PLoS ONE: LZ-207, en nysyntetiserede Flavonoid, inducerer apoptose og undertrykker inflammationsrelaterede Colon Cancer Ved at hæmme NF-KB-signalvejen

Abstrakt

Flavonoider og flavonoid derivater, der har væsentlige biologiske og farmakologiske aktiviteter, herunder antitumor og antiinflammatoriske aktiviteter, er ofte blevet brugt i human sundhedspleje. At designe en mere effektiv flavonoid antitumormiddel, vi ændrede flavonoid backbone med udskiftninger af piperazin og methoxygrupper til at syntetisere en roman flavonoid derivat, LZ-207. Anticancer effekt af LZ-207 mod HCT116 colon cancerceller og den underliggende mekanisme for denne virkning blev undersøgt i denne undersøgelse. Konkret LZ-207 udstillede hæmmende effekt på vækst og levedygtighed i flere humane coloncancer-cellelinjer og induceret apoptose i HCT116 celler både in vitro og in vivo. LZ-207 behandling undertrykte også den nukleare translokation af NF-KB og phosphorylering af IKB og IKKα /β på en dosis-afhængig måde i både HCT116-celler og humane akutte monocytiske leukæmi THP-1-celler. Desuden LZ-207 reducerede også sekretionen af ​​pro-inflammatoriske cytokin interleukin-6 (IL-6) i LPS-inducerede THP-1-celler, og denne virkning blev bekræftet på det transskriptionelle niveau. Endvidere LZ-207 inhiberede signifikant HCT116 celleproliferation, der blev fremkaldt af LPS-induceret THP-1-celler i et co-kultursystem. Disse resultater belyst nogle potentielle molekylære mekanismer til forebyggelse af inflammation-drevet tyktarmskræft ved hjælp af den nyligt syntetiserede flavonoid LZ-207 og foreslog muligheden for yderligere at udvikle nye terapeutiske midler afledt af flavonoider

Henvisning:. Sun J, Li F, Zhao Y Zhao L, Qiao C, Li Z, et al. (2015) LZ-207, en nysyntetiserede Flavonoid, inducerer apoptose og undertrykker inflammationsrelaterede Colon Cancer Ved at hæmme NF-KB-signalvejen. PLoS ONE 10 (5): e0127282. doi: 10,1371 /journal.pone.0127282

Academic Redaktør: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, FRANCE

Modtaget: December 10, 2014 Accepteret: 13. april, 2015; Udgivet: May 29, 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Teknologi Major Project (No.2012ZX09304-001), Project Program of State Key Laboratory of Natural Medicines, Kina Farmaceutiske Universitet (nr JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303 og SKLNMZZJQ201302, G140042), Program for Changjiang Scholars og Innovative Research Team i University (IRT1193), National Natural Science Foundation of China (nr 91.029.744)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hver år, mere end 600.000 mennesker dør af kolorektal cancer (CRC) og 1,25 millioner mennesker er diagnosticeret med denne sygdom. Den kirurgisk fjernelse af kræft ved operation er den traditionelle behandling for alle faser af CRC; Men mange patienter har inoperable tumorer og gå på at udvikle metastaser [1]. Derfor er hidtil ukendte terapeutiske midler til behandling af CRC presserende behov

akkumulerende beviser har vist, at inflammation er en kritisk komponent for tumorprogression [2].; steder med infektion, kronisk irritation og inflammation kan være højrisikoområder at udvikle sig til kræft. Den tætte forbindelse mellem inflammatoriske tarmsygdomme (IBDS) og tyktarmskræft er blevet foreslået siden 1925 og er stadig en kraftfuld sag at bevise sammenhængen mellem betændelse og kræft [3, 4]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at pro-inflammatoriske faktorer af medfødte og adaptive immunforsvar, herunder IL-6 [5] og TNF-α [6], kunne bidrage til udvikling og vækst af kolon neoplasi. NF-KB, som er en af ​​mange nedstrøms mål af TNF-receptor 1-aktivering, er sandsynligvis til at spille en fremtrædende rolle i colitis-associerede tumorigenese fordi afvigende NF-KB-aktivering blev påvist i 50% af colorectal og colitis-associerede tumorer og mus undersøgelser [7]. Tilsammen tyder disse resultater på en overbevisende rolle for betændelse i tyktarmen carcinogenese.

Naturlige flavonoider er udbredt i den menneskelige kost og planter, omfatte alle citrusfrugter, blåbær, persille, løg, sort te, grøn te, rød vin og bananer [8]. Disse forbindelser er stoffer med lav molekylvægt, der er baseret på en fælles tre-ringstruktur med forskellige substitutioner [9]. Da den franske paradoks forlod det indtryk, at en stor del af Frankrigs lavere forekomst af hjertesygdom er forbundet med landets høje rødvin forbrug, har flavonoider fra rødvin blevet et fokus for kræftforskning undersøgelser [10]. De potentielle gavnlige egenskaber af flavonoider omfatter antioxidant, antiatherosclerotisk, anti-inflammatorisk, antitrombogen, antiosteoporotic, og antivirale virkninger [10]. For nylig har de antitumor virkninger af flavonoider også blevet anerkendt [11]. Mange flavonoider, såsom quercetin [12], silymarin [13] og luteolin [14], udøver antitumoraktivitet mod forskellige cancer cellelinjer, hvilket tyder på, at disse flavonoider er lovende midler til forebyggelse af kræft og garanterer yderligere undersøgelse. Flavonoider er phenylsubstituerede chromoner (benzopyranderivater), der består af en 15-carbon grundskelet (C6-C3-C6) (Fig 1A) med en chroman (C6-C3) kerne (benzoringen A og den heterocykliske ring C) og med en phenylgruppe (den aromatiske ring B), der normalt er substitueret i 2-stillingen [15]. I de senere år wogonin, som er et flavonoid, har fået stigende opmærksomhed for sine antitumoraktiviteter i hepatoma [16], brystcarcinom [17], gastrisk cancer [18], cervical carcinoma [19], og leukæmi [20, 21] . Mange wogonin derivater er blevet syntetiseret til at have bedre vandopløselighed og druggability, og nogle af disse syntetiserede derivater har vist potentielle antitumorvirkninger. For eksempel LYG-202, som er en wogonin derivat, inducerer apoptose i human hepatocellulært carcinom HepG2 celler via inducere ROS-mitokondrier pathway [22]. LYG-202 inducerer også cellecyklusstop og apoptose i human kolorektal carcinom HCT116 celler via sin regulering af p53 og p21WAF1 /Cip1 [23]. En anden wogonin derivat, LW-214, har potent antitumoraktivitet i human brystcancer MCF-7 celler ved nedregulering TrX-1 og ved at aktivere JNK, i sidste ende at inducere mitokondrier-medieret apoptose [24]. I dette arbejde har vi fokuseret på LZ-207, som er en nyligt syntetiseret flavonoid med en struktur svarende til den i wogonin. En methoxygruppe i LZ-207 er substitueret i 6′-stillingen, og en piperazin substitution forekommer ved 7′-stillingen (se fig 1B). Disse substitutioner forbedrer vandopløseligheden (tabel 1) og druggability af LZ-207 sammenlignet med andre flavonoid familiemedlemmer. Derfor var vi interesserede i at undersøge antitumor virkninger af LZ-207 på colitis-associerede kræftformer og afsløre samspillet mellem inflammatoriske celler og tumorceller. I dette papir, studerede vi vækstinhiberende virkninger af LZ-207 i HCT116 celler og inhibitoriske virkninger af LZ-207 på inflammatoriske processer i THP-1-monocytter. Vi undersøgte også de inhiberende virkninger af LZ-207 på den inflammatoriske respons fremkaldt ved dyrkning HCT116 celler med LPS-induceret human monocyt THP-1-celler.

(A) Kemisk struktur af 15-carbon flavon rygrad. (B) Kemisk struktur af LZ-207 (C

26H

32N

2O

6, MV = 468,5421).

Materialer og metoder

Reagenser

LZ-207 (renhed 99%), som blev opnået fra Dr. Zhiyu Li (China Pharmaceutical University, Kina), blev opløst i DMSO til 0,1 M som en stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C. LZ-207 var frisk fortyndet med cellekulturmedium til forskellige slutkoncentrationer før hvert forsøg. Den endelige DMSO-koncentration ikke overstige 0,1%, og havde ingen virkning på cellevækst og differentiering.

Lipopolysaccharider (LPSs), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). En annexin V-FITC apoptosis afsløring kit, et kemiluminescerende eltrafik (EMSA) kit, og human IL-1β og IL-6 enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) kits blev indkøbt fra Bender Medsystems Co, Ltd (Burlingame, CA, USA), Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Kina), og KeyGen Biotech Co, Ltd (Nanjing, Kina), hhv.

Primær β-actin antistof blev opnået fra Boster bioteknologi, Ltd . (Wuhan, Kina) og anvendt i en 1: 20.000 fortynding. Primær Akt, Bax, caspase-3, caspase-8, caspase-9, ERK, kBa, NF-KB, JNK, p38, p-Akt, p-ERK, p-JNK, p-p38-antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og blev alle anvendt ved en 1: 500 fortynding. Primær Bcl-2, IKKα /β, PARP, p-IKKα /β, blev p-kBa antistoffer opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) og blev alle anvendt i en 1: 1.000 fortynding. IRDye 800-konjugerede sekundære antistoffer blev opnået fra Rockland, Inc. (Philadelphia, PA, USA) og anvendt ved en 1:. 15.000 fortynding

Cellekultur

human colon carcinoma HCT116 celler, human kolorektal cancer SW1116 og HT29-celler, humane navlevene endotel HUVEC celler, normale menneskelige lungefibroblaster MRC5 celler og menneskelige akut monocytisk leukæmi THP-1-celler blev opnået fra cellen bank af det kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). HCT116, HT29, SW1116, HUVEC, MRC5 og THP-1-celler blev dyrket i enten McCoys 5A-medium eller DMEM-medium (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, USA). Alle medier blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, USA), 100 U /ml benzylpenicillin og 100 ug /ml streptomycin ved pH 7,4, og celler blev holdt i en CO

2 inkubator (Thermo Forma, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, USA) med en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C [25, 26].

cellelevedygtighed assay

SW1116 celler, HT29-celler, HCT116 celler, HUVEC-celler, MRC5 celler og THP-1-celler blev udpladet i plader med 96 brønde med 100 pi det passende medium ved en optimal tæthed. Cellerne blev behandlet med forskellige koncentrationer af LZ-207 og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 for 24, 48 og 72 timer. Efterfølgende blev 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 i yderligere 4 timer. Derefter blev supernatanterne kasseres, og 100 pi DMSO blev sat til hver brønd. Pladerne blev rystet i 2 min for at sikre total opløselighed af formazankrystaller, og cellelevedygtigheden blev bestemt baseret på den mitokondriske omdannelse af MTT til formazan. Absorbansen (A) blev målt ved 570 nm ved anvendelse af en Universal Microplate Reader (EL800, BioTek Instruments Inc.). Hæmningen ratio (%) og overlevelse (%) blev beregnet ved hjælp af følgende ligninger:

A

Behandlet og A

Kontrol var de gennemsnitlige absorbansværdier af tre parallelle eksperimenter fra behandlede og kontrol grupperne.

IC

50, som er den koncentration, der forårsagede 50% inhibering af cellelevedygtighed, blev beregnet ved anvendelse af logit-metoden [24].

DAPI farvning assay

cellekerner blev visualiseret med DAPI-farvning, der udsender blå fluorescens ved binding til aT områder af DNA, til at afsløre eventuelle morfologiske tegn på apoptose. Efter LZ-207 behandling i 24 timer blev HCT116 celler fikseret med kold 4% paraformaldehyd i 30 minutter, vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) og derefter permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter ved stuetemperatur. Efter at være blevet vasket to gange med PBS blev cellerne inkuberet med DAPI (1 ug /ml) i 10 minutter og derefter observeret ved anvendelse af fluorescensmikroskopi (Olympus, Japan) med en spids excitationsbølgelængde på 340 nm [27].

Annexin V /PI dobbelt farvning-assay

Apoptose-medieret tumorcelledød blev undersøgt under anvendelse af en dobbelt farvning metode med en FITC-mærket Annexin V /PI Apoptose Detection Kit ifølge producentens anvisninger. HCT116 celler i McCoys 5A medium indeholdende 10% FBS blev dyrket i 6-brønds plader ved en komfortabel densitet i 24 timer. Efter LZ-207 (5, 10 eller 20 uM) behandling i yderligere 24 timer blev cellerne høstet, vasket to gange med kold PBS, og derefter resuspenderet i 500 pi bindingsbuffer. Derefter blev 5 pi Annexin V og 5 pi PI successivt tilsat til hvert rør, blandet forsigtigt og holdt på is i 10 minutter i mørke. Dataindsamling og -analyse blev udført under anvendelse af en Becton Dickinson FACS Calibur flowcytometer med FlowJo 7 software med excitation /emission ved 488/530 nm. Den venstre nederste del af fluorocytograms (An-, PI-) repræsenterer normale celler, højre nedre del af fluorocytograms (En +, PI-) repræsenterer tidlige og medio apoptotiske celler, og retten øverste del af de fluorocytograms (An +, PI +) repræsenterer sent apoptotiske celler [28, 29].

mitochondrial transmembranpotentiale (a ^ m) vurdering

mitokondrie transmembranpotentialeændringer (ATm) ændringer kan angives med JC-1, et fluorescerende farvestof fra keygen JC-1 Apoptose Detection Kit (Kina). Efter LZ-207 (5, 10 eller 20 uM) behandling i 24 timer blev HCT116 celler høstet, vasket med PBS, resuspenderet i JC-1 arbejder puffer. Efter inkubering ved 37 ° C med 5% CO

2 i 30 minutter blev cellerne vasket to gange med inkubationspuffer og analyseret ved flowcytometri og software FlowJo 7 med indstillingerne for FL1 (FITC, grønne) og FL2 (PI, rød ) [30].

Udarbejdelse af mitokondrie og cytosolisk fraktioner

mitokondrier og cytosolisk fraktioner fra celler blev fremstillet under anvendelse keygen mitokondrier isolation kit (Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter LZ-207 (5, 10 eller 20 uM) behandling i 24 timer blev HCT116 cellerne høstet, vasket med PBS, resuspenderet i kold lysepuffer og homogeniseret på is vand med en stram støder. Derefter blev cellerne overført til medium puffer og centrifugeres i 10 minutter ved 4 ° C (1200 g). Supernatanten blev opsamlet og centrifugeret igen i 10 minutter ved 4 ° C (7000 g) for at opnå mitokondrier (pellet) og cytosol (supernatant) fraktioner. Mitokondrier og cytosol fraktioner af HCT116-celler blev opbevaret ved -80 ° C [31].

Immunofluorescens

HCT116 celler podedes på dækglas i 6-brønds plader i 24 timer og behandlet med LZ -207 (5, 10 eller 20 uM) med eller uden LPS (10 ug /ml) i yderligere 24 timer. Derefter blev cellerne skyllet tre gange med PBS i 5 minutter hver, fikseret med kold 4% paraformaldehyd i 30 minutter, skyllet tre gange med PBS i 5 minutter hver, permeabiliseret med 0,3% Triton X-100 i 20 minutter, blokeret med 5 % BSA i 60 minutter og inkuberet med primært NF-KB-antistof (fortyndet 1: 200) natten over ved 4 ° C. Efter skylning tre gange med PBS indeholdende 0,01% Tween 80 i 5 minutter hver, blev cellerne farvet med FITC-mærket sekundært gede-anti-muse-IgG-antistof (1: 100) ved 37 ° C i 1 time i mørke. Derefter blev cellerne skyllet tre gange med PBS i 5 minutter hver og farvet med DAPI. Billederne blev taget med et Olympus FV1000 konfokalt mikroskop [32].

Fremstilling af hele cellelysater og cytosol og kerneekstrakter

Kort beskrevet blev cellerne dyrket til ca. 80-90% konfluens og behandlet med LZ-207 i de angivne koncentrationer med eller uden LPS (10 ug /ml) i 24 timer. De hele cellelysater blev fremstillet som tidligere beskrevet [33]. Kerner og cytosol proteinekstrakter blev fremstillet ved anvendelse af en nuklear /Cytosol Fraktionering Kit ifølge den modificerede fabrikantens protokol nedenfor. Efter vask to gange med PBS, blev cellerne opsamlet i rør med PBS ved skrabning med en celleskraber og centrifugeret i 5 min ved 4 ° C (600 g). Derefter fjernede vi supernatanten forsigtigt resuspenderet cellepelleten med cytosolisk ekstraktionsbuffer og inkuberet denne suspension på is i 15 minutter, efterfulgt af en 15 minutters centrifugering ved 4 ° C (14.000 g). Supernatanten (cytoplasmatiske fraktion) blev forsigtigt overført til et rent, præ-kølet rør og opbevaret ved -80 ° C til senere brug. Derefter blev det samme volumen cytosolisk ekstraktionsbuffer tilsat til pelleten igen, og de samme trin blev gentaget som før, bortset supernatanten blev kasseret sidst. Den nukleare pellet blev resuspenderet i nuklear ekstraktionspuffer, holdt på is i 30 minutter, og derefter centrifugeret i 15 minutter ved 4 ° C (12.000 g). Supernatanten (nukleart proteinekstrakt) blev forsigtigt overført til et rent, præ-kølet rør og opbevaret ved -80 ° C [33].

EMSA

HCT116 cellekerner proteiner blev ekstraheret som beskrevet tidligere. EMSA blev udført under anvendelse af et ikke-radioaktivt (biotin-mærket) gelforskydningsassay ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev oligonukleotidprober syntetiseret, annealet og mærkes under anvendelse af et biotin 3′-ende-DNA-mærkning kit (Pierce). Efter fabrikantens protokol, blev fremstillet DNA-proteinkomplekser opløst på en 6% ikke-denaturerende polyacrylamidgel i en 0,5 x Tris-borat-EDTA-buffer ved 380 mA i 1 time og derefter overført til en nylonmembran. Endelig blev gelen forskydning af biotin-mærket DNA visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af en Bio-Rad infrarødt system og et kemiluminescerende EMSA kit [34].

Western blot-analyse

Hele cellelysater og cytosoliske og nukleare ekstrakter fra behandlede celler blev fremstillet som beskrevet ovenfor, og proteinkoncentrationen blev målt ved anvendelse af et BCA-assay med en Varioskan multimode mikroplade-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) ved 562 nm. Lige store mængder protein blev fremstillet, separeret ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulose (NC) membraner. Membranerne blev blokeret med 1% BSA i PBS ved 37 ° C i 1 time og derefter inkuberet med de angivne primære antistoffer natten over ved 4 ° C, efterfulgt af inkubation med IRDye 800-konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved 37 ° C. Påvisning blev udført ved anvendelse af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Alle blots blev strippet og testet igen med polyklonalt anti-β-actin-antistof at fastslå lig belastning af proteiner [35]. Salg

Cytokine kvantificering med ELISA

humant IL-6 og IL-1 ELISA kits blev anvendt i overensstemmelse med producentens instruktioner for at kvantificere ekspressionen af ​​udskilte IL-6 og IL-1 cytokiner i supernatanterne af behandlede THP-1-celler. De THP-1-celler blev behandlet med LZ-207 (5, 10 eller 20 uM) med eller uden LPS (10 ug /ml). Hvert eksperiment blev gentaget tre gange. De cytokinniveauer er udtrykt i pg /ml. Cytokinerne blev ikke påvist i det friske medium anvendes til dyrkning af disse celler [36].

RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time PCR (qPCR) assay

Totalt RNA fra behandlede THP-1-celler blev ekstraheret under anvendelse af en phenol /chloroform-metoden med TRIzol-reagens (Invitrogen). Revers transkription (RT) blev udført under anvendelse af lige mængder af mRNA, og kvantitativ real-time PCR (qPCR) blev udført ved at følge Takara kit protokol (Takara, Takara Bio Inc. Otsu, Shiga, Japan). cDNA blev også indsamlet til real-time kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR), som blev udført under anvendelse af en Chromo4instrument (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA) med SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Den relative mængde af mål-mRNA blev bestemt ved anvendelse af sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode ved at normalisere target mRNA Ct-værdier til disse værdier for β-actin (△ Ct) [37]. Primersekvenserne var som følger:

IL-6-sense: 5′-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3 ‘;

IL-6-antisense: 5′-TACATTTGCCGAAGAGCC-3′;

IL-1β-sense: 5′-AGGCTGCTCTGGGATTC-3 ‘;

IL-1β-antisense: 5′-GCCACAACAACTGACGC-3′;

β-actin-sense: 5′-CTGTCCCTGTATGCCTC T-3 ‘;

β-actin-antisense: 5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′

Co-kultur af HCT116 celler med THP-1-celler

HCT116-celler blev podet i 6-brønds plader ved 4 × 10

4 celler per brønd og fik lov til at vokse til ca. 80% konfluens. THP-1-celler blev opsamlet ved centrifugering (600 g i 10 min, vasket og resuspenderet ved en slutkoncentration på 2 x 10

5 celler /ml) og tilsat til HCT116 celler. Derefter blev co-kultursystem venstre ubehandlet, aktiveret med LPS, eller behandlet med LZ-207 sammen med LPS. Efter 24 timer blev co-kultursystem stoppet, og celledyrkningsmedier blev fjernet. De HCT116 celler blev vasket to gange med kold PBS (pH = 7,4), og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse MTT-assays som beskrevet ovenfor [38, 39].

antitumorvirkninger på HCT116 nøgne mus xenotransplantater

dyret blev udført på grundlag af standard operation procedure oprettet af staten Food and Drug Administration (SFDA) i Kina. Athymiske BALB /c nøgne mus, kvinde, 35-42 dage gamle med vægt mellem 18 og 22 g blev opnået fra Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences. De SPF nøgne mus blevet rejst i et kontrolleret miljø (23 ± 2 ° C, 55 ± 5% fugtighed, 12h lys + 12h mørk /dag) og fodret med standard laboratorium mad og vand. 1 × 10

6 HCT116-celler blev injiceret i den højre armhule af hver nøgne mus at fastslå dyremodel. Efter 12 dage blev mikrometer calipre anvendt til at bestemme tumorstørrelse. Nøgne mus med lignende tumorvolumen blev udvalgt og tilfældigt opdelt i 5 grupper: 0,9% saltvand kontrolgruppe (12 nøgne mus), 5-FU 30 mg /kg positiv gruppe (6 nøgne mus), LZ-207 20 mg /kg-gruppen ( 6 nøgne mus), LZ-207 10 mg /kg-gruppen (6 nøgne mus) og LZ-207 10 mg /kg-gruppen (6 nøgne mus). Den nøgne mus modtog intravenøs injektion hver tredje dag. Tumorvolumen og kropsvægt blev målt også hver tredje dag. Efter 21 dages behandling var alle nøgne mus blev aflivet, blev perifert blod opsamlet; tumorer blev fjernet og vejet; hjerte, lever, milt, lunger og nyrer blev separeret. Tumor volumen (TV) blev beregnet ved hjælp af den følgende ligning: TV (mm

3) = D /2 × d

2, hvor D og d er den længste og den korteste diameter tumor henholdsvis [27].

Statistisk analyse

Alle data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD) fra tredobbelte forsøg udført på en parallel måde, medmindre andet er angivet. Alle data sammenligninger blev foretaget ved hjælp af Students

t

-tests og blev betragtet som statistisk signifikant ved *

P

0,05 og **

P

0.01.

Resultater

LZ-207 hæmmer levedygtighed tumorceller

MTT analyser blev anvendt til at undersøge effekten af ​​forskellige koncentrationer af LZ-207 på celle levedygtighed tumorcellelinier (SW1116, HT29 og HCT116 celler), godartede cellelinier (HUVEC og MRC5 celler) og THP-1-celler. Efter en 48 timer behandling, LZ-207 inhiberede effektivt levedygtighed SW1116, HT29, og HCT116-celler (fig 2A), med IC

50 værdier på 25,1 ± 0,86, 39,5 ± 1,13, og 13,2 ± 1,49 uM ( fig 2B). Som vist i fig 2C, HCT116 celler udviste tids- og dosisafhængig følsomhed over for LZ-207. IC

50 værdier for 24, 48 og 72 h LZ-207 behandlinger i HCT116-celler var 19,81 ± 0,75, 14,58 ± 0,42, og 9,32 ± 0,50 uM (fig 2D). Derfor blev HCT116 cellelinien valgt til alle efterfølgende forsøg under anvendelse af 5, 10 og 20 uM LZ-207 behandlinger i 24 timer. Tre doseringer af LZ-207 viste også nogen indlysende virkning på overlevelsen af ​​godartede celler og THP-1-celler, som vil blive anvendt i co-dyrkningssystemet nedenfor.

(A) Den inhiberende virkning af en 48 h behandling med LZ-207 på SW1116, HT29 og HCT116-celler. (B) IC

50 værdier af en 48 h behandling med LZ-207 i SW1116, HT29 og HCT116-celler. (C) HCT116-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af LZ-207 i 24, 48 og 72 timer. (D) IC

50 værdier på 24, 48 og 72 h LZ-207 behandlinger i HCT116-celler. (E) Overlevelsesraten for en 48 h behandling med LZ-207 på HUVEC og MRC5 celler. (F) Overlevelsesraten for en 48 h behandling med LZ-207 på THP-1-celler. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD (n = 3).

LZ-207 inducerer apoptose i HCT116 celler

morfologi HCT116 celler blev alvorligt ændret efter 24 timer af behandling med LZ-207. For at undersøge om LZ-207 inducerede apoptose i HCT116-celler, blev DAPI-farvning anvendes til at detektere nukleare ændringer. Fluorescensmikroskopi viste, at kontrolceller ensartet farvet med blå fluorescens, hvilket viser den typiske homogen fordeling af kromatin i nucleolus. Derimod HCT116-celler behandlet med LZ-207 udsendes en lysere fluorescens, hvilket indikerer tidlig apoptose grund af chromatinkondensation og kernelegeme pyknosis (Fig 3A).

HCT116-celler blev behandlet med 5, 10 eller 20 uM LZ-207 i 24 timer. blev observeret (A) morfologiske forandringer af nucleolus anvendelse af fluorescens mikroskopi (400 ×). Celler blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​apoptotiske organer og nuklear pyknosis. (B) Annexin V /PI dobbelt farvning-assay af HCT116 celler.

Y

aksen viser PI-mærkede befolkning, og

X

aksen viser FITC-mærket Annexin V-positive celler. (C) De apoptotiske satser for HCT116 celler induceret af LZ-207. (D) Western blotting-analyse af PARP, Bax, Bcl-2, procaspase-3, procaspase-9, og procaspase-8 i HCT116-celler behandlet med LZ-207. (E-G) Densitometrisk analyse repræsenterer den relative fold ændring i proteinekspression. (H-I) Ændringen af ​​A ^ m blev detekteret ved anvendelse af JC-1-farvning og analyseret ved flowcytometri i LZ-207 behandlede HCT116 celler. (J-K) Western blot-analyse af cytochrom C i mitochondrier og cytosol i LZ-207 behandlede HCT116 celler. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01, signifikant forskel sammenlignet med kontrolgruppen.

LZ-207-induceret apoptose i HCT116-celler blev yderligere bekræftet ved anvendelse af Annexin V /PI farvende assays. Efter behandling med 5, 10 eller 20 uM LZ-207 i 24 timer, de tidlige apoptotiske satser i kontrol og behandlede HCT116 celler 4,35, 10,21, 14,76, og 22,14%, henholdsvis, og de sene apoptotiske satser var 3,76, 9,75, 21.78, og 26,79%, henholdsvis (fig 3B og 3C). Disse resultater viste, at LZ-207 behandling fremkalder både tidlige og sene apoptose i en koncentrationsafhængig måde.

Western blots viste, at proteinniveauet af spaltet PARP steg med stigende koncentrationer af LZ-207, hvorimod proteinniveauet af intakt PARP faldt, hvilket bekræfter evnen hos LZ-207 til at inducere apoptose som en del af dets antitumorvirkning på HCT116-celler (fig 3D og 3E). Vi fandt også, at Bcl-2-ekspression faldt efter HCT116 celler blev behandlet med LZ-207 i 24 timer, mens Bax ekspression øges, hvilket fører til en signifikant stigning i Bax /Bcl-2-forhold (figur 3F). Vi yderligere detekteret at procaspase-3 og procaspase-9 ekspression faldt betydeligt efter LZ-207 behandling, hvilket indikerer, at denne mitokondrie pathway kan være involveret i LZ-207-induceret apoptose (fig 3G). Under mitokondrier-medieret apoptose, depolarisering af den mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) ledsaget af frigivelse cytochrom c fra mitokondrie i cytosolen, hvilket udløser en caspase-afhængig apoptose. Der var helt klart forøgelse i grøn fluorescens af JC-1-monomerer i LZ-207 behandlede HCT116 celler, hvilket indikerer depolarisering af den mitokondrielle transmembranpotentiale (A ^ m) (fig 3h til 3i). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​Cyt-c faldt i mitokondrier mens forøget i cytosol i LZ-207 behandlede HCT116-celler (Fig 3J og 3K). I mellemtiden er den lille nedbrydning af procaspase-8 foreslået, at en ydre apoptose pathway også kan korrelere med LZ-207-induceret apoptose (fig 3G).

inhibitoriske virkning af LZ-207 på LPS-induceret NF-KB p65 aktivering i HCT116 celler

NF-KB-familien af ​​transskriptionsfaktorer regulerer ekspressionen af ​​multiple gener, herunder inflammationsassocierede gener. Således dysregulering af NF-KB-signalering er en markør for udvikling af cancer. Brug af immunofluorescens konfokalmikroskopi (Fig 4A), observerede vi, at LZ-207 behandling inhiberede NF-KB p65 nuklear translokation i HCT116-celler. Vi kvantificerede mængden af ​​NF-KB p65 i den nukleare fraktion af LZ-207-behandlede HCT116 celler via Western blot-analyse, ekspressionen af ​​nukleare NF-KB steg med 10 ug /ml LPS behandling i HCT116-celler, som vist i fig 4B og 4C; imidlertid var dette LPS-induceret NF-KB cellekernetranslokering undertrykt af LZ-207 behandling. Brug af EMSA assays, vi også vist, at LZ-207 undertrykte LPS-induceret NF-KB-DNA-bindingsaktivitet på en dosis-afhængig måde i HCT116-celler (Fig 4D).

HCT116-celler blev behandlet med eller uden LZ- 207 i nærvær af LPS i 1 time. Efter isolering af de nukleare og cytoplasmiske ekstrakter, (A) NF-KB p65 niveauer blev bestemt ved immunofluorescens, og (B-C) NF-KB p65 translokation måltes via Western blotting. (D) LZ-207 undertrykte LPS-induceret NF-KB-DNA-bindingsaktivitet i en koncentrationsafhængig måde, som påvist via EMSA-assay. (E-H) Western blotting-analyse af phosphorylering af IKB og IKK i HCT116-celler behandlet med eller uden LZ-207 i nærvær af LPS i 1 time. Dataene er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01, signifikant forskel sammenlignet med kontrolgruppen.

Fordi NF-KB-aktivering resulterer fra den hurtige phosphorylering, ubiquitinering, og i sidste ende proteolytisk nedbrydning af IKB, undersøgte vi virkningen af ​​LZ-207 på ekspressionen af phosphoryleret kBa i LPS-inducerede HCT116 celler via Western blot. LZ-207 inhiberede signifikant kBa phosphorylering sammenlignet med kontrollen, men havde ingen virkning på kBa proteinekspression (fig 4E og 4F). Fordi IKB-nedbrydning afhænger primært IKK-aktivering, næste, undersøgte vi virkningen af ​​LZ-207 på IKK-aktivering og fandt, at LZ-207 undertrykte signifikant LPS-induceret IKKα /β phosphorylering i HCT116-celler (Fig 4g og 4h).

LZ-207 hæmmer signalveje opstrøms af NF-KB i HCT116 celler

celler fornemmer ændringer i deres miljø via aktivering af signaltransduktionsveje, som direkte biokemiske programmer til at mægle spredning og overlevelse. Den mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) -familie og Akt signalveje kan regulere disse grundlæggende cellulære processer gennem induktionen af ​​IKK-afhængig NF-KB-aktivering. Vi undersøgte ekspressionen af ​​faktorer opstrøms af NF-KB-aktivering, herunder p38 MAPK, ERK1 /2, JNK og Akt, efter LZ-207 behandling i LPS-inducerede HCT116 celler. Som vist i fig 5A og 5B, LZ-207 inhiberede LPS-induceret phosphorylering af p38 MAPK, ERK1 /2, JNK og Akt, hvorimod ekspressionsniveauerne af p38 MAPK, ERK1 /2, blev JNK, og Akt ikke ændret.

HCT116-celler blev behandlet med eller uden LZ-207 i nærvær af LPS i 1 time. *

P

0,05, **

P

β-actin blev anvendt som en intern kontrol. *

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P