PLoS ONE: induktion af apoptose og Reduktion af endogene Glutathion niveau af Ethyl-acetat opløselige fraktion af Methanol Uddrag af Roots of Potentilla fulgens i Cancer Cells

Abstrakt

Potentilla fulgens

rod traditionelt anvendes som et husråd i Meghalaya, Indien. Men systematisk evaluering af dets anticancer effekt var begrænset. Vi undersøgte anticancer potentialer for de forskellige ekstrakter fremstillet ved fordeling af methanol ekstrakt af roden med henblik på at opdage væsentlig medvirkende faktorer fra de mest effektive fraktioner. Methanol ekstrakt af

P

.

fulgens

rødder (PRE) er udarbejdet af maceration, som efterfølgende blev fraktioneret i hexan, ethyl-acetat (EA) og

n

butanol opløselige fraktioner. Forskellige assays (klonogene assay Flowcytometrianalyse, western blot, semikvantitativ RT-PCR og niveauet af endogen glutathion) blev anvendt til at vurdere forskellige parametre, såsom Cell overlevelsesevne, PARP-1 proteolyse, ekspressionsmønster af anti-apoptotiske og γ- glutamyl-cystein synthetase tung underenhed (GCSC) gener i både MCF-7 og U87 cancercellelinier. Da EA-fraktionen viste mest effektive vækstinhiberende virkning, det blev yderligere oprenset og i alt ni forbindelser og nogle monomere og dimere flavan-3-oler blev identificeret og karakteriseret. Tre forbindelser viz., Epicatechin (EF), gallussyre (GA) og ursolsyre (UA) blev taget på grundlag af deres højere udbytte og 10 ug /ml af hver blev blandet sammen. Koncentrationen anvendt i denne undersøgelse for PRE, EA- og Hex-fraktionen var 100 pg /ml, hvilket var højere end IC

50 værdi. Apoptotisk celledød i PRE, EA-fraktion og EF + GA + UA behandlet kræft cellekulturer var signifikant større end i normale celler på grund af undertrykkelse af antiapoptotisk protein Bcl2 efter behandling. Udtømning af glutathion ved at nedregulere GCSC blev også observeret. Induktion af apoptose og sænkning af niveauet af glutathion anses for at være positiv aktivitet for et anticancermiddel. Derfor modulering af GSH-koncentration i tumorceller ved PRE og dens EA-fraktion åbnet op for muligheden for en ny terapeutisk fremgangsmåde, fordi disse planteprodukter ikke er skadelige for normale celler og kan regulere tumor cellulære respons på forskellige behandlinger mod kræft. Således ville det være interessant at undersøge effekten af ​​disse planteprodukter eller EA-fraktionen i human kræftbehandling

Henvisning:. Tripathy D, Choudhary A, Banerjee UC, Singh IP, Chatterjee A (2015) induktion af apoptose og reduktion af endogene Glutathion niveau af Ethyl-acetat opløselige fraktion af Methanol Uddrag af Roots of

Potentilla fulgens

i kræftceller. PLoS ONE 10 (8): e0135890. doi: 10,1371 /journal.pone.0135890

Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN

Modtaget den 22. april 2015; Accepteret: 27 Juli 2015; Udgivet: 18 August, 2015

Copyright: © 2015 Tripathy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af DBT, Govt. Indien (BT /59 /NE /TBP /2010) til AC, UCB, og IPS; DBT fællesskab og DST-Inspire stipendium (IF 120.044) til Alka Choudhary; DBT-stipendium til DT

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Traditionelle lægeplanter som potentiel kræft forebyggende og terapeutiske agenter har modtaget stigende opmærksomhed i de senere år [1,2]. Slægten

Potentilla

tilhører familien

Rosaceae

som omfatter omkring 500 arter, og er primært fordelt i tempererede, arktiske og alpine zoner af den nordlige halvkugle [3].

Potentilla

ekstrakter anses for at være sikre og ikke-toksiske, når de anvendes på mennesker [4,5]. Uddrag roden af ​​

Potentilla anserina

har været brugt til behandling af visse virusinfektioner som folkemusik medicinske urter i Tibet [6]. Det blev foreslået, at tilstedeværelsen af ​​større mængde hydrolyserbare og kondenserede tanniner, flavonoider og triterpenes i de fleste plantedele af

Potentilla

arter kunne være en vigtig faktor for de observerede biologiske virkninger [7].

Potentilla fulgens

Wall. Ex Hook, almindeligvis kendt som Himalaya Potentil på engelsk, er en vigtig lægeplante af højere når af Himalaya. Forskellige etniske grupper af nordøstlige Indien bruger forskellige plantedele som en kilde til medicin, selvom deres virkningsmekanisme er endnu ikke fastslået. Indbyggerne i denne region traditionelt tygge betel-møtrik (

Areca catechu

), betel blade (

Piper betelnødder

) og hanen roden af ​​

P

.

fulgens

for forskellige lidelser [8], men på trods af sin omfattende brug lidt om sin Phytochemistry og virkningsmekanisme. Tidligere undersøgelser af methanol ekstrakt af roden af ​​

P

.

fulgens

har vist bedre overlevelse af musene der bærer Ehrlich ascites celler, og også en dosisafhængig inhiberende virkning på væksten af ​​MCF-7 celler [9]. Et nyligt forsøg på at isolere og karakterisere rene forbindelser fra ethyl-acetat opløselige fraktion af methanol ekstrakt af rødderne af

P

.

fulgens

har ført til ni forbindelser, herunder to nye ursane typen triterpenoids Fulgic acid A og Fulgic acid B. Begge disse nye forbindelser viser god antioxidant aktivitet [10]. Mere omfattende undersøgelser ved hjælp af forskellige analytiske teknikker har fastslået, at flavaner herunder oligomere flavanoler efterfulgt af triterpene syrer er de vigtigste bestanddele af roden af ​​

P

.

fulgens

[11].

Den foreliggende undersøgelse har til formål at undersøge effekten af ​​forskellige fraktioner af

P

.

fulgens

rod ekstrakt på celle overlevelse, celleproliferation, apoptose og endogene GSH-niveau i mammale cancerceller og til at bestemme de vigtigste medvirkende faktorer til en sådan virkning fra den mest effektive brøkdel af dette rod ekstrakt. Vi viser, at

P

.

fulgens Salg rod ekstrakt og dets ethylacetat opløselige fraktion inhiberer væksten af ​​cancerceller ved at inducere apoptose. Vi har også analyseret status af endogent glutathion (GSH) i de behandlede cancerceller og vist sin udtømning, anses for at være en positiv effekt af enhver kemoterapeutisk lægemiddel, fordi sænke niveauet af endogen GSH gør cellen mere følsom over for lægemiddel [12]. Da GSH viste sig at spille en vigtig rolle i celledød regulering og dens udtømning kræver for udførelsen af ​​apoptose [13], derfor bestræbelser på at udvikle lægemidler mod cancer rettet redox systemer, for eksempel, glutathion og thioredoxin, har tiltrukket sig opmærksomhed.

Materialer og Metoder

plantemateriale

Rødder af

P

.

fulgens

, en ikke-truede plante, blev indsamlet fra 20 forskellige planter på Shillong peak skovareal (højde 1700 m over havets overflade, 25 ° 34 nordlig bredde og 91 ° 54 østlig længde) af Meghalaya stat i Indien efter at have fået en ordentlig godkendelse af skoven officer. En kupon prøve blev deponeret i herbarium af Institut for Botany, North-Eastern Hill University, Shillong (tiltrædelse nummer 11906). Roden materiale (1 kg) blev lufttørret under skygge i en uge og jord i en mixer slibemaskine til et groft pulver.

Udvinding og isolation

Ursolic syre, euscaphic syre, corosolsyre, fulgic acid A og B, epicatechin, catechin, gallussyre, p-hydroxybenzaldehyd sammen med flere dimere flavan-3-oler blev isoleret som beskrevet i vores tidligere meddelelser [10]. Kort fortalt methanol ekstrakt (MeOH) (80:20) af

P

.

fulgens

rødder (PRE) er udarbejdet af maceration, som efterfølgende blev fraktioneret i hexan (Hex), ethyl-acetat (EA) og

n

butanol opløselige fraktioner. Ethyl-acetat ekstraktet blev underkastet vakuum væskekromatografi ved anvendelse af hexanethylacetat og chloroform-methanol-gradienter for at give fem samlede fraktioner, E1 til E5. Søjlechromatografi af fraktion E1 gav ursolsyre, euscaphic syre og corosolsyre. To stereoisomere triterpene syrer, fulgic syre A og fulgic syre B blev separeret fra fraktion E2 ved HPLC. Fraktioner E3 til E5 efter søjlekromatografi og omvendt fase HPLC gav phenoler catechin, epicatechin, gallussyre, p-hydroxybenzoesyre, forskellige monomere og dimere flavan-3-oler [10,11]. Isolation ordning er vist i figur 1.

Cellelinie og klonogenisk celleoverlevelse assay.

MCF-7 (human brystcancer cellelinje) og U87 (human malignt gliom-cellelinje) blev købt fra det nationale center for Cell Science (Pune, Indien). Celler blev dyrket i Dulbeccos MEM-medium (DMEM, Invitrogen-Gibco) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen-Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen-Gibco) og 2 mM L-Glutamin ( Invitrogen-Gibco).

cellen survivality blev evalueret under anvendelse af et klonogent assay i både cancercellelinier. Kort beskrevet blev celler trypsiniseret og passende celleantal (2000 og 3000 celler) blev podet i tre 25 cm

2 kolber hver for ubehandlede kontroller blev fire kolber udpladet ved en celledensitet (1000 celler). Fem timer efter podning blev cellerne eksponeret i 24 timer med 5 til 150 ug /ml af rod ekstrakt (PRE), i

P

.

fulgens

eller 10 til 120 ug /ml EA- eller hex- eller

n

butanol-fraktion. Efter behandlingen blev cellerne vasket to gange med mediet og endelig kolber blev inkuberet i en befugtet inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C med frisk Dulbeccos MEM-medium med 10% føtalt kalveserum i 10 dage. Kolonierne blev fikseret og farvet med 0,2% krystalviolet i 70% ethanol. Hvert assay blev udført in triplo og kolonier indeholdende mindst 50 celler blev talt. Antallet af overlevende kolonier (behandlede prøver) blev normaliseret mod antallet af kolonier i ubehandlede prøver.

Behandling detaljer

I alle de forsøg, som blev udført efter colonogenic assay blev kræftceller behandlet med 100 ug /ml PRE, EA-fraktion og Hex-del af den methanol ekstrakt af rødderne af

P

.

fulgens

. I tilfælde af blanding af tre forbindelser, som blev isoleret fra EA-fraktionen dvs. epicatechin (EF), ursolsyre (UA) og gallussyre (GA), hver blev taget 10 ug /ml. Disse tre forbindelser blev taget fra tre forskellige EA-subfraktionerne (fraktion 1, 3 og 4), og deres valg var baseret på deres højere udbytte. I alle disse eksperimenter blev cellerne udsat for 24 timer.

celledræbende evne ved PRE og EA-fraktion til normale og cancerceller

Dette blev bestemt ved trypanblå eksklusion assay. Frisk indsamlet humane perifere blodlymfocytter blev anvendt som normale celler og MCF-7 og U87 celler blev anvendt som cancerceller.

Hepariniseret perifert blod fra to raske mandlige donorer (HPBL) blev opnået efter at have deres skriftlige samtykke til deltagelse og anvendes hurtigt efter sin samling. Perifere mononukleare celler blev isoleret ved Ficoll-Hypaque (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) densitetsgradientcentrifugering (massefylde 1,077 g /ml) i 30 minutter ved 400

g

fra disse frisk udtaget hepariniseret fuldblod . Lymfocytter kulturer blev sat op i RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FCS. Penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mg /ml) og 2 mM L-glutamin blev tilsat til mediet. Lymfocytter blev stimuleret med PHA og efter 24 h lymfocytter blev behandlet med PRE og EA-fraktion (100 og 150 pg /ml) i 24 timer. Disse kulturer blev inkuberet ved 37 ° C og høstedes hurtigt efter behandlingen. Denne undersøgelse blev godkendt af institutionelle og menneskelige etiske komité. I tilfælde af cancerceller, blev MCF-7 og U87 celler anvendt og behandlet med PRE og EA-fraktion (100 og 150 pg /ml) i 24 timer. Celler blev vasket med frisk medium og derefter inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur med 0,4% endelig trypanblåt. Døde celler blev farvet blå, og levende dem blev ufarvede. Forsøg blev gentaget tre gange.

celledræbende evne ved PRE og EA-fraktion blev også evalueret ved flow-cytometrisk analyse (S1 File).

Påvirkning af celleproliferation i MCF-7 og U87 celler

celleproliferation assay blev udført i MCF-7 og U87 celler efter behandling af cellerne med PRE, EA og Hex-fraktioner. Celler ved en densitet på 5 x 10

5 blev dyrket i 25 cm

2 kolber i DMEM-medium ved 37 ° C og 5% CO

2. Efter 24 timers podning blev cellerne eksponeret for PRE, EA eller Hex-fraktion ved en slutkoncentration på 100 ug /ml i 24 timer og endelig fikseres i 70% ethanol. Salg

Alle ovennævnte fikserede celler var vasket i PBS og resuspenderet i 500 pi propidiumiodid-opløsning (20 ug /ml propidiumiodid, 0,2 mg /ml RNase) i 1 time inkubation ved stuetemperatur i mørke. 10.000 celler blev erhvervet for hver prøve og analyseret dem i en FACS Calibur (Becton-Dickinson) ved hjælp Cellquest software for at kvantificere cellecyklus rum til at anslå procentdelen af ​​celler fordelt i de forskellige cellecyklus faser.

Flow cytometrisk analyse af mitokondrisk membranpotentiale

bortledning af mitochondriemembranpotential anses for at være en mitokondrisk forstyrrelse omstændigheder inden apoptose. Det er forårsaget af en pludselig stigning i den indre mitokondrielle membran permeabilitet, kendt som den mitokondriske permeabilitetsovergang [14]. Mitochondriebeskadigelse blev evalueret ved brug af lipofile fluorescerende probe 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetra-ethyl-benzimidazol-carbocyanin iodid ifølge fabrikantens protokol (JC-1; BD Mitoscreen JC-1 kit, Cat 51.302). Apoptotisk celledød blev evalueret i MCF-7 og U87 celler behandlet med og uden PRE, EA-fraktion, hex-fraktion og blandingen af ​​EF, UA og GA hjælp JC-1 pletten. I korte træk blev JC-1 arbejdsdag opløsning fremstillet i 1xAssay puffer og tilsættes 0,5 ml JC-1 pletten til 1×10

6 MCF-7 eller U87-celler i 10 minutter ved 37 ° C i CO

2 incubator. Cellerne blev vasket to gange med 1x assay buffer ved stuetemperatur og endelig JC-1 fluorescens blev målt under anvendelse af en Becton Dickinson FACScalibur analytisk flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). Procentdelen af ​​celler af grøn (530 nm) og rød (590 nm) fluorescens af JC-1 blev analyseret.

immunblotting

immunoblot analyser blev udført for at detektere ekspressionen af ​​PARP og β- aktin proteiner i ubehandlede og behandlede MCF-7 og U87 celler. Cellerne blev forgyldt med 25 cm

2 kolber i en koncentration på 4 x 10

5 og 20 timer efter de blev udsat for PRE, EA, Hex og blanding af EF + GA + UA i 24 timer. Celler opsamledes hurtigt efter behandlingen.

Alle de opsamlede celler blev vasket med PBS og proteiner blev ekstraheret i cellelyse-buffer (50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40 , 0,5% Sodium deoxycholat, 0,1% SDS og 0,42% NaF) indeholdende proteasehæmmer (1 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 100 U /ml aprotinin). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af bicinchonic acid-protein-assay og 40 ug proteinlysater fra hver prøve blev lagt i Novex Tris-glycin 4-20% gradiaent geler og elektroforese blev udført i NuPAGE elektroforese system fra (Invitrogen, USA). Proteiner blev overført til PVDF-membraner (Sigma), som anvender standard protokol. Membranerne blev probet med en 1: 1000 fortynding af et kanin-polyklonalt antistof mod PARP Ab-3 (Neo-markører, USA) og muse-monoklonalt antistof mod β-actin (AC-15; ab6276; Abcam, USA). Membranerne blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk, frisk gjort i TBST (10 mM Tris-CI, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) buffer. Alkalisk-phosphatase-konjugeret anti-muse-IgG (Abcam, USA) anvendes som sekundært antistof, og immundetektion blev opnået ved behandling blottet med substratet opløsning af BCIP /NBT (Bangalore Genei, Indien). Hele forsøget blev gentaget to gange.

DNA fragmentering assay

Opsplitning af DNA som en indikation af apoptose er et almindeligt anvendt assay i lægemiddel-celle interaktionsundersøgelser. De MCF7 og U87 celler (5 x 10

5 celler /kolbe) blev dyrket i 24 timer og derefter udsat for PRE, EA eller Hex-fraktion ved en slutkoncentration på 100 ug /ml i 24 timer. Celler blev vasket én gang med iskold PBS og resuspenderet i 250 pi lysisbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,6, 20 mM EDTA, pH 8,0 og 0,5% (vægt /volumen) Triton X-100). Efter centrifugering ved 12.000 rpm i 5 min blev supernatanten ekstraheret en gang med phenol /chloroform (1: 1) og en gang med chloroform /isoamylalkohol (24: 1). DNA blev udfældet med natriumacetat (pH 5,2) ved -20 ° C natten over. DNA’et blev derefter pelleteret og efterfølgende fordøjet med DNase-frit RNAase (Amersham Biosciences UK Ltd., Little Chalfont, Buckinghamshire, UK) ved 37 ° C i 20 min. Elektroforese blev udført i en 2,0% (vægt /volumen) agarosegel og blev undersøgt under UV-gennemlysning efter farvning med ethidiumbromid for at bestemme omfanget af apoptotisk DNA-fragmentering.

Semikvantitativ RT-PCR (revers transkription polymerasekædereaktion )

ekspressionen af ​​Bcl2, Survivin, CIAP, XIAP, GCLC (glutamat-cystein ligase katalytiske subunit) og GAPDH blev analyseret i MCF-7 og U87 celler efter behandlingen med PRE, EA, Hex og blanding af EF + GA + UA. Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse RNAeasy (Qiagen GmbH, Hilden Tyskland). cDNA’er blev revers transkriberet fra 1 ug totalt RNA fra hver prøve ved anvendelse Quantiscript revers transkriptase, Quantiscript-RT-buffer og RT-primer-blanding af QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden Tyskland) ifølge producentens protokol.

Amplifikation af cDNA blev udført i 20 pi opløsning indeholdende 2 pi cDNA, 10 pmol primer par for Bcl2, Survivin, XIAP, CIAP og GAPDH (for primer sequences- tabel A i S1 File) og 10 pi RT qPCR Master blande (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). PCR bestod af indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 25 reaktionscyklusser (30 sekunder ved 94 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 30 sekunder ved 72 ° C) og en endelig cyklus ved 72 ° C i 10 min. GAPDH blev anvendt som intern kontrol. De amplificerede PCR-produkter blev separeret ved agarosegelelektroforese og visualiseret med ethydium bromid. Den overflod af hver mål-mRNA blev detekteret og normaliseret med den for GAPDH mRNA.

Bestemmelse af GSH-niveau

Totalt cellulært GSH-indhold blev estimeret ved fremgangsmåden ifølge Akerboom og Sies [15] i MCF -7 og U87 celler efter behandling med PRE, EA, Hex og EF + GA + UA. Celler blev podet i 25 cm

2 kolber i en koncentration på 5 x 10

4 og når cellerne nåede sammenflydning mellem 75-80%, PRE eller EA-fraktion eller Hex-fraktion eller EF + GA + UA blev tilsat i 24 timer. Både behandlede og ubehandlede celler blev flashed i iskoldt 0,1 M phosphatpufret saltvandsopløsning (pH 7,4), og volumenet blev fyldt op til 1 ml. Celler blev talt i et hæmocytometer og bearbejdet til bestemmelse af total GSH og som er beskrevet tidligere [16]. Kort fortalt, efter deproteinisering med 10% iskold 5-sulfosalicylsyre 190 pi prøve suspension blev taget og sat til 700 pi NADPH (0,3 mM), 100 pi DTNB (6 mM) og 10 pi GSH reductase (6 enheder /ml) og den optiske densitet af prøverne blev målt ved 412 nm ved UV-synlig spektrofotometer (Cecil serie 1000, Camlab, UK). De GSH-koncentrationer blev bestemt ved sammenligning med standarder.

Statistik

Resultaterne er udtrykt som middelværdi plus eller minus Standardafvigelse (SD). Statistisk analyse af data blev udført af parret t-test og p-værdier. 0,05 blev anset for signifikant

De opnåede fra klonogen overlevelse assay data er repræsenteret som en S-formet fit kurve med en lineær X skala, funktionen anvendte var Boltzmann. Y-værdi ved X

0 anses for at være halvvejs mellem de to grænseværdier på Y-aksen, og det anses for at være inhibitorkoncentrationen 50 (IC

50) værdi.

Resultater

Effekt på klonogene effektivitet

MCF-7 og U87 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af PRE og EA-, hex- og butan ekstraheret fraktioner. Betragtninger PRE, EA-fraktion og Hex-fraktionen forårsagede dosisafhængig reduktion i kloning effektivitet i begge cellelinier (fig 2A-2D) den butanol-fraktionen ikke gøre det (figur 2B). Imidlertid er graden af ​​reduktion i kloningseffektiviteter i både cellelinierne var maksimal med PRE. Værdien af ​​inhibering koncentration (IC

50) udledt fra S-formet passe grafen var 39.34 ug /ml med PRE henviser til EA var 48,4 ug /ml i MCF-7-celler. For U87, disse værdier var 64,2 og 134,3 mg /ml (Fig 2A) med PRE og EA-fraktionen, hhv.

Efter den angivne tid for behandling, celler blev holdt uden testmaterialer i 10 dage. På dag 10 blev de dyrkede kolonier talt og procentdelen af ​​overlevelse fraktion blev derefter beregnet og vist i (A og B) i MCF-7 celler og (C og D) i U87-celler. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± SD for tre uafhængige bestemmelser.

PRE og EA-fraktion dræbe flere kræftceller end normale celler

Hyppigheden af ​​døde celler er mere i kræftcellerne end normale lymfocytter efter behandling med PRE eller EA-fraktion (tabel 1). Betydelig stigning i sub-G1 celler i kræft cellelinjer (målt ved FACS) i forhold til de normale lymfocytter efter behandlingen med PRE eller EA-fraktionen også pege på den øgede apoptose i MCF-7 og U87 (Fig A i S1 fil) .

flowcytometrisk analyse af celler efter behandling med ekstrakten

fordelingen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen blev bestemt ved flow-cytometrisk analyse af DNA-indholdet i MCF-7 ( fig 3A) og U87-celler (fig 3B). Som vist i figuren, blev ingen signifikant akkumulering af celler i enhver fase observeret i nogen af ​​de behandlede cellelinier. Den øgede fraktion af celler i sub-G1-fasen blev observeret i prøver behandlet med PRE (49% i MCF-7 og 45% i U87-celler) og EA-fraktion (MCF-7: 31%, U87: 21%). Den højre panel i fig 3A og 3B viste signifikant stigning i hyppigheden af ​​sub-G1 celler efter behandlingen med PRE og EA-fraktion. Hexan-fraktionen ændrede ikke frekvensen i sub-G1 fase celler.

Right panel-Andelen af ​​celler på forskellige stadier i både MCF7- og U87 celler med og uden behandling. Værdierne er gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. * P 0,05, Students’t-test sammenlignet med ubehandlet kontrol

Analyse af mitochondriemembranpotential af JC1 mærkning afslørede, at procentdelen af ​​polariserede celler var signifikant reduceret i både MCF-7 og U87. celler efter behandling med enten PRE, EA eller en blanding af EF + GA + UA (fig 4A og 4B, fig B i S1 File). Reduktionen af ​​polariserede celler var mindre med Hex-fraktionen i både cellerne. De ubehandlede celler meste udviste rød fluorescens, hvilket indikerer en intakt mitochondriemembranpotential. Ved behandling med PRE eller EA eller EF + GA + UA antallet af celler forbedrede, som det fremgår af grøn fluorescens. Det højre panel i figur (fig 4A og 4B) viste signifikant stigning i cellerne med mitokondrie membran depolarisering efter behandlingen med PRE, EA-fraktion og blandingen af ​​EF + GA + UA.

Den øverste del angiver den procentdel af celler viser polarisering af mitokondriemembran og den nedre del viser procentdelen af ​​celler med mitokondriemembranen depolarisering. Alle disse forsøg blev gentaget to gange. Højre panel viser procentdelen af ​​depolariserede celler efter hver behandling. * P 0,05, Students ‘t-test sammenlignet med ubehandlet kontrol. (C) Effekt af PRE, hexan og ethylacetat fraktion behandling på DNA nedbrydning og fragmentering i MCF7 og U87 celler. DNA-prøver er mærket som: (M) molekylvægtmarkør, (1) ubehandlede celler, (2) celler behandlet med hexan-fraktion, (3) celler behandlet med PRE og (4) celler behandlet med ethylacetat fraktion. Resultaterne er repræsentative for to uafhængige forsøg. Koncentrationen blev anvendt 100 mg /ml, og behandlingen blev givet for 24 timer.

DNA-fragmentering analyse

For at validere induktion af apoptose ved PRE, EA eller blanding af EF + GA + UA i både MCF-7 og U87 celler blev DNA fragmentering analyse udført (fig 4C). Det blev observeret, at behandling med PRE og EA-fraktion (100 ug /ml) i 24 timer viste DNA nedbrydning i association med DNA laddering i U87-celler (panel 3 og 4), men i MCF-7 celler delvis og fuldstændig DNA-nedbrydning var observeret i bane 3 og 4, henholdsvis uden DNA laddering. DNA-nedbrydning kunne ikke observeres i disse cellelinier efter behandling med hexan-fraktion i 24 timer. Tilsammen PRE og EA-opløselig fraktion induceret DNA nedbrydning i både U87 og MCF-7cells som er den biokemiske kendetegnende for apoptotisk celledød.

Påvisning af PARP-1 proteolyse og ekspressionsniveauet af apoptoseinhibitorer

for at bekræfte, at celledøden induceret af PRE, EA eller blanding af EF + GA + UA i begge MCF-7 og U87 celler skyldtes apoptose, spaltning af PARP blev målt i begge cellelinier efter 24 h behandling (fig 5A). PARP-1 proteolyse blev påvist efter behandlingen med PRE, EA og blanding af EF + GA + UA i både cellerne (Fig 5A). I overensstemmelse med denne observation, blev signifikant reduktion i ekspressionen af ​​Bcl2 i både MCF-7 og U87 celler også observeret efter behandlinger med PRE, EA fraktion og de mix-forbindelser (Fig 5B og 5C). Behandling med Hex-fraktion ikke reducere niveauet af Bcl2 i begge celletyper. Udover Bcl2 blev ekspressionen af ​​inhibitorer af apoptose proteiner også reduceret efter disse behandlinger i MCF-7 celler, mens der i U87 celler sådan reduktion blev ikke observeret.

(A) Bestemmelse af PARP spaltning. Nedre panel viser kvantitativ densitometrisk analyse af omfanget af PARP med og uden spaltning i de behandlede og ubehandlede MCF-7 og U87 celler. Værdierne er gennemsnit ± SEM for tre uafhængige forsøg. To uafhængige ubehandlede prøver blev anvendt. Værdierne normaliseret til respektive p-actin værdier. Expression mønster af Bcl2, survivin, XIAP og CIAP hjælp semikvantitativ RT-PCR i (B) MCF-7 og (C) U87 celler behandlet med eller uden PRE, EA, Hex fraktioner og EF + GA + UA (to uafhængige stikprøver). Højre sidepanel viser kvantitativ densitometrisk analyse af ekspressionen profilen af ​​gener mRNA-niveau. Værdierne er gennemsnit ± SEM af to uafhængige forsøg og normaliseres til respektive GAPDH værdier.

niveau af reduceret glutathion (GSH) og ekspressionsniveauet af GCLC

Niveau af reduceret GSH i MCF-7 og U87-celler er vist efter behandlingen med PRE, EA, Hex og EF + GA + UA (fig 6B og 6D). Koncentrationen af ​​GSH blev reduceret betydeligt i både cellerne efter behandlingen med PRE, EA og EF + GA + UA.

To uafhængige ubehandlede prøver blev anvendt i denne undersøgelse. Nedre panel viser kvantitativ densitometrisk analyse af ekspressionen profilen af ​​GCLC mRNA-niveau. Værdierne er gennemsnittet ± SEM af to uafhængige forsøg og er normaliseret til respektive GAPDH værdier. Niveauer af glutathion i (B) MCF-7 celler og (D) U87 celler behandlet med eller uden PRE, EA, Hex fraktioner og EF + GA + UA. To uafhængige ubehandlede prøver blev anvendt i denne undersøgelse. Værdier er gennemsnit ± SEM af tre forskellige eksperimenter. * P. 0,05, Students ‘t-test sammenlignet med ubehandlet kontrol

Denne reduktion i GSH-niveau er ledsaget af den mindre ekspressionen af ​​GCLC i de behandlede MCF-7 og U87 celler (Fig 6A og 6C).

diskussion

P

.

fulgens

rod-lager og hele urt er almindeligt anvendt som folkemedicin af indfødte i nordøst Indien, Nepal og Bhutan til række lidelser [8]. Ved hjælp af forskellige analytiske teknikker med det rå ekstrakt blev det vist tilstedeværelsen af ​​triterpene syrer og B-type flavan-3-oler i ekstrakten, der er generelt kendte for forskellige biologiske aktiviteter [11]. Opløsningsmiddel-solvent opdeling af methanol ekstrakt gav hexan, ethyl-acetat,

n

butanol og vandigt ekstrakt. Den foreliggende undersøgelse viste lovende anticancer aktivitet af den rå methanoliske ekstrakt af

P

.

fulgens

rod og dens EA-fraktionen mod MCF-7 og U87 celler. Koncentrationen anvendt i denne undersøgelse for PRE, EA- og Hex-fraktionen var 100 pg /ml, hvilket var højere end den enkelte IC

50 værdi. Alle disse ekstrakter blev evalueret tidligere for antioxidant og cytotoksiske aktiviteter og EA-fraktionen viste sig at være den mest aktive [10]. I denne undersøgelse blev det observeret, at behandling med PRE eller EA-fraktion dræbt betydeligt flere cancerceller end normale celler. Både PRE og EA-fraktionen forårsagede dosisafhængig reduktion i kloningseffektiviteten i begge cellelinier, men denne reduktion i kloning-effektivitet blev ikke observeret med hexan- og

n

butanol-fraktioner. Da EA-fraktion viste mest effektive vækstinhiberende virkning, det blev yderligere oprenset og testet for deres anticanceraktivitet.

Tidligere ni forbindelser og nogle monomere og dimere flavan-3-oler blev identificeret og karakteriseret fra EA-fraktionen af methanolopløsningen rod ekstrakt af

P

.

fulgens

[10]. Ud fra disse ni forbindelser, tre forbindelser viz., Epicatechin (EF), gallussyre (GA) og ursolsyre (UA) blev udvalgt og blandet sammen. Udvælgelsen af ​​disse forbindelser blev foretaget fra tre forskellige sub-fraktioner og var baseret på deres højere udbytte med hensyn til beløb; GA (3,6%), UA (3,3%) og EF (2,7%) i rå methanol ekstrakt [10,11]. UA viste sig at være den mest aktive forbindelse blandt de isolerede triterpene syrer med IC

50 5.3 og 7.8 uM i DPPH

• og ABTS

+ • antioxidant assay [10,11].

i denne undersøgelse MCF-7-celler var mere følsomme end U87 celler, idet signifikant reduktion i cellevækst blev opnået ved lavere koncentration af PRE og EA-fraktion. En sådan inhibering af væksten af ​​disse cellelinier kunne tilskrives følge af enten inhibering i celleproliferation eller dræbe celler. Den flowcytometrisk analyse demonstrerede en forøget fraktion af celler i sub-G1 angiver celledød som kan skyldes apoptose. For at opnå yderligere beviser for apoptose, testede vi, om de døende celler udviste andre egenskaber ved programmeret celledød. Flowcytometrisk analyse viste signifikant reduktion af polariserede celler i mitokondriemembranen henviser immunblotresultaterne viste spaltet PARP-1-protein i prøverne behandlet med PRE, EA-fraktion og blandingen af ​​EF + GA + UA. PARP aktiveres på et mellemstadium af apoptose og inaktiveres ved proteolytisk spaltning på et sent tidspunkt af caspase3 og caspase7. Sådan proteolytisk spaltning af PARP betragtes som kendetegnende for apoptose [17]. Således foreliggende resultater tyder på, at det rå ekstrakt af

P

.