Abstrakte
Simvastatin og lovastatin er statiner traditionelt anvendes til at sænke serum kolesterol niveauer. Men der findes beviser for deres potentielle kemoterapeutiske karakteristika i kræft. I denne undersøgelse, brugte vi bioinformatik analyse af offentligt tilgængelige data for at systematisk at identificere de gener, der er involveret i resistens mod cytotoksiske virkninger af disse to stoffer i NCI60 cellelinje panel. Vi brugte de farmakologiske data for alle NCI60 cellelinjer at klassificere simvastatin eller lovastatin resistente og følsomme cellelinier hhv. Dernæst udførte vi hel-genom enkelt markør case-kontrol forening tests for lovastatin og simvastatin resistente og følsomme celler ved hjælp af deres offentligt tilgængelige Affymetrix 125K SNP genomiske data. Resultaterne blev derefter evalueret under anvendelse af RNAi metodologi. Efter korrektion af
p-
værdier for multipel testning ved hjælp af Falsk Discovery Rate, vores resultater identificeret tre gener (
NRP1
,
COL13A1
,
MRPS31
) og seks gener (
EAF2
,
ANK2
,
AKAP7
,
STEAP2
,
LPIN2
,
PARVB
) associeret med resistens mod simvastatin og lovastatin, hhv. Funktionel validering ved hjælp af RNAi bekræftet, at lyddæmpning af
EAF2
udtryk moduleret svaret fra HCT-116 tyktarmscancerceller til begge statiner. Sammenfattende har vi med succes udnyttet de offentligt tilgængelige data om NCI60 cellelinjer til at udføre hel-genom associationsstudier for simvastatin og lovastatin. Vores resultater viste gener involveret i det cellulære respons på disse statiner og siRNA undersøgelser bekræftede rolle
EAF2
som reaktion på disse stoffer i HCT-116 tyktarmscancerceller
Henvisning:. Savas S , Azorsa DO, Jarjanazi H, Ibrahim-Zada I, Gonzales IM, Arora S, et al. (2011) NCI60 Cancer Cell Linie Panel Data og RNAi Analysis Hjælp Identificer EAF2 som modulator af Simvastatin og lovastatin respons i HCT-116 celler. PLoS ONE 6 (4): e18306. doi: 10,1371 /journal.pone.0018306
Redaktør: Eric Bernhard, National Cancer Institute, USA
Modtaget: Juli 27, 2010; Accepteret: 3 marts 2011; Udgivet: April 4, 2011
Copyright: © 2011 Savas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af TGEN institutionel forskningsmidler og en bevilling fra prostatakræft fundament (H. Ozcelik). Y.H. Choi er understøttet af et fællesskab fra den canadiske Breast Cancer Foundation – Ontario kapitel. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Simvastatin og lovastatin er to statiner traditionelt anvendes til sænkning af serumcholesterolniveauer. Statiner er reversible inhibitorer af den mikrosomale enzym HMG-CoA-reduktase, der omdanner HMG-CoA til mevalonat. Dette er en tidlig hastighedsbegrænsende trin i cholesterolbiosyntese. Hos mennesker hæmning af HMG-CoA-reduktase ved statiner nedsætter intracellulært cholesterolbiosyntese, som derefter fører til transkriptionelt opreguleret produktion af mikrosomal HMG-CoA reduktase og celleoverflade LDL-receptorer. Imidlertid simvastatin og lovastatin er forskellige i nogle vigtige aspekter vedrørende graden af metabolisme og antallet af aktive og inaktive metabolitter [1]. På det seneste har statiner fået betydelige varsel som anticancer midler baseret på præklinisk bevis for deres antiproliferative, proapoptotiske, anti-invasive og strålingssensibiliserende egenskaber [2], [3], [4], [5], [6]. Rolle statiner i kolesterol metabolisme kan forklare deres potentielle cytotoksiske egenskaber.
Kolesterol er en vigtig lipid, der ophobes i membran mikro-domæner kaldes lipidklumper. Lipidklumper spiller en vigtig rolle ved signaltransduktion, der udløser cellevækst, overlevelse og mange andre processer, der er korreleret med cancer. Kolesterol ophobning i tumorer er blevet demonstreret ved en række undersøgelser i fortiden [7], [8], [9], [10]. Akkumulering af cholesterol inden lipidklump mikro-domæner af plasmamembranen kan spille en rolle i stimuleringen af signaltransduktionsveje. Freeman og Solomon (2004) har foreslået, at stigningen i kolesterol i prostata tumor cellemembranen, hvilket kan skyldes en stigning i cirkulerende niveauer eller fra deregulering af endogen syntese, give anledning til sammensmeltning af raft domæner [7]. Dette vil til gengæld kunne have en virkning på adskillelse af positive regulatorer af onkogen signalering inden flåder, samtidig med at negative regulatorer i flydende mosaik membran fraktion [7]. Det blev endvidere foreslået, at studiet af funktionen af lipidklumper i prostatacancerceller kan give indsigt i den rolle af cirkulerende kolesterol i malign vækst og på den potentielle sammenhæng mellem kost og aggressiv sygdom. Derfor kan karakterisering af proteiner i kolesterol-rige mikro domæner tjene til bedre klarlægge signalveje, som vil føre til identifikation af nye biomarkører for sygdomsprogression og nye mål for kræftbehandling.
Variabel respons på lægemiddelbehandling , såsom resistens, er et alvorligt sundhedsproblem. Flere faktorer, såsom alder og kost, er impliceret i kemoterapeutisk modstand ved at påvirke lægemidlet adsorption, transport, metabolisme, og deres fysiologiske virkninger. Genetiske faktorer er også involveret i resistens. For eksempel er genetiske variationer, der forårsager forstyrrelser i gen funktion og ekspression impliceret i resistens [11], [12]. Derfor, for en optimal behandling effektivitet, har vi brug for at vide, de gener, der er forbundet med resistens samt deres profiler i hver patient (skræddersyet medicin). I denne forbindelse har NCI60 cellelinien panel danner et lovende redskab til at opdage nye kræftlægemidler. Den NCI60 cellelinie panel er nedsat fra en lang række tumorer, for at identificere de forbindelser, der kan dræbe kræftceller [13]. Hidtil har denne cellelinie panel været udsat for over 100.000 forskellige forbindelser og de cellulære responser i form af vækstrater er målt. Brug af NCI60 cellelinjer, blev L-asparaginase identificeret som effektivt dræber en delmængde af ovariecarcinomer [14]. Dette panel blev også brugt i udviklingen af bortezomib til behandling af myelom [13].
De eksperimentelle resultater opnået på NCI60 cellelinjer opgøres på hjemmesiden Developmental Therapeutics Program (DTP) [13]. Foruden farmakologiske data nævnt ovenfor, andre data for NCI60 cellelinier fås til DTP hjemmeside, såsom genotyperne af Affymetrix 125K chip single nucleotide (SNP’er). Affymetrix 125K SNP-chip platform har en tæt sæt af SNP’er (~124,000) og anvendes til at identificere de genomiske regioner, der er associeret med sygdom disposition og variabel behandlingsrespons. Tidligere har vi brugt NCI60 celle line data til at undersøge lægemiddelresistente gener i humane genom [15], [16], [17]. I denne undersøgelse, tog vi fordel af både de tilgængelige farmakologiske og genomiske data om NCI60 cellelinjer at identificere de gener, der er forbundet med cytotoksisk resistens over for simvastatin og lovastatin og udførte funktionelle undersøgelser ved hjælp af siRNA at validere
EAF2
som en modulator af statin-aktivitet.
Materialer og metoder
lovastatin og simvastatin resistente og følsomme NCI60 cellelinier
Vi har fulgt en tidligere udviklet metode til at udføre hele-genomet case-control forening undersøgelse [15], [16], [17]. Kort fortalt har vi udnyttet de offentligt tilgængelige data på NCI60 cellelinje panel bogført på hjemmesiden Developmental Therapeutics Program (DTP) af NCI /NIH (https://dtp.nci.nih.gov/index.html). Først, vi hentede GI
50 data (størrelsen af de lægemidler, der kræves for at hæmme væksten med 50%) på 10
-4,5 M dosis for cellelinjer. Dernæst vi kategoriseret cellerne som relativt resistent eller følsom efter normalisere loggen
10 af GI
50 for at opnå en middelværdi på nul og standardafvigelse af en som tidligere beskrevet [15], [16], [17] . Den standardiserede GI
50 værdier blev derefter analyseret af SAS 9.1 (PROC univariate) med en ikke-parametrisk fordeling test (densitet kerne estimering) med estimerede båndbredder på 0,2476 og 0,2896 samt asymptotisk middelværdi integrerede kvadrerede fejl (AMISE) af 0,0224 og 0,0172, for simvastatin og lovastatin, hhv. De visuelle antimodes blev anvendt som en cut-off værdi på -0.2 for simvastatin og -0,3 for lovastatin at definere følsomme (kontroller) og resistente (cases) NCI60 celler (figur 1). I tilfælde af simvastatin, var der 19 følsomme og 32 resistente cellelinjer i panelet (tabel S1). Der var 16 følsomme og 41 resistente cellelinier i NCI60 panel til lovastatin (tabel S2).
tæthedsfunktionen viste to store tilstande for hvert lægemiddel. De visuelle antimodes blev brugt som en cut-off værdi på -0,2 for simvastatin og -0,3 for lovastatin at definere følsomme og resistente NCI60 cellelinier.
Hele-Genome Case-Control Association Study
Vi hentede de Affymetrix 125K SNP data (der havde ca. 124.000 SNPs afstand med en median intermarkør afstand på 8,5 kilobaser) fra DTP hjemmeside (https://dtp.nci.nih.gov/mtargets/download.html) [ ,,,0],18]. Whole-genom enkelt markør case-kontrol association test til lovastatin og simvastatin resistente og sensitive celler blev udført ved Plink software [19] under anvendelse af standard chi i anden test. Kun de SNPs, der er blevet genotypebestemt i mindst 75% af cellerne og havde en minimal mindre allel frekvens på 2% (n = 79.622) blev indbefattet i denne undersøgelse og blev anvendt til foreningen testning. For at mindske risikoen for falsk-positive associationer, en korrektion for multiple test,
dvs.
. False Discovery Rate (FDR) foreslået af Benjamini og Hochberg (FDR_BH) [20] blev også udført af Plink software. Resultater med
p
værdier. 0,05 blev betragtet signifikant
Oplysninger vedrørende genomiske placeringer (fremkaldende
versus
intergeniske) af SNPs blev enten hentet fra dbSNP databasen [21 ] eller ved sprængning af SNP-flankerende sekvenser mod det humane genom og ved at visualisere ved hjælp af NCBI Kort Viewer option [22].
epistasis (SNP-SNP Interaction) Analyse
Logistik regressionsmodeller var anvendes til at analysere to-vejs interaktioner blandt de SNPs forbundet individuelt med simvastatin eller lovastatin modstand, under forudsætning af et tilsætningsstof model for hver SNP. For at teste SNP-SNP interaktioner, brugte vi sandsynligheden kvotientkriteriet tilgang ved at sammenligne fit af to modeller, en med de SNP vigtigste kun effekter og den anden med de vigtigste effekter og to-vejs interaktion effekt. De tilsvarende p-værdier blev justeret for multipel testning af FDR_BH [20] metode.
Cell Culture
De humane tyktarmskræft cellelinjer HCT-116 og HT-29 blev opnået fra den amerikanske Type Culture Collection (Manassas, VA). HCT-116 er en tumorigen colorektal carcinom-cellelinie etableret ud fra en primær tumor [23]. HT-29 er et kolon adenocarcinom grad II-cellelinie etableret fra primære tumorceller [24]. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IE /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. Alle medier reagenser blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA). De cellelinier blev rutinemæssigt holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO
2 atmosfære.
Funktionel validering for lovastatin og simvastatin sensibilisering
I siRNA og narkotika undersøgelser, celler blev transficeret med siRNA ved omvendt transfektion i 384-brønds plader som beskrevet tidligere [25]. Kort fortalt blev siRNA trykt på 384-brønds plader i 2 pi volumen. Fortyndet siLentFect reagens (BioRad, Hercules, CA) i OptiMEM (Invitrogen) blev tilsat til brøndene og fik lov at danne kompleks med siRNA i 30 minutter ved stuetemperatur. HCT-116 eller HT-29-celler blev resuspenderet i vækstmedier uden antibiotika og tilsat til pladerne til en slutkoncentration på 1000 celler /brønd. Plader blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO
2. Efter 24 timer, varierende koncentrationer i området fra 12 nM til 667 uM af enten lovastatin eller simvastatin blev tilsat til assayplader og inkuberet i yderligere 72 timer. Samlede antal levedygtige celler blev bestemt ved tilsætning af Cell Titer Glo (Promega, Madison, WI) og relative luminescensenheder (RLU) blev målt under anvendelse af en EnVision pladelæser (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Lægemiddelvirkning blev beregnet ved at dividere gennemsnittet af RLU værdier for de lægemiddelbehandlede brønde med gennemsnittet af de RLU-værdier for bærerbehandlede brønde. GI
50 værdier blev bestemt ved hjælp af GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA) og værdier blev vist som beregnet GI
50 +/- 95% konfidensinterval. Statistisk analyse af dataene blev udført under anvendelse af tohalede parrede Students
t
test.
P
. 0,05 blev betragtet som signifikant
Validering af Gene silencing af kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Total RNA fra cellelinier blev isoleret ved hjælp af Qiagen s RNeasy kit fra Qiagen Inc. (Valencia, CA). RNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse NanoDrop-1000 i henhold til producentens anbefalinger. iScript cDNA Synthesis Kit fra Bio-Rad Inc. (Hercules, CA) blev anvendt til fremstilling cDNA fra 500 ng af hver prøve. Relativ mRNA-ekspression blev målt ved anvendelse TaqMan Gene Expression Assays fra ABI Inc. (Foster City, CA) under producentens anbefalede betingelser på Opticon 2 PCR System (Bio-Rad Inc., Hercules, CA). Relativ kvantificering af genekspression blev udført tredobbelt. qPCR reaktioner blev fremstillet i 96-brønds formaterede qPCR plader fra Bio-Rad (Hercules, CA). Reaktionerne blev fremstillet i singleplexes, triplikater af hver prøve med triplikater af endogene kontroller og ikke-template kontroller (NTC). Normalisering blev udført i nærvær af en reference-gen, GAPDH, og den relative kvantificering af genekspressionen ændringer blev analyseret ved anvendelse af ΔΔCt metoden [26], [27].
Resultater Salg
Genom brede foreninger undersøgelser af NCI60 panelet for lovastatin og simvastatin respons
Brug af NCI60 kræft-screening data for simvastatin og lovastatin, cellelinjer blev kategoriseret som relativt følsom eller resistent (figur 1). De er fremstillet af de hel-genom case-control associationsstudier for simvastatin og lovastatin er opsummeret i tabel 1 og 2, hhv. Otte SNP’er var forbundet med resistens over for simvastatin. Disse SNP’er blev placeret på kromosomer 8q, 9P (to SNP’er), 10p, 10Q, 13q (to SNP’er) og 14P. Fem af SNPs var placeret i intergeniske regioner, mens de resterende tre SNPs var placeret i introns af kendte gener (tabel 3), nemlig, intron 6 af
NRP1
(neurophilinligander), intron 37 af
COL13A1
(type XIII collagen, alfa 1), og intron 6 af
MRPS31
(mitokondrie ribosomale protein S31). To intergeniske SNPs, rs4129864 og rs1343844 var placeret meget tæt (7387 basepar væk fra hinanden), hvilket tyder på at de var tilbøjelige til at være forbundet med hinanden. Vejviser
I tilfælde af lovastatin, blev i alt 25 SNPs forbundet med dets modstand. Seks af disse SNPs var placeret i kendte eller forventede gener (Tabel 2 og 3): i intron 5 i
EAF2
(ELL associeret faktor 2), i intron 2 af
ANK2
(neurale ankyrin 2), i intron 1 af
AKAP7
(proteinkinase A anker protein 7), i intron 4 af
LPIN2
(Lipin 2), i intron 2 af
STEAP2
(seks transmembrane epitelialantigenet af prostata 2), i intron 11 i
PARVB
(Parvin beta).
Vi studerede yderligere en mulig SNP-SNP interaktion for simvastatin og lovastatin modstand SNP sæt med logistisk regressionsanalyse og ikke registrerer nogen statistisk signifikant genetisk interaktion antager additive genetiske model efter FDR_BH justeringer. Men i betragtning af den lille stikprøvestørrelse, skal det også bemærkes, at vores undersøgelse ikke havde tilstrækkelig magt, derfor skal disse resultater fortolkes med forsigtighed. Pathway analyse identificerede ikke direkte interaktioner mellem de proteinprodukter af generne i simvastatin eller lovastatin lister.
Funktionelle studier identificerer EAF2 som modulator af lovastatin og simvastatin
For at teste gyldigheden af de positive GWAS resultater, udførte vi funktionelle undersøgelser. Vi fokuserede på de SNPs beliggende i (intronregioner af) gener involveret i simvastatin (3 SNP’er) og lovastatin (6 SNPs) modstand (tabel 1 og 2). En omfattende litteratursøgning afslørede ikke kendte funktionelle konsekvenser af disse SNP’er på genekspression eller proteinfunktion. Således de direkte biologiske forhold mellem disse SNPs og resistens over for simvastatin og lovastatin forblev ukendt. da vores GWAS resultaterne har indikeret en sammenslutning af disse gener med resistens over for simvastatin eller lovastatin, vi hypotese dog, at funktionerne af disse gener eller anden måde var forbundet med resistens. Under denne hypotese, nedregulering af genekspressionen reverserer den observerede resistens og gør disse celler følsomme over for disse stoffer igen, hvilket resulterer i forøget cellulær toksicitet og død (figur 2). Derfor udførte vi lægemiddelrespons og gendæmpning hjælp RNAi metodologi undersøgelser af to colon cancercellelinier HCT-116 og HT-29, som blev udvalgt, da de blev medtaget i NCI60 indstillet samt for deres gode transfektionseffektivitet og deres reaktion på de to statiner. Baseret på DTP lægemiddelrespons data, vores analyse klassificeret HCT-116 som relativt resistent over for simvastatin (tabel S1); dog lovastatin data var ikke tilgængelige for denne cellelinie. På den anden side blev HT-29 syntes at være relativt resistente over for både simvastatin og lovastatin (tabel S1 og S2). Indledningsvis blev begge cellelinier behandlet med siRNA targeting generne identificeret i vores analyse efterfulgt af behandling med to lave doser af enten simvastatin eller lovastatin, som angivet fire af generne,
MRPS31
,
COL13A
,
EAF2
,
AKAP7
som potentielle modulatorer af narkotika respons (data ikke vist).
Ingen biologiske forhold mellem lægemiddelresistens og de gener /SNPs identificeret i GWAS undersøgelsen blev tidligere identificeret. Derfor heri vi hypotesen, at hvis funktionerne af disse gener er nødvendige for resistens over for disse lægemidler, da banke-down deres genekspression ved anvendelse siRNA’er vil forstyrre funktionen af de gener, som vil vende modstanden og gøre cellerne følsomme over for disse lægemidler igen. (A) tumorcellelinje er resistent ved udsættelse for lægemidlet. (B) Ved behandling med siRNA til kandidat genmål udover medikament, vi forudsige, at tumorcellelinje ville blive sensibiliseret over for lægemidlet fører til øget celledød. Denne model er baseret på den hypotese, at den specifikt gen funktion er nødvendig for resistens.
Yderligere narkotika dosis-respons undersøgelser blev udført ved hjælp af siRNA-duplexer målretning
MRPS31
COL13A
, der var forbundet med resistens over for simvastatin, og
EAF2
AKAP7
, der var forbundet med resistens over for lovastatin. Disse gener blev bragt til tavshed af siRNA og behandlet med varierende doser af enten simvastatin eller lovastatin mellem 12 nM til 667 uM. Silencing af
MRPS31
,
AKAP7
og
COL13A
påvirkede ikke svar på enten narkotika under de eksperimentelle betingelser anvendes (data ikke vist), mens tavshed af
EAF2
reducerede signifikant GI
50 af simvastatin og lovastatin-behandlede HCT-116-celler, og således reduceret modstanden af denne cellelinie til disse lægemidler (figur 3). For HCT-116 celler behandlet med simvastatin og siRNA, GI
50 (med 95% konfidensgrænser) skiftede fra 8,6 +/- 0,3 pM for ikke-silencing siRNA (negativ kontrol) til 2,5 +/- 0,2 uM og 3.3 +/- 0,3 pM for EAF2_1 og EAF2_4 siRNA hhv. Tilsvarende for HCT-116 celler behandlet med lovastatin GI
50 flyttet fra 20,1 +/- 0,9 pM for ikke-silencing siRNA til 4,3 +/- 0,5 uM og 6,5 +/- 0,5 pM for EAF2_1 og EAF2_4 siRNA, henholdsvis . Endvidere blev effektiv siRNA transfektion påvist i begge cellelinier siden kontrol dødbringende siRNA reduceret levedygtighed ved mere end 98% i alle assays (Figur S1). Men silencing af
EAF2
ikke sensibilisere HT-29 celler til enten simvastatin eller lovastatin (figur 1). Disse resultater antyder, at nedregulering af
EAF2
ekspression kan modulere cellulære respons på både kolesterolsænkende medicin i HCT-116 colon cancerceller
HCT-116-celler (A . C ) og HT-29 celler (B D) blev transficeret med siRNA rettet mod
EAF2
ved omvendt transfektion. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med varierende doser af enten simvastatin (A B) eller lovastatin (C 0,0002
for både EAF2_1 og EAF2_4 siRNAs vist ved *) ved doser 2,7 uM og 8,2 uM.
effekten af gendæmpning af siRNA’er EAF2_1 og EAF2_4 blev bekræftet under anvendelse af qPCR eksperimenter og er vist i figur 4A. Selvom HCT-116 celler viste sensibilisering til kombinationen af
EAF2
lyddæmpning og statin behandling, mens HT-29 celler ikke gjorde det, viste begge cellelinier lignende niveauer af ekspression af
EAF2
demonstrerer, at forskellen i reaktion ikke skyldtes forskelle i basalt
EAF2
ekspression (figur 4B). Desuden siRNA lyddæmpning af
EAF2
i begge cellelinjer havde minimal effekt på cellelevedygtighed sammenlignet med ubehandlede kontroller og ikke-silencing siRNA kontrol (figur 5). Tilsammen disse data, og skiftet i dosisresponskurverne produceret af
EAF2
nedregulering i HCT-116 celler indikerer, at lukke munden på
EAF2
potenserer effekten af statin-induceret cytotoksicitet.
(A) Samlet RNA blev isoleret fra HCT-116 celler transficeret i 48 timer med siRNA rettet mod
EAF2
(EAF2_1 og EAF2_4), ikke-silencing siRNA eller ubehandlede celler. Relativ fold forskelle i
EAF2
mRNA-niveauer i forhold til ubehandlede og ikke-silencing siRNA behandlede celler vises. (B) qPCR relative ekspression analyse af EAF2 i HCT-116 og HT-29-celler viser tilsvarende udtryk.
HCT-116-celler og HT-29-celler (1000 celler /brønd) blev revers transficeret med kontrol siRNA og
EAF2
målrettet siRNA. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved 96 timer ved hjælp af Cell Titer Glo og læse for luminescens. Data repræsenteret som procent levedygtighed sammenlignet med ikke siRNA behandlede celler.
Diskussion
Vores undersøgelse viser den første systematiske og hel-genom forening undersøgelse for simvastatin og lovastatin, to statiner, som er lovende kandidater som cytotoksiske lægemidler i kræft. I denne undersøgelse fandt vi fordel af de frit tilgængelige og omfattende farmakologiske og genetiske data på NCI60 cellelinie panel til at identificere kandidatgener, der er forbundet med resistens mod simvastatin og lovastatin i det humane genom. Vores resultater viste associering af forskellige sæt af gener med resistens over for disse to lægemidler. Vi længere funktionelt valideret en target-gen,
EAF2
, hjælp siRNAs at vise, at dets udtryk kan modulere cellulære svar på disse to lægemidler i HCT-116 cellelinje.
En hel-genom SNP -baseret forening undersøgelse identificeret tre gener, der er forbundet med simvastatin modstand (tabel 3). Et af disse gener,
NRP1
koder for en membranbundet receptor, der har roller i angiogenese, axon vejledning, celleoverlevelse, migration, invasion og immunrespons. NRP1 bindes også til SEMA3, hvis aktivitet moduleres af lipidklumper [28]. Et andet gen associeret med simvastatin modstand var
COL13A1
, som koder for a-kæden af et ikke-fibrillært collagen placeret i plasmamembranen. Selv om dens præcise biologiske rolle ikke er blevet karakteriseret endnu, er COL13A1 protein ligger i selvklæbende strukturer af væv og menes at være involveret i celleadhæsion, migration og knogleudvikling [29]. Endelig
MRPS31
koder for et mitokondrie ribosomalt protein, der er involveret i proteinsyntese i mitochondrierne og er forbundet med type I-diabetes [30].
For lovastatin modstand, vores analyse viste associering af seks gener (tabel 3). Et af disse gener var
EAF2
, som er en androgen-respons gen associeret med transkriptionelle elongeringsfaktor MEN /ELL og det er nødvendigt for en række cellulære funktioner, såsom øjet udvikling og vækst undertrykkelse og apoptoseinduktion [31], [32]. For nylig
Eaf2
knockout i en musemodel var forbundet med neoplasi af lunge, lever og prostata samt B-celle lymfom [33]. Interessant, vores resultater viser tydeligt, at silencing af
EAF2
formindsker GI
50 værdier af HCT-116 colon cancerceller til ikke kun lovastatin, men også simvastatin. Denne effekt sås ikke i den anden coloncancercellelinie HT-29, og dette kan skyldes den genetiske heterogenitet mellem de to cellelinier. En anden gen forbundet med lovastatin modstand var
ANK2,
som koder for en af de tre ankyrins der er involveret i lokalisering af proteiner på membranen.
ANK2
er afgørende for normal hjertefunktion og dens mutationer er en af årsagerne til medfødte arytmi [34].
AKAP7
koder for et medlem af A-kinase forankring protein (AKAP) familie, der forankrer cAMP-afhængige protein kinase A til specifikke subcellulære rum [35]. På den anden side,
LPIN2
er en af de tre Lipin gener. Lpin 1 er involveret i fedtvæv udvikling [36]. Selv om den nøjagtige biologiske rolle af dette gen ikke er kendt, når muteret, dette gen forårsager Majeed syndrom, en autoinflammatorisk lidelse [37]. Desuden
STEAP2
, som koder for en multi-pass membranprotein, der lokaliserer til Golgi komplekset, plasmamembranen, og de vesikulære rørformede strukturer i cytosolen, var også forbundet med resistens over for lovastatin i vores undersøgelse. For nylig en kobberforbindelser reduktase og ferrireductase rolle for STEAP2 protein blev rapporteret [38]. Dette gen er også impliceret i prostatacancer [39]. Endelig
PARVB
, et medlem af en fokal adhæsion proteinfamilie [40], som binder til integrin-linked kinase [41] blev også fundet forbundet med lovastatin modstand. Det er interessant at bemærke, at de to lister af gener var meget forskellige mellem de to statiner, som begge er HMG-CoA reduktasehæmmere. Men de to lægemidler ikke er identiske og adskiller sig i deres metabolitter [42] og deres cytotoksiske virkninger [43], [44], der kan forklare disse resultater. Den cytotoksiske virkning medieret af statiner kunne involvere andre end HMG-CoA-reduktase-mål såsom knoglemorfogenetisk protein (BMP) pathway som beskrevet af Kodach og kolleger [43].
Vi udførte gendæmpning og lægemiddelrespons eksperimenter at teste validiteten af vores GWAS resultater. I tilfælde af tre gener,
MRPS31
,
COL13A
, og
AKAP7,
vores resultater ikke bekræfte, at deres biologiske funktioner er direkte relateret til resistens over for simvastatin og lovastatin under vores hypotese og de eksperimentelle anvendte betingelser. Denne uoverensstemmelse mellem GWAS og funktionelle studier kan forklares ved den mulighed, at disse gener kan repræsentere falsk positive resultater af GWAS analysen, eller de betingelser og hypotesen anvendte var ikke optimal til at registrere de forventede effekter. Alternativt kan disse SNP’er være placeret i et genomisk region, der påvirker funktionen af fjerne gener, som ikke kan testes ved hjælp af vores fremgangsmåde. På den anden side, vores genom bred forening angivet sammenslutningen af
EAF2
markør 1.840.275 (rs2332056, rs4339143) med resistens over for kun lovastatin efter korrektion med FDR. I tilfælde af simvastatin, var dette markør associeret med dens modstand (ukorrigeret
s Restaurant 0,01), men efter korrektion for multiple test, denne signifikans blev tabt. Alligevel viste vores funktionel vurdering under anvendelse siRNA at lukke munden på
EAF2
var ikke kun i stand til at modulere respons på lovastatin men også til simvastatin i HCT-116 coloncancercellelinie under de eksperimentelle betingelser anvendt (figur 3). Denne uoverensstemmelse mellem resultaterne af genom bred forening undersøgelse og funktionelle eksperimenter vurdering kan forklares enten ved en falsk-negative sammenslutning af
EAF2
markør i simvastatin sæt, eller ved anvendelse af forskellige eksperimentelle betingelser (f.eks narkotika dosering) i vores siRNA eksperimenter. Derudover vores resultater viste også, at
EAF2
silencing ikke sensibiliserer anden coloncancercellelinie, HT-29 (hvilket blev anset relativt resistent over for både simvastatin og lovastatin), hvilket antyder tilstedeværelsen af en eventuel heterogenitet i genetisk og molekylære mekanismer involveret i resistens over for statiner. Interessant er HCT-116 vides at bære en
K-RAS
mutation mens HT-29 ikke [45]. Da statiner er inhibitorer af HMG-CoA-reduktase, der kan føre til blokering farneslyation af K-RAS og dermed K-RAS-aktivering, er det muligt at gennemføre en mutant
K-RAS
kan bidrage til at gøre HCT-116 celler mere modtagelige for kombinationen af
EAF2
lyddæmpning og statin behandling. vil være behov for yderligere undersøgelser for at løse denne mulighed.
Vores klassificering af både HT-29 og HCT-116 er relativt resistent er baseret på sammenligningen til alle cellelinjer i NCI60 panelet. Tidligere undersøgelser af reaktion på simvastatin og lovastatin af flere af de NCI60 cellelinier er blevet rapporteret. HL-60-leukæmi cellelinje blev tidligere fundet at være relativt resistent over for simvastatin behandling (på en dosis-afhængig måde) end dens alle-trans-retinsyre resistent derivat-cellelinje, HL-60-R2 [46]. Derudover Martirosyan
et. al.
viste, at den ovariecancer cellelinie, SKOV-3, når de behandles med Lovastatin viste et respons, men ikke så meget som andre cellelinjer medtages i deres studier, hvilket antyder, at denne cellelinie er ikke meget følsomme over for lovastatin behandling under de anvendte betingelser [47], hvilket er i overensstemmelse med vores resultater. Endelig Kodach
et.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.