blev udført tredobbelt under anvendelse af Taqman 7900 (ABI) real-time PCR-maskine med standard kurver og normalisering til Beta-actin-primere, som ikke indeholder CpG-s i sekvensen til kvantificering. Primer sekvenser findes i tabel S1.

Transfektion for Human Expression Vektorer og AD Vækst Assay

En fuld-længde ORF cDNA fra SBSN og NY-ESO-1 blev opnået for forbigående transfektioner fra Origene i en pCMV6-post vektor (Rockville, Maryland). Cellelinier blev udpladet med 5 x 10

5 celler /brønd ved anvendelse af 6-brønds plader og transficeret med enten tom vektor eller vektor indeholdende genet af interesse ved anvendelse af FuGene 6 transfektionsreagens (Roche, Basel, Schweiz) i overensstemmelse med producentens protokol. Celletælling Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Rockville, Maryland) absorbansen blev målt ved Spectramax M2e 96-brønds fluorescenspladelæser Molecular Devices (Sunnyvale, California). Alle AD vækst blev udført tre gange for alle cellelinjer og vektorer.

Anchorage-Independent Growth Assay

blød agar analyser blev udført efter transfektion af celler med pattedyr pCMV6-Adgangskrav ekspressionsvektorer indeholder en G418-resistens-kassette (Origene). Celler blev talt og ca. 5000 blev tilsat til hver brønd plade 6. Bundlaget bestod af 0,5% agar, RPMI + 10% FBS, mens cellerne blev suspenderet i en øverste lag af 0,35% agar, RPMI + 10% FBS og G418 (300 ug /ml). Blød agar assays blev inkuberet ved 37 grader i 12 dage. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt for alle cellelinjer og vektorer.

Statistical Analysis

Vi søgte ligheder i de mønstre for methylering mellem gener ved at udføre en analyse af sammenhænge mellem QUMSP aflæsningen på de gener tværs alle prøver. Spearmans korrelation permutation test blev brugt med 1000 permutationer af prøverne for at etablere betydning, med α = 0,05. Til ekspression data, vi log-transformerede de normaliserede data og udførte korrelationsanalyse tværs af alle prøver mellem hver af generne i undersøgelsen. Signifikans blev bestemt ved at antage en normalfordeling i log-transformerede ekspressionsniveauerne og anvende t-fordeling med en alpha på 0,05. Alle analyser blev udført ved hjælp af Matlab.

Resultater

A Novel Integrative Epigenetisk Approach til at screene for CTA’er og relaterede epigenetisk regulerede gener

Vi har udviklet en integrativ, high-throughput tilgang til skærm til CTA’er og andre koordineret udtrykte gener ud fra tre tidligere publicerede faktorer: (1) CTA’er udtrykkes i germlinie celler og mange tumorer, men ikke i normale somatiske væv [1], [21], (2) CTA’er har promoter CpG øer, der er methylerede og stumme i normal somatisk væv, men eksperimentelt, kan udtrykkes ved promotor demethylering [1], [10], [11], [12] og (3) transkriptionsfaktoren BORIS er blevet vist at inducere de -repression af flere CTA’er i NSCLC og andre tumor /vævstyper (figur 1A) [22], [23], [24], [25].

(A) Skematisk oversigt over den integrerende epigenetisk screening strategi brugt i dette studie, som kombinerede den farmakologiske demethylering af normale cellelinjer, sammenlignende COPA anaylsis i primært væv og korrelation af genekspression med den epigenetiske regulator BORIS i primært væv. (B) Repræsentant COPA graf over

MAGEA12

demonstrere den statistiske metode bruges til at finde kandidat overudtrykt CTA’er og relaterede gener. Forskel i tumor versus normal ekspression var signifikant, p-værdi 0,00001 målt ved Mann-Whitney U test. (C) Upfold regulering af mRNA-ekspression i behandlede normale lunge cellelinier, NHBE og SAEC, målt ved Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0-mRNA-ekspression platform.

Den første arm af vores screening fremgangsmåde involverede farmakologisk demethylering af 2 normale lunge cellelinjer, normalt humant bronchieepithelceller (NHBE) og human Lille luftvejsepitelceller (SAEC) celler (Lonza, Walkersville, MD) under anvendelse af en 5-aza /TSA behandlingsprotokol som tidligere har været en succes med at definere kandidat tumorsuppressorgener efter demethyleringsmiddel tumorcellelinjer. Med den forståelse, at CTA’er bringes til tavshed ved methylering i normalt væv, vi anvendte normale cellelinier til at identificere gener, der typisk undertrykt i normalt væv, men kan genbruges udtrykkes af farmakologisk manipulation. To normale lunge cellelinjer, NHBE og SAEC, blev behandlet med 5 pM 5-aza deoxycytidin i 72 timer og Trichostatin A i 24 timer før høst total RNA til ekspression array analyse under anvendelse af Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 ekspression platform. Disse resultater blev derefter analyseret ved anvendelse dChip og betydning Analyse af microarrays (SAM) [17], [18]. Gener blev rangeret baseret på deres SAM score (d). SAM også rapporteret fold ændring i den gennemsnitlige ekspression af målgener i 5-aza /TSA behandlingsgruppen versus kontrolgruppen (figur 1B).

Vi analyserede samtidigt data fra 40 normale lunge og 111 NSCLC ekspression microarrays fra expo datasæt (alle køre på Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform) offentligt tilgængelige online som en del af Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Til vores analyse af disse 151 primært væv ekspressionsopstilling datasæt, brugte vi en teknik kendt som Cancer Outlier Profil Analyse (COPA). COPA er en metode til at søge efter markant overekspression af bestemte gener, der opstår kun i en delmængde af sager, mens de traditionelle analysemetoder baseret på standard statistiske foranstaltninger undlader at finde gener med denne type udtryk profil [19]. COPA var en særlig nyttig metode for os at søge efter CTA’er og gener med lignende udtryk profiler baseret på tidligere undersøgelser, der viser, at CTA’er heterogent udtrykkes både på tværs af en bred patientpopulation og inden for de enkelte tumor prøver [26], [27], [28] . Gener med et normalt væv COPA udtryk skaleret score 2 ved den 95. percentil blev slået ud rang listen. Alle resterende gener blev derefter rangeret baseret på deres COPA score på 90

percentil; statistisk signifikans af udtrykket forskelle i COPA diagrammer blev målt ved Wilcoxon Rank Sum (figur 1C).

I den endelige arm af vores screening tilgang anvendte vi de tidligere datasæt med 111 NSCLC og en yderligere expo datasæt med 79 ekstra NSCLC primære tumorvæv også køre på Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform. I disse 190 primære NSCLC prøver, vi korreleret BORIS ekspressionsmønstre inden for hver tumor med udtryk for alle udskrifter er inkorporeret i U133 Plus 2,0 array ved at beregne en korrelationskoefficient hjælp af Excel. Alle gener blev derefter rangeret baseret på styrken af ​​sammenhængen mellem deres udtryk og af BORIS udtryk på tværs af alle 190 prøver.

Tre rang lister blev produceret ved rangordning gener ved SAM score (d) efter 5-aza /TSA behandling i normale lunge-cellelinjer, COPA score i den primære væv, og BORIS korrelation i den primære væv. Disse 3 rang lister kombineredes ved anvendelse af en rang produkt (x * y * z). Ved hjælp af en signifikans tærskel (α = 0,005) og efterfølgende tilfældige permutationer af vores rang-lister, vi identificeret 290 gener, der blev væsentligt forskelligt opreguleres baseret på epigenetisk screening og væv microarray ekspressionsmønstre (Tabel S2) [29].

i første omgang en

i silico

tilgang udnytter MethPrimer blev brugt til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​CpG øer i promotorområder vore topkandidater [20]. Toppen 100 af de 290 betydelige gener samt 22 gener valgt på grundlag af biologisk relevans i kræftrelaterede veje blev udvalgt til at blive screenet via denne tilgang, og 101 blev fundet at indeholde 1 eller flere promoter CpG øer.

Vi brugte derefter et separat kohorte af 11 normale lungevæv fra patienter uden en kræftdiagnose at bekræfte epigenetisk inaktivering via promotor methylering i normal lunge slimhinde fra patienter uden en lunge neoplasme. Bisulfit sekventering af CpG-øer i promotorregionerne af 55 udvalgte genmål med CpG-øer blev anvendt til at bestemme status for methylering. Kun 17/55 promotorregioner demonstrerede fuldstændig methylering på alle sekventerede bindingssteder for CpG i alle eller næsten alle de normale væv (Tabel S2). Disse mål blev efterfølgende bisulfit sekventeret i en separat gruppe af 28 primære NSCLC at søge efter tilstedeværelsen af ​​promotor hypometylering. Af disse resterende mål, 10/17 viste promotor demethylering i nogle brøkdel af tumorer, herunder:

MAGEA3

(13/28, s = 0,0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001 ),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, s = 0,0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23, p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, s = 0,0001),

NY-ESO-1 Hotel (14/20, s = 0,0002),

G6PD

(17/18, s = 0,0014), (Fishers eksakte test, to-sidet ) (tabel 1 og figur 2)

Vist er de bisulfit sekventering resultater med tilhørende p-værdier i 28 NSCLC tumorprøver og 11 normale lungevæv til:.

MAGEA3

(13/28, s = 0,0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, s = 0,0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23 , p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, p = 0,0001),

NY-ESO-1 Hotel (14/20, s = 0,0002),

G6PD

(17/18, s = 0,0014). I parentes er forholdet mellem demethylerede promotorer i tumorer og p-værdierne, som beregnet af Fishers eksakte test, som sammenligner demethylering i tumorer vs. normaler. Shaded kasser repræsenterer methylerede initiativtagere, ND = metyleringsstatus ikke bestemt af bisulfit sekventering.

Transkriptionel opregulering af målgener efter 5-aza /TSA behandling i vores cellelinje system blev bekræftet ved hjælp af kvantitativ RT -PCR på 5-aza /TSA-behandlede normale celler sammenlignet med mock-behandlede celler for disse 10 gener (Figur S1). Hvert gen med undtagelse

MAGEA12

viste signifikant opregulering af 5-aza /TSA behandling i mindst én cellelinje understøtter funktionel genregulering af promotor hypometylering.

CTA’er og associerede Gener er sideordnet demethyleret og Expression er korreleret med promoter demethylering

for at bekræfte bisulfit sekventeringsresultaterne i vores målgener og tilvejebringe et datasæt af kontinuerlige variabler at udtrykke status af promotoren demethylering, vi udtænkt en hurtig, kvantitativ analyse for specifikt at måle ikke-methylerede promotorer, som vi betegnet Kvantitativ Unmethylation-specifik PCR (QUMSP). Vi analyseret DNA ekstraheret fra vores kohorte af 28 primære NSCLC tumorprøver og 11 normale lunge prøver fra patienter ikke-cancerpatienter (figur 3A). Betydelig tumor-specifikke demethylering blev fundet i

MAGEA3

(p 0,005),

MAGEA12

(p 0,025),

MAGEA4

(p 0,018),

MAGEA1

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,025) og

MAGEA5

(p 0,007). To yderligere mål lidt ubesvarede signifikans ved α 0,05,

SBSN

(p 0,07) og

NY-ESO-1 Hotel (p 0,09) (2 tailed t-test under forudsætning ulige varians ).

(A) QUMSP blev gennemført i vores kohorte af 28 NSCLC og 11 normale lungevæv. Eksperimenter blev udført tre gange, er middelværdier vist repræsenterer den procentdel af methylerede promotorer på en logaritmisk skala. Statistisk signifikant tumor-specifikke demethylering blev fundet i

MAGEA3

,

MAGEA12

(p 0,025),

MAGEA4

(p 0,018),

MAGEA1

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,025) og

MAGEA5

(p 0,007). To yderligere mål lidt ubesvarede signifikans ved α 0,05,

SBSN

(p 0,07) og

NY-ESO-1 Hotel (p 0,09) (2 tailed t-test under forudsætning ulige varianser ). (B) Promotor hypometylering (QUMSP) korrelation p-værdi matrix for NSCLC (n = 28; Spearmans korrelation permutation test). Skraverede celler repræsenterer signifikante p-værdier.

I betragtning af den tumor-specifikke demethylering mønster ses for vores målgener, vi næste ønskede at afgøre, om demethylering af promotorområder af disse gener opstod på en koordineret måde inden tumorprøver. Vi udnyttet den Spearmans korrelation permutation test for at bestemme signifikant koordineret demethylering under anvendelse af de QUMSP resultaterne fra vores kohorte af 28 NSCLC (figur 3B). Den p-værdi matrix af Spearman korrelationskoefficient viser, at for nogen af ​​de målgener, demethylering tendens til koordineret forekomme med mindst 6 af de andre gener. Skraverede celler repræsenterer signifikante p-værdier. Dette giver bevis for, at demethylering er stærkt forbundet med en koordineret regulering af disse CTA’er og relaterede målgener i NSCLC, og antyder stærkt en epigenetisk mekanisme for aktivering.

For at bekræfte tumor specifikke udtryk for vores målgener, brugte vi kvantitativ RT-PCR til at bestemme mRNA-ekspression i vores kohorte af NSCLC og normal lungevæv (Figur S2A-J). Seks gener havde signifikant øget udtryk i tumorer

MAGEA12

(p 0,02),

SBSN

(p 0,002),

TKTL1

(p 0,02),

ZNF711

(p 0,008),

NY-ESO-1 Hotel (p 0,001),

G6PD

(p 0,006). Tre gener lidt savnede betydning på α 0,05 niveau:

MAGEA3

(p 0,09),

MAGEA4

(p 0,06) og

MAGEA1

(p 0,08) (2 halet t-test under forudsætning ulige varians).

Vi ønskede næste at afgøre, om demethylering var ansvarlig for derepression af CTA’er og relaterede gener i NSCLC. Fire målgener viste en signifikant positiv sammenhæng mellem mRNA-ekspression (kvantitativ RT-PCR) og promotor hypometylering (QUMSP):

MAGEA12

(p = 0,024),

MAGEA4

(p 0,004),

SBSN

(p = 0,004) og

NY-ESO-1 Hotel (p 0,004) (Figur S3A-D) (Spearman korrelation permutation test).

TKTL1

(p = 0,1),

MAGEA5

(p = 0,104) og

MAGEA3

(p = 0,2) viste også en positiv sammenhæng mellem demethylering og udtryk, men det gik signifikans (tabel S3). Disse data tyder demethylering af promotorområder er delvist ansvarlig for regulering af de fleste af vores målgener.

CTA’er og associerede Target Gener er sideordnet Udtrykt

I betragtning af resultaterne i de tidligere analyser af vores kohorte af primært væv viser, at disse målgener differentielt udtrykkes i tumorer, er deres promotorområder koordineret demethyleres inden tumorer og udtryk er korreleret med demethylering undersøgte vi vores indledende kohorte af 111 tumorer analyseret ved hjælp af Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform at afgøre, om vores målgener koordineret blev udtrykt i tumorprøver i dette store prøvesæt. Figur 4A viser en varme kort over udskrift udtryk som målt ved U133 Plus 2,0 array til 40 normale lunge prøver fra patienter uden kræft og 111 NSCLC primære vævsprøver. Dette tal visualiserer forholdet af ekspression mellem de 10 målgener i normale og tumorprøver. Dataene blev først normaliseret ved at sætte middelværdien og standardafvigelsen for hvert gen til 0 og 1 henholdsvis på tværs af alle 151 prøver. Dataene blev derefter samlet i prøven domæne ved hjælp hierarkisk clustering med gennemsnitlig kobling og en Euklidisk afstand metrisk. Dette gav tre klynger: 1) alle 40 normale prøver, 2) 43 af de 111 tumorprøver viser høj ekspression i de fleste af de gener og stærke korrelationer mellem dem (Tumor 1), og 3) 52 af 111 tumorprøver viser lavere udtryk, men med udtryk stadig over raske (Tumor 2). De resterende 16 af 111 tumorprøver ikke klynge sammen eller i disse grupper. Denne analyse ikke kun forudsat bekræftelse på, at ekspression af vores målgener er begrænset til en delmængde af tumorer med ringe eller ingen ekspression i normale væv, men også, at disse mål synes at være koordineret udtrykkes i et stort delmængde, 38,7%, af disse tumorer.

(A) Heat kort over udskrift udtryk som målt ved Affymetrix human Genome U133 Plus 2.0 mRNA udtryk platform.