PLoS ONE: Den rolle Dlc1 Isoform 2 i K-Ras2G12D induceret tymisk Cancer

Abstrakt

Slettet i leverkræft én (Dlc1) tumorsuppressorgen koder en RhoGTPase aktiverende protein (RhoGAP). Den Dlc1 genet har flere transkriptionelle isoformer og vi har tidligere etableret en musestamme indeholdende et gen fælde (gt) insertion, som specifikt reducerer ekspressionen af ​​6,1 kb-isoformen (isoform 2). Dette gen fanget allel når homozygote resulterer i embryonisk dødelighed og de heterozygote gen fanget mus ikke udviser en forøget forekomst af kræft, hvilket antyder, at samvirkende oncogene ændringer kan være nødvendig for transformation. I nærværende arbejde har vi studeret

in vivo

samarbejde mellem onkogene K-Ras2 og Dlc1 gener hos tumorudvikling. Vi har observeret en stigning i invasive thymus kræftformer, herunder både thymomer og lymfomer, hvilket resulterer i væsentligt forkortet liv spænder i mus heterozygote for gt Dlc1 allel og en inducerbar LSL-K-Ras2

G12D allel forhold til LSL-K- Ras2

G12D kun mus. Den heterozygote mus viste en høj grad af metastase i lungen. Vi har fundet tumorspecifik selektiv hypermethylering af Dlc1 isoform 2-promotoren og reduktion af det tilsvarende protein ekspression i thymus lymfom (TL) og thymus epitelcarcinoma (TEC) afledt af de thymiske tumorer. De Dlc1 mangelfulde thymiske lymfom cellelinjer udviste forøget trans-endothelcellemigration. TEC cellelinjer udviste også forøget dannelse stress fiber og Rho-aktivitet. Indførelse af de tre Dlc1 isoformer mærket med GFP ind i disse celler resulterede i forskellige morfologiske ændringer. Disse resultater tyder på, at tab af ekspressionen af ​​kun isoform 2 kan være tilstrækkeligt til at udvikle thymiske tumorer og metastaser

Henvisning:. Sabbir MG, Prieditis H, Ravinsky E, Mowat MRA (2012) rolle Dlc1 Isoform 2 i K-Ras2

G12D induceret tymisk Cancer. PLoS ONE 7 (7): e40302. doi: 10,1371 /journal.pone.0040302

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 8. december 2011; Accepteret: 7 jun 2012; Udgivet: Juli 5, 2012 |

Copyright: © 2012 Sabbir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet med tilskud fra Cancer Research Society Inc. (https://www.src-crs.ca/en-CA) og CancerCare Manitoba Foundation Inc. (https://www.cancercarefdn.mb.ca). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Slettet i leverkræft en (Dlc1) tumorsuppressorgen koder en Rho GTPase aktiverende protein (RhoGAP), der øger den iboende hydrolyse af GTP bundet Rho til den inaktive BNP bundet form af Rho. Den Dlc1 genet er blevet fundet hyppigt slettet eller, nedreguleret ved promotor-hypermethylering i bryst, lunge, lever, colon og prostatatumorer [1] – [6]. En nylig undersøgelse ved hjælp af repræsentative oligonukleotid microarray analyse har vist heterozygot sletning af Dlc1 locus i -50% af lever, bryst og lunge tumorer og 70% af tyktarmskræft [7].

In vitro

undersøgelser har vist, at transfektion af Dlc1 genet kan hæmme cellevækst [5], [7], afskaffe

in vivo

tumordannelse [2], og inducere apoptose. For nylig, eksperimenter med

ex vivo

knockdown af Dlc1 i p53 null og Myc induceret lever stamceller har vist reduceret overlevelse efter injektion i mus [7].

Dlc1 genet har mindst tre store transskriptionelle isoformer udtrykt under indflydelse af tre alternative promotorer i musen [8]. Vi har tidligere etableret en musestamme indeholdende et gen fælde insertion, som specifikt reducerer ekspressionen af ​​6,1 kb transkriptionelle isoform (isoform 2) af Dlc1 og således skabe en hypomorph [8]. Homozygot Dlc-1-genet fanget mus viser en embryo letal fænotype [8], som fænokopier den Dlc1 exon 5 knockout mus af Durkin et al. [6]. De heterozygote knockout og gen fanget mus er levedygtige og viser ikke nogen stigning i spontane tumorer [6], [8]. Dette indikerer, at yderligere oncogene begivenheder udover Dlc1 deletion er nødvendige for transformation

Det er blevet vist, at aktivering af Ras i visse situationer signalvej anholdelser cellecyklus inducerende senescens snarere end at forårsage celleproliferation [9] -. [12 ] gennem induktion af p21

WAF1 [13], [14]. Det er også blevet vist, at i Ras aktiverede celler, et krav om Rho signalering er til undertrykkelse af p21

WAF1 [15]. Igen i Ras transformerede fibroblaster, den vedvarende ERK-MAP-kinase signalering begunstiger udvælgelsen af ​​høje niveauer af aktiv Rho-GTP at muliggøre nedregulere de høje niveauer af p21

WAF1 [16]. Derfor er det en hypotese, at aktivering af Rho vej gennem tab af Dlc1 RhoGAP udtryk vil supplere de Ras onkogen i celle transformation

in vivo

. Det vides heller ikke, som Dlc1 isoform er kritisk for tumor suppression. I denne undersøgelse, rapporterer vi høj forekomst af metastatisk thymus kræft hos heterozygote Dlc1 isoform 2-genet fanget mus med et onkogent K-Ras2

G12D allel. Vi finder også selektiv hypermethylering af Dlc1 isoform 2 promotor i disse tumorer.

Resultater

høj forekomst af tymisk Kræft i Dlc1

vægt /gtLSL-K-Ras2

vægt /G12D mus inficeret med AdCMV-cre

for at teste, om Dlc1 tab ville samarbejde med K-Ras2 gen i transformation, vi gjort brug af LSL-K-Ras2

G12D transgene mus [17]. For at aktivere onkogene K-Ras2

G12D allel, Dlc1

vægt /gt; K-Ras2

vægt /G12D (KD) og Dlc1

v /v; K-Ras2

vægt /G12D (K

+) mus blev injiceret med Cre-udtrykkende AdCMV-Cre-adenovirus via halevenen. De fleste af musene udviklede primære thymiske tumorer inden 6 til 9 måneder med 52,6% (10/19) af K

+ mus versus 69,5% (16/23) af de KD mus har tumorer (figur 1A B , tabel 1). Musene blev normalt aflivet for alvorlig vejrtrækning problemer på grund af kompression af brysthulen af ​​de voksende thymus tumorer (Figur 1C). Ved obduktionen, nogle af disse mus viste også neoplastiske læsioner i andre organer, herunder nyre, lever, lunge, testikel og ovarie, men de fleste mus viste thymiske tumorer (figur 1A, tabel 1). Størstedelen af ​​lungetumorer blev metastatiske thymiske lymfomceller i oprindelse (figur 2E, tabel 2). For at bestemme den samlede overlevelse, blev Kaplan-Meier-analyse af AdCMV-Cre injicerede mus udført. Dette afslørede signifikant lavere overlevelse i de heterozygote KD gen fanget mus sammenlignet med K

+ mus (P-værdi = 0,0077, figur 3A).

(A) Hyppigheden af ​​forskellige primære tumortyper. (B) Relativ hyppighed af de forskellige typer af primær thymus kræft (C) Billede af forstørret thymus (pil) i mus og et dissekeret brissel med lymfom. Vejviser

For at forstå arten af ​​de thymiske cancere, udførte vi immunhistokemi under anvendelse af en T-cellespecifik markør CD3 og thymiske epitheliale cellespecifikke markører, cytokeratin 5 (CK5) og cytokeratin 8 (Ck8 /Troma) [18]. I den normale unge mus (6 uger gamle) T-lymfocytterne blev fundet jævnt fordelt i både cortex og medulla regioner i thymus, hvorimod de medullære epitelceller var stærkt CK5 og corticale epitelceller var stærkt Ck8 positive (figur 2A). Men i de voksne mus T-lymfocytterne blev overvejende forskudt mod den centrale medulla regionen og de kortikale epitelceller var stærkt Ck8 positive med isolerede pletter af CK5 positive celler (figur 2B). Ved hjælp af disse markører, vi har fundet et betydeligt højere antal thymiske lymfomer 80% (8/10) i K

+ mus versus 68,7% (11/16) i KD mus (figur 1B 2D, tabel 3) . En mindre fraktion (20% (2/10)) var overvejende thymus epiteliale carcinomer (thymomer) i K

+ mus versus 31,2% (5/16) i de heterozygote KD mus (figur 1B 2C), som pr den histologiske klassificering af Bernatz et al. [19]. Hyppigheden af ​​thymomer mellem K + og KD mus var ikke statistisk signifikant. Vi har fundet kun en tumor i et KD mus, som viste en blandet tymom type, som kan have både T-celle lymfom og thymom.

Normalt mus thymus ved 6 uger (A) og 18 uger (B) viser ekspression af T-celle-markør (CD3) og forskellige cytokeratin markører specifikke for thymiske medullær epithelceller (CK5) og corticale epithelceller (Ck8). Immunhistokemi viser thymus epitel karcinom (C), T-celle lymfom (D) og lunge metastase af T-celle lymfekræft (F).

Primær tymisk Tumorer Ofte metastaseret til Lung

Immunhistokemi viste også, at de fleste af de thymiske lymfomtumorer havde metastaseret til multipel foci i lungerne. Størstedelen af ​​lungemetastaserne var af T-celle lymfom i oprindelse (figur 2E, tabel 2). Kvantificering af lungen metastatiske læsioner af hver kohorte viser signifikant højere frekvens af metastaser i KD-mus sammenlignet med K

+ mus (figur 3B).

(A) Kumulativ overlevelse heterozygot LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

vægt /gt og LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

vægt /vægt mus efter Cre udtrykker adenovirus injektion via halevenen. Overlevelsestiden blev defineret som tiden efter injektion til døden eller nedslagning, grundet nå humane slutpunkter. I alt 15 LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

vægt /vægt og 18 LSL-K-Ras2

G12D; Dlc1

wt /gt mus blev anvendt for overlevelse undersøgelse. De censurerede data var mus, som døde af ukendte årsager uden nogen påviselig tumor eller leukæmi. (B) Hyppigheden af ​​metastatiske lungetumorer. De firkantet grå prikker angiver metastatiske læsioner stammer fra mus, der var kilden til T Lymfom cellelinjer 1 og 2. P-værdi = 0,0257 (af Mann-Whitney U test).

Primary T-celle lymfekræft og Thymom cellelinier er mangelfuld i isoform 2 Dlc1 Protein og viste øget RhoA Aktivitet

Vi har etableret 4 thymus lymfom (TL) og 3 thymus epitelial karcinom (TEC) cellelinier (Figur 4A) fra primære tumorer til at studere ekspressionen af ​​Dlc1 protein. Disse tumorer var enten CD3 + T-celler eller CK 5 eller CK 8-positive epithelceller (Figur 2C 0,05, * * P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). E. Dlc1 proteinekspression fra 5 azaC behandlet TL og TEC-cellelinjer.

I vores tidligere undersøgelse har vi rapporteret eksistensen af ​​to forskellige molekylvægt isoformer af Dlc1 protein i forskellige mus væv og mus embryonale fibroblaster (MEF), som formodentlig stammer fra isoformerne 2 og 3 mRNA’er eller ved post-translationelle modifikationer [8]. Den regelmæssige 123 KDa Dlc1 protein (isoform 2) udtrykkes på et lavt niveau i den voksne thymus. Henviser, 127 KDa krydsreagerende protein udtrykkes på et højere niveau i thymus sammenlignet med leveren i western blots (figur 4D /i). Interessant nok viste Den thymiske og lymfomcellelinjer lavere ekspression af 123 kDa-proteinet båndet og den tilsvarende isoform 2-mRNA sammenlignet med normal thymus (figur 4C 3 og TEC 1 2 linjer viste lavere niveauer sammenlignet med de linjer fra K + mus (figur 4D). Der var også en signifikant stigning i 127 kDa-proteinet band i tumorerne sammenlignet med thymus (figur 4D). I vores tidligere undersøgelse såvel som i den foreliggende undersøgelse har vi bemærket, at proteinet ekspressionsniveauet af 127 kDa-protein stigninger i nærvær af reducerede niveauer af den 123 kDa-protein, som er særligt tydeligt i homozygot gen fanget muse embryonale fibroblastceller ( figur 4D). De fleste af de lymfom og TEC-celler viste også øget ekspression af 127 kDa-proteinet (figur 4D).

For at bestemme om de yderligere højmolekylære bånd er phosphorylerede former af Dlc1 proteinet, blev de cellulære lysater behandlet med alkalisk phosphatase. Den fortsatte tilstedeværelse af 127 kDa-båndet efter fosfatase behandling viser, at det ikke er en phosphoryleret form af regelmæssige 123 kDa Dlc1 protein (figur 4C /i E).

For at identificere 127 KDa kryds reagere protein, immunpræcipitater hjælp af Dlc1 antistoffer blev underkastet massespektrometri. Vi har været i stand til at identificere 7 peptider svarende til konsensus region Dlc1 fælles for alle isoformer og derfor massespektrometri var usikkert om eksistensen af ​​de andre Dlc1 isoformer (supplerende figur S1).

De fleste af lymfom og TEC cellelinier viste også høj ekspression af p21

WAF1 protein i modsætning til homozygote gen fanget muse embryo fibroblastceller hvor p21

WAF1 ekspression blev reduceret (figur 5A /i-II). Ekspressionsniveauet af p21-protein var sammenlignelig i MEF

+ /+ og TL4 og TEC3 cellelinjer, som har vildtype Dlc1 alleler imidlertid heterozygote genetrap Dlc1 allel indeholdende TL 2/3 cellelinier og den TEC1 /2 celle linjer udviste signifikant højere niveauer af p21-protein-ekspression sammenlignet med deres tilsvarende vildtype, TL4 og TEC-3 cellelinier hhv. I modsætning hertil heterozygote TL1 linje, med den laveste Dlc1 ekspression, viste p21-ekspression sammenlignes med vildtype MEF

+ /+ og TEC 4 celler. p21-ekspression er således ikke korrelerer med Dlc1 ekspression i thymiske cellelinier, i modsætning til i fibroblaster.

A (i) p21

WAF1 protein i T-celle lymfom og carcinoma cellelinier, (ii) plot, der viser relative intensitet af p21

WAF1 protein i T-celle lymfom og carcinoma cellelinier i forhold til actin. Middelværdier og standardfejl på middelværdien blev bestemt ud fra mindst fem uafhængige forsøg. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). (B) Måling af aktiv RhoGTP i cellelinier. (I) RhoGTP pull down assay viser konstitutive og LPA-inducerede niveauer af aktiv RhoGTP i T-celle lymfom og thymusepitelmonolag carcinoma cellelinier. (Ii) plot, der viser RhoGTP til total Rho protein-forhold ved at scanne den relative intensitet af de proteinbånd i ikke-behandlede og LPA induceret i TEC, TL, MEF cellelinier. Midler og standardafvigelse af middelværdi bestemt ud fra fire uafhængige forsøg. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 og **** P. 0,0001 ved Student t-test og tovejs ANOVA test

Alle tymom og . lymfomcellelinjer viste varierende grader af aktiveret RhoA når de behandles med lysophosphatidsyre (LPA) (figur 5B /i-ii) LPA induktion af aktiv RhoA var signifikant højere i to lymfom (TL-1 -2) og to TEC linjer (TEC-1 -2), som også viste de laveste Dlc 1 isoform 2 niveauer, når der sammenlignes med de tilsvarende vildtype-cellelinier (figur 5B /i-II) Dette svarede til homozygot Dlc1

gt /gt. celler, hvilket indikerer, at disse linjer kan have inaktiveret vildtype Dlc1 allel.

tumorer har aktiveret K-Ras2 G12D Mutation

for at bestemme, at tumorerne var på grund af aktivering af K-Ras2

G12D allel, vi ekstraheret cellulært RNA fra primære tumorer og tumorcellelinier og derefter udført pyrosekventering baseret mutation analyse for K-Ras2

G12D-mutation (figur 6). Alle de primære tumorer viste ekspression af den mutante K- Ras2 allel (figur 6F). Imidlertid er ekspressionen af ​​den mutante allel var mindre end 50% i de primære tumorer som afsløret ved den pyrogram, formodentlig på grund af normal celle infiltration (figur 6D Vi har dog fundet mikrosatellit størrelse ændring for D8Mit293 markør i én tumor samt den tilsvarende cellelinje-DNA (figur 8C). Vi har også fundet heterozygote tab af D8Mit174 markør i en metastatisk lungelæsion (figur 8C).

(A) Skematisk fremstilling af den relative position af de forskellige microsattelite markører, der anvendes for tab af heterozygositet analyse. (B) Repræsentative autoradiogrammer viser allelerne er specifikke for de forskellige mikrosatellitmarkører. Pilen angiver LOH af en allel og stjerne angiver mikrosatellit størrelse ændring (MA) i én allel, N-Normal, t-Tumor (C) Allel status kromosom 8qA4 markører i de thymiske tumorer og TEC og TL cellelinier samt tilsvarende primære og metastatiske tumorer; RH – Bevarelse af homozygositet. Tumorer 1-7 er primære thymiske tumorer svarende til TL og TEC cellelinier. Den underkategori a og b under tumor 1-7 repræsenterer DNA opnået fra to uafhængige lunge metastatiske læsioner af tilsvarende primære tumor hhv.

For at finde ud af, om methylering af Dlc1 promotor var ansvarlig for nedsat ekspression af Dlc1 mRNA og protein, behandlede vi de tumorafledte cellelinjer med DNA demethyleringsmiddel 5′-azacytidin (5 azaC) og derefter undersøgt ekspressionen af ​​Dlc1 mRNA og protein. Interessant behandling med 5 azaC øgede ekspression af Dlc1 isoform 2 sammenlignet med kontrol tumorcellelinjer (figur-4C /III 0,0001) (Figur 9). Den gennemsnitlige størrelse af tumorcellerne (8-12 × 10

3 um

2) var også signifikant større end deres normale modpart (6-8 × 10

3 um

2) (p-værdi = 0,016). Desuden viste tumorcellerne flere ventrale stress fibre [20] henviser til, at normale thymus epitelceller stress fibre meste organiseret som tværgående buer [21] (Figur 9 A-C). Vi har også observeret stress fibre arrangeret i trekantede mesh lignende net overordnede kernen i den dorsale celleoverfladen i thymomaceller (figur 9C).

(A) Normal thymisk epitelcelle viser stress fiber dannelse i form af en ringformet tværgående bue. (B) thymusepitelmonolag carcinoma celle (Z stack-1), der viser omfattende dannelse ventral stress fiber og stigende hyppighed af fokale adhæsioner, (C) den samme tumorcelle viser en anden strukturel organisering af vinculin og actin på Z stack -7 på den dorsale overfladen af ​​cellen. (D) Western blot, der viser transient ekspression af Dlc1 isoform 2 3 proteiner tagged med C-terminal GFP i TEC-cellelinje. Thymusepitelmonolag carcinomceller transficeret med (E) pEGFP C1-vektor, (F) Dlc1 isoform 2 GFP konstruere; (G) Dlc1 isoform 3 GFP-konstruktion. (H) Bar diagram, der repræsenterer det relative antal af celler, der viser neurit ligesom udvidelser udtrykt som en procentdel af de samlede GFP transgene udtrykkende celler.

De stress fibre blev afskaffet, da TEC celler blev transficeret med GFP tagged fuld længde Dlc1 isoform 2 (figur 9E-G). Ekspressionen af ​​GFP-Dlc1 fusionsproteiner blev også bekræftet i et western blot med anti GFP-antistof (figur 9D). GFP-Dlc1 isoform 2-fusionsprotein blev fundet lokaliseret til de fokale adhæsioner (figur 9F). Vi har også bemærket, at tumorcellerne viste kraftig dannelse af “neurit som” cytoplasmatisk forlængelse eller filipodial strukturer sammen med ødelæggelse af stress fiber samling når transficeret med GFP tagged Dlc1 isoform 3 (figur 9H). Alle Dlc1 transfekterede celler til sidst døde 3-4 dage efter transfektion.

For at bestemme, om T-lymfomceller med lavere Dlc1 niveauer viste øget ekstravasation og migration, blev en transendothalial migration assay udført (figur 10). Invasionen rate af T-lymfomceller blev fundet signifikant højere i lymfomcellelinje 1 og 2 i sammenligning med normalt perifert blod (PBL) afledt T-cellelinje (p-værdi = 0,0007 og 0,021 henholdsvis figur 10C). Men de resterende 2 lymfom cellelinjer, med forholdsvis højere Dlc1 udtryk, viste ikke signifikante forskelle i invasion (p-værdi = 0,068). Alle lymfom cellelinjer viste også signifikant højere forkanten pseudopodal struktur sammenlignet med de normale PBL-T-celler (p-værdi 0,04) (Figur 10D). Den øgede forkant pseudopod dannelse og transendothelial migration i lymfomcellelinje 1 og 2 matchet med øget metastase i den tilsvarende mus kohorte (figur 3).

(A) Afbildet er to TL-celler, som havde invaderet mellem endotel celler. TL-celler blev farvet med T-celle-receptor markør specifikke anti-CD3-antistoffer og endotelcellerne blev farvet med DAPI og TRITC-Phalloidin. Det øverste panel viser repræsentative Z stak billeder af top slice (over endotelcellerne) og pilen angiver pseudopod dannelse (B) transendothelial migration assay af T lymfomceller. Tredimensionelle rekonstruktioner viser to TL-celler, som havde invaderet den sammenflydende endotel monolag. Z stablet billeder taget med 0,5 um intervaller er blevet anvendt til rekonstruktion af 3D-billedet. (C) Procentdelen af ​​trans-endothelial migrerede T-lymfomcellelinier. Middelværdien og standardafvigelsen er vist for 5 eksperimenter (D) Procentdel af celler, der viste en forkant pseudopod struktur beneath bEND.3 celler. Middelværdien og standardfejlen af ​​middelværdien er vist for 4 forsøg, hvor mere end 200 celler blev analyseret pr eksperiment. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 og **** P 0,0001 ved Student t-test).

Diskussion

Dlc1 genet ligesom andre tumorsuppressorgener, f.eks TP53, APC og BRCA1, anvendes alternative promotorer til opnåelse mindst tre fuld længde isoformer i mus [22] – [25]. Der er stigende tegn på selektiv brug af alternative promotere, som regulerer differential transskription, kan være involveret i initiering og progression af kræft [26]. Den afvigende brug af en promotor frem for en anden i gener, såsom TGFB3, LEF1 og CYP19A1, er direkte forbundet med kræft cellevækst (gennemgået af [26]). De alternative promotere anvendes af Dlc1 genet er evolutionært bevaret og almindelige blandt de andre Dlc familiemedlemmer [27], [28]. Den Dlc1 genet har tre store alternative udskrifter, som tidligere blev beskrevet som 7,4, 6,1 og 6,2 Kb udskrift af Sabbir et al. [8]. Disse isoformer er blevet udpeget som isoform 1, 2 og 3 i UCSC Genome Browser på Mouse juli 2007 (NCBI37 /MM9) forsamling. Til denne diskussion, vil vi bruge UCSC nomenklatur af isoformer. Tidligere er det blevet vist, at alle tre transkriptionelle isoformer af Dlc1 genet udtrykkes i varierende omfang i forskellige musevæv men, er stadig ukendt deres individuelle rolle i tumorigenese [8]. Den spatio-temporale udtryk for de menneskelige Dlc1 isoformer svarende til mus Dlc1 mangler stadig. For nylig, Low et al. har identificeret et hidtil ukendt Dlc1 isoform 4 i mennesker, hvilket svarer til den Dlc1 isoform 3 i musen og det har vist sig stumme i flere carcinoma linjer ved promotor hypermethylering [29]. Den genetrap mus, som vi har brugt i vores undersøgelse har tidligere vist sig at fælde Dlc1 isoform 2 og reducerer dets ekspression, men ikke isoformer 1 og 3 [8]. Isoformen 3 promotoren viste en høj grad af konstitutiv methylering i normal thymus væv og thymiske tumorceller. Begge disse celletyper udviste stadig ekspression af isoform 3 mRNA. Høj methylering af Dlc1 promotor med fortsat ekspression af genet er også blevet rapporteret for isoform 2 i hunde lymfom [30]. Disse resultater viser, at status for methylering alene ikke være tilstrækkelig til at forudsige ekspression af Dlc1 isoform 3, i det mindste i thymus og T-lymfocytter. Disse resultater antyder også, at udvalgte tab af Dlc1 isoform 2 ekspression kan være tilstrækkeligt til tumorprogression.

Dlc1 genetrap alene ikke er i stand til at inducere tumorer imidlertid i nærværelse af K-Ras2

G12D mutation, det øger tumor og metastase frekvenser sammenlignet med K-Ras2

G12D mutation kun mus, hvilket indikerer en additiv effekt. Den betingede K-Ras2

G12D mus anvendt i denne undersøgelse er tidligere rapporteret at udvikle adenokarcinom i lungen ved intranasal levering af AdenoCre virus [17]. Et andet transgen musemodel, LA1-K-Ras2, hvor K-Ras2

G12D allel kan aktiveres ved en somatisk intrakromosomal rekombinationsbegivenhed, viste høj forekomst af lungetumorer men også en 30% forekomst af thymisk lymfom og andre tumor typer [31]. I vores undersøgelse har vi fundet overvejende thymiske tumorer sammen med neoplastiske læsioner i mange andre organer under anvendelse haleveneinjektion af AdenoCre. Tidligere undersøgelser har vist, at haleveneinjektion af AdenoCre hovedsagelig rettet mod lever, milt og nyrer og i mindre grad thymus, hjerte og lungevæv [32], [33].

Den samlede frekvens af neoplastiske læsioner og thymiske tumorer var signifikant højere i KD mus tyder på, at fældefangst Dlc1 isoform 2 kan have givet en fordel til indledning af tumorudvikling. KD-mus viste også en signifikant reduktion i den samlede overlevelse. Stigningen i lymfom metastaser i lungerne hos KD-mus kan være årsag til nedsat overlevelse hos disse mus.