PLoS ONE: ZIC1 nedreguleres via Arrangøren Hypermethylering, og fungerer som et tumorsuppressorgen i kolorektal Cancer

Abstrakt

transskription faktor, Zink finger af lillehjernen (ZIC1), spiller en afgørende rolle i hvirveldyr udvikling . For nylig ZIC1 har også vist sig at deltage i progressionen af ​​humane cancere, herunder medulloblastomer, livmoderkræft og mesenchymale neoplasmer. Men funktionen af ​​ZIC1 i tyktarmskræft progression ikke er blevet defineret,. I denne undersøgelse viser vi ZIC1 at forstumme eller væsentligt nedreguleret i Colon cancer cellelinjer. Disse effekter blev vendt ved demethylering behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin (Aza). ZIC1 udtryk også signifikant nedreguleret i primære kolorektale cancer væv i forhold til tilstødende ikke-tumorvæv (

s

= 0,0001). Endvidere er methylering af ZIC1 genpromotor ofte påvist i primære tumorvæv (85%, 34/40), men ikke i tilstødende ikke-tumorvæv. Ektopisk ekspression af ZIC1 undertrykker celleproliferation og inducerer apoptose, som er forbundet med MAPK og PI

3K /Akt veje, samt Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade. At identificere mål kandidater ZIC1, vi ansat cDNA microarray og fandt, at 337 gener nedreguleres og 95 gener opreguleret ved ektopisk udtryk for ZIC1, som blev verificeret ved 10 udvalgte gen udtryk ved QRT-PCR. Tilsammen tyder vore resultater, at ZIC1 potentielt kan fungere som et tumorsuppressorgen, der nedreguleres ved promotor hypermethylering i kolorektale cancere

Henvisning:. Gan L, Chen S, Zhong J, Wang X, Lam EKY, liu X, et al. (2011) ZIC1 nedreguleres via Arrangøren Hypermethylering, og funktioner som et tumorsuppressorgen i kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (2): e16916. doi: 10,1371 /journal.pone.0016916

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: 10. oktober 2010; Accepteret: 3 januar 2011; Publiceret: 15 feb 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af National Natural Scientific Foundation of China (30900676), Natural Scientific Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (Y206280), og Institut for Videnskab og Teknologi i Zhejiang-provinsen i Kina (2009C03012-3). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform, samt den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Den sekventielle akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer fører til omdannelsen af ​​normale tyktarmsepitelet til kolorektal cancer [2]. Disse epigenetiske ændringer, herunder promotor-DNA methylering og histon modifikationer, kan inducere inaktivering af tumorsuppressorgener (GTS) [3] – [5]. DNA-regioner beriget med CpG-dinukleotider, kaldet CpG øer, kan blive hypermethyleret i cancerceller og resultere i undertrykkelse af GTS [5]. En undergruppe af CRCs display methylering af multiple gener, betegnet CpG øen methylator fænotype (CIMP) [2], [5]. Vi og andre har tidligere fundet, at stigende antal GTS herunder APC, CDKN2A /p16, UCHL1, og TBX5 ofte til tavshed gennem promotor hypermethylering i CRC’er [2], [6] – [9]. Disse begivenheder kan forekomme i tidligt i CRC’er [9], [10], der fremhæver betydningen af ​​promotor hypermethylering i tumorgenese af CRC’er.

Placeret på kromosom 3q24, ZIC1 koder en C

2H

2-typen zinkfinger transcription faktor, der spiller en kritisk rolle i udviklingen af ​​crista neuralis og cerebellum hos hvirveldyr [11] – [15]. Som zinkfinger transkriptionsfaktorer, kan zic familie proteiner binder til GC-rige sekvens i målgener [15]. Trods sin rolle i neural udvikling, blev ZIC1 sig også at deltage i progressionen af ​​humane cancere, såsom medulloblastom, livmoderkræft og mesenchymale neoplasmer [16] – [18]. Vi har identificeret ZIC1 som en ny kandidat TSG i gastrisk cancer [19]. For at understøtte sin rolle i kræft, kan ZIC1 fungere som repressor i downstream mål for sonisk pindsvin (Shh), BMP (knoglemorfogenetisk protein), og såvel som spiller en rolle i Notch signalvej under neural udvikling rør [14], [15]. Men den biologiske betydning af DNA-methylering, og den molekylære mekanisme bag ZIC1 fungerer som en GTS i CRCs stadig ukendte. Her rapporterer vi, at ZIC1 promotor ofte methyleres i CRC’er væv og tyktarmskræft cellelinjer. Ektopisk ekspression af ZIC1 fører til cellevækstinhibering, og ændre ekspressionen af ​​potentielle målgener som kan spille vigtige roller i colorektal carcinogenese. Vores resultater tyder på, at ZIC1 kan potentielt fungere som en roman funktionel tumor suppressor i CRC’er.

Resultater

Transkriptionel dæmpning af ZIC1 er forbundet med sin promotor hypermethylering i kolon kræftceller

at afgøre, om ZIC1 er bragt til tavshed af promotor hypermethylering i tyktarmskræft, undersøgte vi ekspressionen af ​​ZIC1 mRNA i seks tyktarmskræft cellelinjer. Semikvantitative RT-PCR viste, at ZIC1 transkript blev stille eller nedreguleret i alle kolon cancercellelinjer sammenlignet med normale colon væv (figur 1A). Den demethylering behandling af Aza dramatisk restaureret udtryk for ZIC1 mRNA i en delmængde af tyktarmskræft celler (HCT116, HT29 og SW620) (Figur 1B), implicerer, at DNA methylering kan være involveret i reguleringen af ​​ZIC1 udtryk. Desuden vi ansat methylering specifik PCR (MSP) og fandt, at tre tyktarmskræft cellelinier (HCT116, DLD1 og SW620) blev påvist med fuld methylering. De andre tre cellelinier (HT29, LS180 og SW480) blev fundet med delvis methylering. Nr methylering blev påvist i de normale colon væv (figur 1C). Således indikerer disse resultater, at transkriptionel stilhed ZIC1 i tyktarmskræft cellelinjer kan medieres af DNA promotor hypermethylering.

(A) Udtrykket af ZIC1 er bragt til tavshed eller nedreguleres i colon cancer cellelinjer, sammenlignet med normal colon væv ved RT-PCR. GAPDH blev anvendt som den interne kontrol. Normal colon: Normale colonvæv. (B) ZIC1 ekspression er genoprettet i colon cancerceller (HCT116, HT29 og SW620) efter behandling med demethylering agent 5-aza ved RT-PCR. AZA: 5-aza-2′-deoxycytidin. (C) Status methylering af ZIC1 CpG promotor detekteres af methylering-specifik PCR (MSP) i tyktarmskræft cellelinjer. M: methylerede; U:. Umethyleret

Nedregulering og promotor hypermethylering af ZIC1 i primære kolorektale tumorer

For yderligere at undersøge forholdet mellem ZIC1 udtryk og promotor hypermethylering, vi analyserede ZIC1 mRNA-ekspression og CpG websted methylering status i primær colorektal tumor og tilstødende ikke-tumorvæv ved QRT-PCR og MSP hhv. Niveauet af ZIC1 mRNA var signifikant reduceret i de fleste tumorvæv i forhold til tilstødende ikke-tumorvæv (

s

= 0,0001, n = 24) (figur 2A). Endvidere blev promotor-methylering detekteret i 85% (34/40) af colorektale tumorvæv, men ikke i hosliggende ikke-tumorvæv ved MSP analyse (de repræsentative data vist i figur 2B), hvilket indebærer en tumorspecifik hypermethylering af ZIC1 promotoren i CRCs. Men vi kunne ikke finde en signifikant sammenhæng mellem ZIC1 promotor methylering og kliniske karakteristika, såsom alder, køn, tumor differentiering, og TNM stadie (tabel 1).

(A) ZIC1 mRNA-ekspression blev bestemt ved kvantitativ real-time PCR i fireogtyve par af primær colorektal tumor og ifølge hosliggende ikke-tumorvæv. Data blev analyseret ved Wilcoxon matched pair test. (B) Status methylering af ZIC1 promotor i primær kolorektal karcinom og tilstødende ikke-tumorvæv blev bestemt ved MSP. Repræsentativt billede er vist. T: tumorvæv; N: hosliggende ikke-tumorvæv; M: methylerede; U:. Umethyleret

ZIC1 hæmmer spredning af kolon kræftceller

For at undersøge effekten af ​​ZIC1 på celledeling i tyktarmskræft, vi udførte cellernes levedygtighed og kolonidannelse analyser i CRC-cellelinjer. Først blev transfektionseffektiviteten af ​​vores ZIC1 konstrukt bekræftet ved RT-PCR og western blot i tumorcellelinier (HCT116 og HT29) (figur 3A). Dernæst vurderede vi den undertrykkende effekt af ZIC1 overekspression på celleproliferation ved celleviabilitetstest. Som vist i figur 3B, ektopisk ekspression af ZIC1 signifikant inhiberede cellelevedygtighed i HCT116 og HT29-celler (

s Restaurant 0,05). Vi observerede også, at antallet af overlevende dannede kolonier på pladerne blev signifikant reduceret sammenlignet med kontrolvektoren transfektanter (

s Restaurant 0,01) (figur 3C). Desuden afslørede vi, at ektopisk ekspression af ZIC1 inhiberede phosphorylering af ERK1 /2-og Akt kinaser (figur 3D), to centrale celleproliferation pathway regulatorer. Disse resultater bekræftede undertrykkende effekt af ZIC1 på celleproliferation.

(A) Re-ekspressionen af ​​ZIC i stabile transfektanter i tyktarmskræft celler (HCT116 og HT29) blev bekræftet ved RT-PCR (øverste bane) og vestlige blot (lav bane) GAPDH og β-actin anvendt som intern kontrol. (B) Cell levedygtighed assay efter ZIC1 re-udtryk i kolon cellelinjer (HCT116 og HT29). Antallet af levedygtige celler blev målt ved MTS-assay efter transient transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 vektor. Assayet blev udført tre gange. Stjernen angiver statistisk signifikans (

s

0,05). (C) Virkningen af ​​celleproliferation inhibering ved ektopisk ekspression af ZIC1 blev bestemt ved kolonidannelse assayet i colon cancerceller. Den kvantitative analyse af koloni numre dannet i pcDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 vektor transfektanter er vist i højre søjlediagram i tre individuelle eksperimenter i HCT116 og HT29-celler. Stjernen angiver statistisk signifikans (

s

0,05). (D) Udtrykket Phos-Akt og Phos-ERK1 /2, såvel som det totale af Akt og Erk1 /2 blev analyseret ved western blot. Band densiteter blev kvantificeret og proteinniveauer (p-Akt, p-Erk1 /2), blev normaliseret for p-actin. Densitometri værdier (ZIC1 transfektanter) udtrykkes som fold ændring i forhold til vektor transfektanter værdier normaliseret til 1.

Ektopisk udtryk for ZIC1 inducerer celle apoptose

For at undersøge mekanismerne bag hæmning af celleproliferation med ektopisk ekspression af ZIC1 analyserede vi celleapoptose og cellecyklus ved flowcytometri assay. Som vist i figur 4A, cellerne transficeret med ZIC1 induceret celle apoptose. Desuden viste vores resultater, at re-ekspression af ZIC1 førte til den aktiverende af apoptose-relaterede kaskader, herunder spaltning af caspase3, nedregulering af Bd-XL, og Bad dephosporylation (figur 4B). Disse resultater indikerer, at induktionen af ​​celleapoptose gennem overekspression af ZIC1 medieres af Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade. Men igen ekspression af ZIC1 ikke påvirke cellecyklusprogression (data ikke vist).

(A) Cell apoptose blev påvist ved den Annuexin V-PI flowcytometri assay. De repræsentative tal er vist efter kortvarigt transficeret med ZIC1 eller kontrol vektor efter 48 timer i HT29 og HCT116 celler. Region A1 angiver tidligt apoptotiske celler, A2 viser sent apoptotiske celler. (B) Western blot-analyse af apoptotiske regulerede proteiner. Udtrykket af phospho-Bad og Bad, Bcl-xl, kløvet-caspase3, og Caspase3 blev påvist efter gennemskæres med ZIC1 eller kontrol vektor i kolon cancer cellelinjer (HT29 og HCT116). Band tætheder blev kvantificeret og protein niveauer (p-Bad, Bad, Bcl-xl, og spaltede-caspase3) blev normaliseret til p-actin. Densitometri værdier (ZIC1 transfektanter) udtrykkes som fold ændring i forhold til vektor transfektanter værdier normaliseret til 1.

genekspressionsprofil ændringer ved ektopisk eksogen ZIC1 udtryk

For at søge efter target gener af ZIC1 i tyktarmskræft celler, vi udnyttet cDNA microarray at analysere genekspressionsprofil forandringer som følge af ektopisk udtryk for ZIC1. Denne analyse viste, at 337 gener blev nedreguleret og 95 gener blev opreguleret af eksogene ekspression af ZIC1 ved brug af en 2-gange ændring af ekspression som tærskel (repræsentative gener vist i figur 5A). Som vist i tabel 2, har mange af disse gener blevet beskrevet at spille en vigtig rolle i celleproliferation og apoptose. For at bekræfte ekspressionsmønsteret observeret i microarray, validerede vi udtryk for 10 udvalgte gener i kolon kræftceller transficeret med ZIC1 af QRT-PCR. Resultaterne viste, at

CCNA2

(valsens A2) og

IGFBP3

(insulin-lignende vækstfaktor-bindende protein 3) var signifikant opreguleret ( 2 gange ændring), mens

ANGPT2

(angiopoietin 2),

GADD45B

(vækst anholdelse og DNA-skader-inducerbare, beta),

LAMB2

(laminin, beta 2),

LAMB3

(laminin , beta 3),

MALAT1

(metastase forbundet lunge adenocarcinom udskrift 1),

PNMA2

(paraneoplastisk antigen MA2),

RPA4

(replikation protein A4), og

TACSTD2

(tumor-associerede calcium signal transducer 2) ( -2 fold ændring) blev nedreguleret ved overekspression af ZIC1 i HCT116 og HT29-celler (figur 5B og tabel S1). Disse data var overensstemmende med den, der opnås fra microarray analyse.

(A) Den differentielle ekspression af gen profiler i ZIC1 eller kontrol vektor stabile transfektanter blev visualiseret ved hjælp af Java TreeView i HCT116 cellelinier. Repræsentative gener over to-gange ændring er angivet på den højre side af billedet. (B) Genes transkript mængde på 10 udvalgte gener blev målt ved QRT-PCR og beregnes ved hjælp af værdien af ​​2

– △△ CT. Relativ genekspression i ZIC1 transfektanter blev sammenlignet med tom vektor kontrol, som blev normaliseret som en referenceværdi på 1,0. Hvide søjler angiver resultatet af microarray analyse og sorte søjler repræsentative for QRT-PCR-data i HCT116 cellelinie.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at ZIC1 blev stille eller nedreguleret i colon cancer cellelinjer, samt i primære tumorvæv forhold til tilstødende ikke-tumorvæv (

s

0,05). Desuden vore observationer identificerer, at promotor DNA hypermethylering bidrager til ZIC1 lyddæmpning eller nedregulering i CRCs. Disse resultater er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse af ZIC1 i gastrisk kræft [19], hvilket indikerer, at promotor CpG methlyation er den dominerende mekanisme for ZIC1 nedregulering. Men vi kan ikke udelukke forekomsten af ​​andre mekanismer i nedregulering af ZIC1, såsom histon eller nukleosom remodeling. For eksempel ZIC1 ekspression ikke genoprettes efter Aza behandling i LS180 og SW480-cellelinier (data ikke vist). Nylige undersøgelser viser, at methylering af histon H

3 ved lysin 27 er forbundet med ZIC1 silencing i embryonale stamceller [18]. Chromatin immunopræcipitationsanalyser viser, at ekspressionen af ​​ZIC1 er forbundet med histon H

3 dimethylering på lysin 4 i desmoids og MEF celler [18].

På trods af illustration af den kritiske rolle ZIC1 i hvirveldyr udvikling [ ,,,0],13], [15], funktionel karakterisering af ZIC1 i carcinogenese forbliver stort set ukendt. Her, vores resultater viser, at exogent ZIC1 inhiberer celleproliferation gennem p-Akt og p-ERK1 /2-inaktivering i colon cancerceller. PI

3K /Akt og MAPK (mitogenaktiveret proteinkinase) signalveje er velkendte til at fungere som vigtige bestanddele af celleproliferation i tumorceller [20], [21]. Akt og Erk1 /2, en gang aktiveres ved phosphorylering, kan fungere som vigtige effektorer af PI

3K og MAPK signalveje for at fremme celleoverlevelse og proliferation [20] – [24]. Således kan ZIC1 mediere celleproliferation gennem PI

3 K /Akt og MAPK veje i tyktarmen kræftceller. Desuden fandt vi, at ektopisk ekspression af ZIC1 kan inducere apoptose af colon cancerceller. Blandt det brede spektrum af proteiner og gener involveret i apoptose, er medlemmer af Bcl-2-familien spiller en central rolle i denne proces [25], [26]. Caspase-3 er blevet identificeret som værende en vigtig mediator af apoptose i pattedyrceller, og phosphorylering af Bad kan blokere dens apoptotiske funktion [22], [25], [26]. I den forbindelse fandt vi, at ekspressionen af ​​spaltet-caspase3 og Bad blev induceret, mens phospho-Bad og Bcl-xl blev undertrykt ved re-ekspression af ZIC1. Vores resultater antyder, at induktion af apoptose ved ZIC1 kan være forbundet med Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade i colon cancerceller.

I et forsøg på at identificere nedstrøms mål ZIC1 i CRCs analyserede vi genekspressionsprofilerne af tyktarmskræft celler med eller uden ZIC1 overekspression. Resultaterne viste, at 337 gener blev nedreguleret og 95 gener blev opreguleret af ZIC1 (repræsentative hidtil ukendte gener vist i tabel 2). Mange af disse gener er blevet forbundet med cellulær vækst, apoptose, adhæsion, angiogenese, og signaltransduktion i tumorigenese [27] – [33]. For eksempel ZIC1 undertrykt udtryk for

GADD45B

.

GADD45B

induceres ved aktivering af p38 /JNK (c-Jun N-terminal kinase) pathway [27], og en vigtig mediator af NF-KB-JNK krydstale og celle apoptose [28]. JNK er en anden vigtig nedstrøms del af MAPK kaskader, og er forbundet med cellevækst og cellulært respons på DNA beskadigelse [21], [23], [24]. Desuden fandt vi, at ZIC1 øgede ekspression af

RSU1

(Ras suppressor protein 1), som er rapporteret at hæve niveauerne af p21

CIP CDK-inhibitor, samt inaktivere Jun og Rho-afhængig kinaser under EGF stimulation [29]. Med vores fund af ZIC undertrykkelse af p-Erk1 /2, foreslår vi, at ZIC1 kan regulere MAPK veje medieret af ERK og JNK-kinaser. Yderligere undersøgelser er påkrævet for at illustrere de mekanismer, som ZIC1 regulerer disse potentielle veje i kræft progression. Desuden viste vi, at ZIC1 kan undertrykke ekspressionen af ​​andre nye gener (

TACSTD2

,

ANGPT2

,

LAMB2, LAMB3

og

MALAT1

etc. ) relateret til tumor angiogenese og metastase.

TACSTD2

er blevet fundet i forbindelse med tumor aggressivitet og dårlig prognose i epiteliale celle tumorer, herunder tyktarm og mavekræft [30], [31].

ANGPT2

fremstår som en vigtig regulator af vaskulær remodellering under tumor angiogenese [32], [33].

Som zink finger transkriptionsfaktorer kan ZIC familien af ​​proteiner binder til GC-rige sekvenser i målgener [13], [15]. ZIC1 kan regulere målgener i begge sekvensspecifikke og sekvens-uafhængige måder [15]. Afhængigt af dets interaktion partnere, kan Zic proteiner aktivere eller undertrykke transskription af målgener. Som forventet, vi observeret, at ZIC1 reguleret ekspression af vigtige transkriptionsfaktorer såsom

RPS2

,

NTF3

,

PRDM16

,

KLF15

,

SHC2

FOXJ1

(tabel S2). ZIC1 har vist sig at modvirke med Gli (gliom-associeret onkogen homolog 1), der fungerer som nedstrøms for sonisk pindsvin (Shh) signalvejen og deltage i udviklingen af ​​tyktarmskræft [34] – [36]. I mellemtiden, mange af downstream mål for ZIC1 herunder Notch, cyclin D1, og Wnt3a er blevet revideret i neurale udvikling og dyremodeller [15], [37]. Disse gener er velkendte spiller afgørende roller i udvikling af cancer. Studiet af ZIC1 målgener kan give yderligere indsigt i de mulige mekanismer ZIC1 tjener som en tumor suppressor i CRC’er.

Sammenfattende vi afslørede, at en roman tumorsuppressorgen ZIC1 blev inaktiveret ved promotor methylering i tyktarmskræft celler. ZIC1 blev også nedreguleret og ofte hypermethyleret i primære kolorektale kræft væv. ZIC1 hæmmer celledeling gennem undertrykkelse af PI

3k og MAPK veje, induktion af celle apoptose gennem Bcl-xl /Bad /Caspase3 kaskade, regulering af downstream mål og veje impliceret i kolorektal carcinogenese.

Materialer og Metoder

Cell kultur og vævsprøver

De humane coloncancer-cellelinjer (HCT116, HT29, DLD1, LS180, SW480 og SW620) blev opnået fra Riken Gene Bank (Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, USA). HCT116 cellelinie blev dyrket i McCoys 5A-medium (Invitrogen, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum, alle andre cellelinjer blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer inkuberes ved 5% CO2, luftfugtighed

37 ° C og 95%.

Fyrre kirurgiske resektion kolorektale adenokarcinomer og tilstødende ikke-tumor prøver blev opnået fra Sir køre køre Shaw Hospital, School of Medicine Zhejiang University. CRC blev klassificeret i henhold til International Union Against Cancer Kriterier og iscenesat med tumor-node-metastaser (TNM) system. Prøver blev straks nedfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80 ° C indtil yderligere forarbejdning. Alle patienter forudsat informeret skriftligt samtykke til at opnå undersøgelsen prøver. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Clinical Research etiske komité Sir køre køre Shaw Hospital.

Farmakologisk DNA demethylering med 5-Aza-2′-deoxycytidin

Celler blev behandlet i 72 timer med 5 iM 5-

aza

-2 ‘-

deoxycytidin

(aza) (Sigma, St. Louis, MO, USA), en godt brugt methyltransferase-hæmmer. Aza var genopfyldes hver 24 timer. En tilsvarende koncentration af vehikel (DMSO) blev anvendt som kontrol.

RT-PCR og kvantitativ PCR-analyse

Totalt RNA (1 ug) blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ved at følge fabrikantens instruktion, derefter revers transkriberet til cDNA med høj kapacitet cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). RT-PCR blev udført i 35 cykler (95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s). PCR-produkt blev elektroforeret i 2% agarose og farvet med ethidiumbromid. Kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) blev udført med SYBR Green Master Mix kit (Takara, Japan) i ABI 7500 PCR-system. Den relative gentranskript niveau blev normaliseret til hus holde gen (GAPDH) ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode. Alle primere sekvenser blev anført i tabel S3.

bisulfitbehandling af DNA og methylering specifik PCR (MSP)

Genomisk DNA (1 pg) blev bisulfit-behandlet med Zymo DNA modifikation Kit (Zymo Research , USA). Methylering status ZIC1 blev påvist ved methylering-specifik PCR (MSP) ved anvendelse af bisulfit behandlede genomiske DNA som template. MSP blev udført i 40 cykler med annealing temperatur ved 60 ° C, som tidligere beskrevet [38], [39]. Methylering (M) primere var: F 5′-GGATTTTTTGTTTCGTAATC, R 5′-CCCGTTAACCACGTTAAACG, og Unmethylation (U) primere var:. F 5′-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT, R 5′-CCCATTAACCACATTAAACA

Cell transfektion og cellernes levedygtighed assay

for at konstruere et ZIC1 ekspressionsplasmid blev fuld længde ZIC1 åben læseramme klonet ind pattedyrekspressionsvektor pCDNA3.1 som tidligere beskrevet [19]. For at generere stabil transfektion celler blev HCT116 og HT29-celler transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 vektor under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen), og udvalgt af G418 (400 ug /ml) i 14 dage i en 12-brønds plade. Overekspressionen af ​​ZIC1 blev bekræftet ved RT-PCR og Western blot i de overlevende kolonier. Så disse stabile heterogene populationer af celler blev overført til 6-brønds plade til kontinuerlig selektion med G418 til yderligere undersøgelser.

Cellelevedygtighed blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2- (4-sulfophenyl) -2H -tetrazolium (MTS) reagenser (Promega, Madison, USA). Kort fortalt HCT116 og HT29-celler blev dyrket 24 timer i en 12-brønds plade og transient transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1. Så disse celler blev udpladet i 96 brønde (2000-4000 celler /brønd) i 48 timer. Efter inkubering med CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens i 1 time blev absorbansen målt ved 490 nm efter instruktion af MTS.

Kolonidannelse assay

HCT116 og HT29-celler blev dyrket i 12 – brønds plade (1,0 x 10

5 celler /brønd) i 24 timer og transficeret med pCDNA3.1-ZIC1 eller pCDNA3.1 vektor. Efter 48 timer blev transfektanter genudpladet i 6-brønds plade og dyrket i 12-20 dage i kultur medium indeholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier blev farvet med Gentian Violer efter methanol fiksering og synlige kolonier (≥ 50 celler) blev talt. Forsøgene blev udført in triplo.

Cell apoptose og celle-cyklus analysen

celleapoptose assays blev udført ved anvendelse af annexin V /PI (Invitrogen) ved hjælp af flowcytometri analyse (FCA). Kort fortalt blev forbigående transficerede celler (HCT116, HT29) suspenderet i annexin-bindingsbuffer blev Alexa Fluor 488 annexin V og PI arbejdsopløsning tilsat i rækkefølge. De farvede celler blev endeligt analyseret ved flow-FACScan flowcytometri (Becton Dickinson, USA) ved 560 nm. I mellemtiden, 2 × 10

5 sederede celler blev udsat for den ultraviolette at inducere apoptose som en positiv kontrol.

cellecyklusfordeling blev registreret af Cycletest Plus DNA Reagent kit (Becton Dickinson, USA). Kort fortalt blev transficerede celler høstet og vasket i PBS, blev cellulært DNA farvet med 125 ug /ml propidiumiodid i 20 minutter ved 4 ° C i mørke. Cellerne derefter blev sorteret ved FACS Calibur og cellecyklus-fordelingen blev bestemt under anvendelse af ModFit LT software (Phoenix, USA).

Western blot-analyse

Total proteiner blev ekstraheret fra stabilt transficerede celler ved anvendelse af RIPA-lysepuffer. Lysater (20-60 ug) blev opløst på SDS-PAGE-gel og overført til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA). Blottene blev probet med ZIC1 (1:500, Abcam), Caspase3 (1:500; Sigma-Aldrich), Bcl-xl (1:500, Sigma), Bad (1:500, Abnova), phospho-Bad (1 :1000, Cell Signaling), Akt (1:500, Abcam), phospho-Akt (1:2000; Cell Signaling), Erk1 /2 (P44 /42) (1:1000, Cell Signaling), phospho-Erk1 /2 (P44 /42) (1:2000, Cell Signaling) og β-actin (1:2500, Multisciences Biotech) antistoffer. Blottene blev udviklet ved hjælp af en kemiluminiscens med Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japan).

cDNA microarray analyse og validering

Microarray undersøgelser blev filtreret for at identificere dem, der profilerede genekspression i ZIC1 eller styrevektor stabilt transficeret cellelinie (HCT116) baseret på Affymetrix platform. cDNA blev transkriberet til cRNA med aaUTP binding, der tillader inkorporering af fluorescerende farvestof Cy3 (pCDNA3.1-ZIC1) eller Cy5 (pCDNA3.1). Endelig blev mærkede prøver hybridiseret til Agilent hele humane genom indeholder 41.000 sonder og udskrifter. Dobbelte forsøg blev udført. Vi valgte log

2 forholdet ≥1 eller ≤-1 som tærsklen for opregulering eller nedregulering af genekspression.

Den kandidat ZIC1 målgener blev klassificeret i forskellige undergrupper efter deres biologiske funktioner (celleproliferation, migration, og angiogenese, etc.). Ti repræsentanter for målgener:

ANGPT2

,

CCNA2

,

GADD45B

,

IGFBP3

,

LAMB2

,

LAMB3

,

MALAT1

,

PNMA2

,

RPA4

TACSTD2

blev kontrolleret med QRT-PCR i ZIC1 eller kontrol vektor transfektanter i HCT116 og HT29-celler.

Statistisk analyse

Studerendes

t

og Wilcoxon matchede par tests blev udført for at sammenligne med to-uafhængige data, mens Chi-kvadratiske eller fisher præcise testmetoder til analyse kategoriske variable. En

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

tabel S1..

Fold ændring (FC) af udvalgte gener i ZIC1 transfecants blev opdaget af cDNA microarray og QRT-PCR. Fold ændring (FC): ZIC1 versus kontrol vektor

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016916.s001

(DOC)

tabel S2.

ekspressionsprofil repræsentativ gen associeret med transskription regulator og signaltransduktion i ZIC1 transfektanter sammenlignet med tom vektor kontrol (fold ændring) af cDNA microarray i HCT116-celler. Fold ændring:. ZIC1 versus kontrol vektor

doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s002

(DOC)

tabel S3.

Primer sekvenser anvendt til kvantitativ realtids-PCR.

doi: 10,1371 /journal.pone.0016916.s003

(DOC)

Tak

Vi takker Dr. Lei Guo for nyttige forslag; Dr. Yan Shan, Xiaotong Hu og Fubiao Zhang for fremragende teknisk bistand; og Dr. Manish Gala for kritisk gennemgang af manuskriptet.