PLoS ONE: Meget Selektiv Anti-Cancer Aktivitet af kolesterol-vekselvirkende Agenter Methyl-β-cyclodextrin og Ostreolysin A /Pleurotolysin B Protein Complex på urothelial Cancer Cells

Abstrakt

Kolesterol indhold kan variere tydeligt mellem normal og kræft celler med forhøjede niveauer i kræftceller. Her undersøgte vi cholesterol binding med methyl-β-cyclodextrin (MCD), og poredannelse med ostreolysin A /pleurotolysin B (Olya /PlyB) protein-kompleks, der binder til kolesterol /sphingomyelin-rige membran domæner. Vi evaluerede virkningerne på levedygtighed T24 invasive og RT4 invasive menneskelige urothelial kræftceller og normale svin urotelial (NPU) celler. Kolesterol indhold stærkt korreleret med kræft transformation, som højest i T24 high-grade invasive urothelial kræftceller, og lavest i NPU celler. MCD behandling induceret fremtrædende celledød af T24 celler, hvorimod Olya /PlyB behandling resulterede i stærkt nedsat levedygtighed RT4 lav kvalitet noninvasive carcinomceller. Biokemisk og transmission elektronmikroskopi analyser afslørede, at MCD og Olya /PlyB inducerer nekrotisk celledød i disse kræftceller, mens levedygtigheden af ​​NPU celler ikke var væsentligt påvirket af enten behandling. Vi konkluderer, at MCD er mere giftige for T24 høj kvalitet invasive urothelial kræftceller, og Olya /PlyB for RT4 lav kvalitet noninvasive urothelial kræftceller, og hverken er giftigt for NPU celler. Den kolesterol og kolesterol /sphingomyelin-rige membran domæner i urothelial kræftceller udgør således en selektiv terapeutisk mål for eliminering af urothelial kræftceller

Henvisning:. Resnik N, Repnik U, Kreft ME, Sepčić K, Macek P, Turk B, et al. (2015) særdeles selektiv anticanceraktivitet af kolesterol-interagerende Agents Methyl-β-cyclodextrin og Ostreolysin A /Pleurotolysin B Protein Complex på urothelial cancerceller. PLoS ONE 10 (9): e0137878. doi: 10,1371 /journal.pone.0137878

Redaktør: Marie-Claude Potier, Institut du Cerveau et de la Moelle, FRANCE

Modtaget: December 2, 2014 Accepteret: August 24, 2015; Udgivet: 11 September, 2015

Copyright: © 2015 Resnik et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af slovensk Research Agency (https://www.arrs.gov.si/en/agencija), tilskud P3-0108, P1-0207, P1 0140, og J1-4305. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de fleste eukaryote celler, plasma-membran cholesterolindhold den tegner sig for 90% af den samlede celle cholesterol [1,2]. Kolesterol er et afgørende membran komponent, og den påvirker membran struktur og funktion, herunder membranfluiditet og membranprotein aktivitet [3,4,5]. Sammen med sphingomyelin, cholesterol akkumuleres i membran domæner, der er kendt som membran flåder. De specifikke lipid- og protein-sammensætninger af disse kolesterol /sphingomyelin-rige membran domæner er impliceret i mange vigtige signalveje forbundet med cellevækst, migrering og apoptose [6,7].

cholesterolmetabolisme er strengt reguleret, for at opretholde den relevante cholesterolindhold i raske celler. Klinisk og eksperimentel evidens tyder på, at forstyrrelser i kolesterol metabolisme kan have vigtige roller i cancerogenesis og tumor udvikling (revideret i [8,9]). Sådanne forstyrrelser er blevet påvist i flere maligniteter [10,11,12], og kolesterol metabolitter kan fremme eller undertrykke cancere [13]. Øget kolesteroltal er blevet observeret i invasive [10,14,15] og invasive [16] kræftceller, og disse kolesterol stiger kan modulere membran-raft dynamik og tømmerflåde-relaterede koordinering af forskellige signalveje i cancerceller [17].

indholdet af cancerceller kolesterol øges sædvanligvis gennem opregulering af 3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG) -COA reduktase, et regulatorisk enzym i cholesterolsyntese, som fører til sammensmeltning af membran flåder, og kan stimulerer kræftfremkaldende pathways [18]. Omega-3 flerumættede fedtsyrer undertrykker HMG-CoA reduktase og har anticancerogenic egenskaber gennem induktion af celle nekrose eller apoptose [19,20]. Andre velkendte anticancerogenic lipider, som interfererer med membran-raft funktioner gennem cholesterolhomeostase er alkylphospholipids, såsom edelfosin [21]. George og Wu foreslog, at betydningen af ​​membranen redningsflåder sammensætning og integritet for cellelevedygtighed og proliferation er celletypespecifik, skyldes finjustering af signalvejene der kan føre til celledød eller celleoverlevelse [22]. Derfor kolesterol beriget membran domæner er potentielle mål for raft-forstyrrende stoffer, at påvirke celledeling og levedygtighed. Cytotoksiske virkninger af sådanne midler kan føre til mindst tre former for celledød: apoptose, autophagic celledød og nekrose [18,23,24]. Kolesterol udtømning med methyl-β-cyclodextrin (MCD), som sekvestrerer plasma-membran cholesterol, gør melanomceller modtagelige over for apoptose [25] og udløser apoptose i bryst- og prostatacancer-cellelinier, som har rigelige membran flåder [18].

i kunstige og biologiske membraner, kolesterol /sphingomyelin-rige membran domæner kan mærkes med ostreolysin A /pleurotolysin B proteinkompleks (Olya /PlyB) begge meget selektivt og med høj affinitet [26,27]. Olya og PlyB produceres af svampen

almindelig østershat

, og de samles i en pore-dannende kompleks, hvor hver af proteinerne har en særlig rolle. Olya tjener som membranen-bindende komponent, og det binder udelukkende membran domæner, der er beriget med sphingomyelin og steroler [26,27,28,29]. Denne binding kan rekruttere PlyB til membranoverfladen, hvilket fører til dannelsen af ​​13-fold transmembrane pore, hvorved hver underenhed omfatter en PlyB molekyle placeret på en membranbundet Olya dimer [26,30].

interaktionen mellem Olya med kolesterol /sphingomyelin membraner er yderst kooperativ med hensyn til membran kolesterol niveauer over en ~ 30 mol tærskel% [28]. Når Olya rekrutteres til disse membraner, og hvis koncentrationen af ​​Olya /PlyB er høj nok, PlyB har pore-dannende aktivitet [31]. Forbehandlingen af ​​celler med enten MCD eller sphingomyelinase dramatisk ophæver bindingen af ​​Olya [27] (og Olya /PlyB [3,32]) til membranerne i forskellige celler.

Så vidt vores viden, har der ikke været rapporter om den rolle, membranen cholesterol som et potentielt mål til behandling af blærecancer. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om urothelial celler på forskellige stadier af kræft transformation, og også ikke-transformerede normale porcin urotelial (NPU) -celler, afviger i deres følsomhed til kolesterol-interagerende midler ifølge forskellene i deres kolesterolniveauer. For at verificere indflydelsen af ​​potentielle interspecies variation af kolesterol indhold målte vi kolesterolindholdet også i invasive og ikke-invasive muse urothelial cellelinier. Vi sammenlignede følsomhed over for MCD og Olya /PlyB af T24 humane urothelial cancerceller (som en high-grade invasive urothelial karcinom model), RT4 humane urothelial cancerceller (som en lav-grade noninvasive papillær carcinom model), og NPU celler, som morfologisk og fysiologisk ligner normal human urothelium [33,34,35]. Vi benyttede den unikke mekanisme Olya /PlyB proteinkompleks at tillade, på den ene side, effektiv immunmærkning af kolesterol /sphingomyelin-beriget membrandomæner [3,32,36], og på den anden side, styret poredannelse i disse domæner [28,29,32]. Vores undersøgelse viser, at disse T24 og RT4 menneskelig urothelial kræftceller har markant større følsomhed for både kolesterol binding af MCD og pore-dannelse ved Olya /PlyB, sammenlignet med de ikke-transformerede NPU celler. Desuden er disse data tilbyde en ny og yderst selektiv tilgang til behandling af livstruende urothelial metastatiske celler og de mest hyppige noninvasive blære cancerceller.

Materialer og Metoder

Cellekulturer

Den menneskelige urinblære T24 og RT4 cancer cellelinjer (ATTC, Manassas, VA, USA) og mus urinblære, NUC-1 og g /g-celler (en slags gave fra Prof de Boer, Leiden University Medical center, The Nederlandene [37]) blev dyrket i avanceret Dulbeccos modificerede Eagles medium (A-DMEM) /F12 (1: 1), 5% føtalt kalveserum (FCS), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (kontrolmedium for kræft urothelial celler) ved 37 ° C, i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Sekundære kulturer af NPU celler fra femte til tolvte passager blev fremstillet som beskrevet tidligere [33,38, 39]. De NPU celler blev dyrket i MCDB153 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Tyskland) /A-DMEM (1: 1), 2,5% FCS, 0,1 mM phosphoethanolamin (Sigma), 0,5 ug /ml hydrocortison, 5 ug /ml insulin (Sigma ), 4 mM Glutamax, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (kontrolmedium for normale urothelial celler). De kulturmedier og supplementer blev købt fra Invitrogen (Wien, Østrig), medmindre andet er angivet.

Methyl-β-cyclodextrin og Olya /PlyB behandlinger

Methyl-β-cyclodextrin (MCD) blev opløst i kontrol medium (for kræft eller normale urothelial celler) ved hjælp af kolesterol-fri FCS (Thermo Scientific Hyclone, Logan, UT, USA) i stedet for FCS med kolesterol.

En blanding af Olya /PlyB (molforholdet 9 : 1) blev tilberedt af friske frugtlegemer af

P

.

ostreatus

som tidligere beskrevet [26,40]. Før cellen behandling blev Olya /PlyB fortyndet i cholesterol-fri kontrolmedium (for cancer eller normale urothelial celler). For membran-raft mærkning, en nonlytic koncentration af Olya /PlyB (2,5 ug /ml) blev anvendt på de urothelial celler i 1 time og 3 timer ved 37 ° C. Til undersøgelser af cytotoksiciteten blev Olya /PlyB anvendt ved 30 ug /ml i 1 time og 3 timer ved 37 ° C.

Samlet celle kolesterolindhold

T24, RT4, NUC-1 og g /g celler blev podet ved 1 × 10

4 celler /cm

2, og NPU celler på 1 × 10

5 celler /cm

2, og blev dyrket i kontrol medium til 100% sammenløb. T24, RT4 og NPU-celler blev også behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og 250-pi cellesuspensioner blev fremstillet. Lipiderne blev ekstraheret fra 200 pi af disse cellesuspensioner, efter metoden ifølge Bligh og Dyer [41]. Disse lipid ekstrakter blev tørret med N

2, og lipiderne blev opløst i 50 pi isopropylalkohol. Kvantificering af frit cholesterol i disse lipidekstrakter var baseret på anvendelsen af ​​cholesteroloxidase og koblingen af ​​hydrogenperoxidet produceret med 4-hydroxybenzoesyre og 4-aminopyridin med peroxidase-reaktionen. Den quinoneimine farvestof, der blev dannet som følge af peroxidase blev kvantificeret ved 560 nm (Konelab kolesterol kits, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Totale proteinkoncentrationer blev bestemt ud fra 50 pi cellesuspension alikvoter anvendelse af Bradford-assayet [42]. Det totale indhold celle cholesterol gives som ug cholesterol /mg celleprotein.

Olya og HMG-CoA reduktase immunolabelings og målinger fluorescensintensitet

T24 og RT4 celler blev dyrket på dækglas og NPU celler på 0,4-um porøse membraner (BD Falcon, Pharmingen, San Diego, CA, USA). For Olya immunomærkning blev celler inkuberet med 2,5 ug /ml Olya /PlyB i 30 min ved 37 ° C. Cellerne blev derefter vasket med phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret i 4% formaldehyd (FA) i 10 minutter ved 4 ° C. Efter 30 min på blokering med 2% bovint serumalbumin (BSA) ved 37 ° C blev cellerne inkuberet med kanin polyklonale anti Olya antistoffer (1: 2500) i 1 time ved 37 ° C, derefter vasket med PBS og inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin-sekundære antistoffer (1: 600, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) i 30 minutter ved 37 ° C. For HMG-CoA-reduktase immunomærkning blev cellerne fikseret i 4% FA i 10 minutter ved 4 ° C, og sat i blokade af 2% BSA ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter blev cellerne inkuberet med kanin-anti-HMG-CoA reduktase polyklonale antistoffer (1: 200, Merck Millipore 09-356) i 1 time ved 37 ° C, vasket med PBS og inkuberet med Alexa Fluor 488-konjugeret anti-kanin sekundære antistoffer til 30 min ved 37 ° C

cellerne blev monteret i Vectashield indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindol. (DAPI; Vector Laboratories, Burlingamme, CA, USA) og analyseret under fluorescerende mikroskopi (AxioImager Z1) ved anvendelse af et olieimmersionsobjektiv (63 × olie /NA 1,40), og med en ApoTome indretning til optisk sektion generation. Billederne er erhvervet ved hjælp af AxioVision programmet (Carl Zeiss, Tyskland).

Vi analyserede 13-20 billeder pr kultur tilstand og målte den gennemsnitlige grøn fluorescens intensitet pr synsfelt (AxioVision programmet). Billederne blev taget på samme eksponeringstid (469 ms) for hver celle kultur tilstand.

Immunoblotting analyse

Efter MCD behandlingen blev cellerne lyseret med 2 mM EDTA, 150 mM NaCl , 100 mM Tris, 1% Triton X-100, 1 mM aprotinin, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride og 1 mM Na

3VO

4, i 30 minutter ved 4 ° C. Lige store mængder protein (20 ug) blev resolveret under anvendelse af SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner, som derefter blev probet med kanin-anti-LC3 polyklonale antistoffer (1: 1000; MBL; PM036), kanin-anti-PARP polyklonale antistoffer (1: 1000; Roche Life Science, 11835238001), og kanin-anti-p-actin polyklonale antistoffer (1: 1000; Sigma; A2066). Peberrod-peroxidase-konjugeret anti-kanin-polyklonale sekundære antistoffer (1: 1000; Sigma) blev påvist under anvendelse af forøget kemiluminescens-teknikken (Pierce ECL Western blotting substrat, Thermo Scientific)

Måling af caspaseaktivitet

caspase aktivitet blev bestemt ved at måle spaltning af acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluormethylcoumarin (Ac-DEVD-AFC; Bachem, Bubendorf, Schweiz) i ubehandlede (kontrol) og MCD -behandlet T24, RT4, og NPU celler som tidligere [43] beskrevet. For den positive kontrol af caspaseaktivering blev RT4 celler udsættes for UV-bestråling i 30 s for at inducere apoptose, og derefter inkuberet i yderligere 6 timer. DEVD-ase-aktivitet blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Safire; Tecan, Mannedorf, Schweiz). Begyndelseshastighederne for reaktionerne blev beregnet og er vist som relative fluorescensenheder pr sekunder (RFU /s). Salg

flowcytometri Salg

De behandlede og ikke-behandlede urothelial celler blev dyrket i plader med 24 brønde (1 x 10

5 celler /brønd) og dyrket til sammenflydning til MCD og Olya /PlyB behandlinger. De høstede celler blev inkuberet med annexin V-PE-reagens (BD Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA, USA) og med 0,2 ug /ml propidiumiodid (PI; Sigma) .De celler blev analyseret for annexin V-PE og PI fluorescens med et FACSCalibur flowcytometer og CellQuest software (både Becton Dickinson San Jose, CA, USA). Vi diskrimineret fraktionerne af levedygtige (annexin V negative og PI negative), tidlig apoptotisk (annexin V positiv, PI negativ), og døde (PI positiv) cellepopulationer. Der blev udført tre uafhængige forsøg, hvor hver udført in duplo.

Transmissionselektronmikroskopi

Cellerne behandlet med MCD og Olya /PlyB og de ubehandlede celler blev fikseret med 2,5% glutaraldehyd i cacodylatbuffer i 3 timer ved 4 ° C. Efter vask blev cellerne inkuberet med 1% OSO

4 og 3% K

4Fe (CN)

6, fremstillet i cacodylatbuffer, i 1 time ved stuetemperatur. Derefter 0,3% thiocarbohydrozide i cacodylatbuffer sattes i 5 minutter ved stuetemperatur. Efter vask blev 1% OSO

4 tilsat i 20 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter dehydreret og indlejret i Epon (Serva, Heidelberg, Tyskland). Ultratynde snit blev farvet med uranylacetat og bly-citrat (begge fra Merck, Darmstadt, Tyskland). Disse sektioner blev undersøgt under transmissionselektronmikroskopi (TEM) med en stjerneskruetrækker CM100 elektron mikroskop.

Statistik Salg

Dataene er præsenteret som middelværdi ± standardfejl på to eller tre uafhængige forsøg, som hver blev udført dobbelt eller tredobbelt, og blev vurderet ved anvendelse studerendes t-tests, og envejs ANOVA eller Kruskal-Wallis envejs variansanalyse. Hvor der var behov for parvise multiple sammenligninger blev de Holm-Sidak metoden eller Dunns anvendte metode (Sigma Plot software, Systat Software Inc, CA, USA). P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den Pearsons korrelationskoefficient mellem kolesterol indhold og HMG-CoA reduktase proteinekspression blev beregnet (Microsoft Office Excel).

Resultater

Kolesterol indhold er højere i invasive urothelial kræftceller i sammenligning med noninvasive urothelial celler af mennesker og mus oprindelse

for de menneskelige urothelial celler, analyse af kolesterol indhold afslørede de højeste niveauer i T24 invasive urotelial kræftceller, der var betydeligt lavere i RT4 invasiv urothelial kræftceller, og lavest i NPU-celler ( 28,0 ± 0,51; 22,9 ± 1,3; 16,6 ± 1,9 ug cholesterol /mg celleprotein, henholdsvis, fig 1A). Der var en positiv korrelation mellem cholesterolindholdet og HMG CoA-reduktase-proteinekspression, beregnet som Pearsons korrelationskoefficient er r = 0,945 målt fra betyde intensiteten af ​​immunofluorescens (Fig 1B). Denne immunofluorescens var den højeste i T24 celler og lavest i NPU celler.

A. Kvantificering af kolesterolindholdet i invasiv T24 human og NUC-1 museceller, i noninvasive RT4 human og g /G museceller, og i NPU-celler. B. Repræsentative optiske sektioner af HMG-CoA reduktase immunolabeling (grøn) i T24, RT4 og NPU celler. DAPI nuklear farvning ses også (blå). Scale bars 20 pm. C. Kvantificering af den gennemsnitlige intensitet af HMG-CoA immunfluorescens af T24, RT4 humane celler og NPU-celler, som illustreret i (B). A, C. Dataene er middelværdier ± standardfejl fra tre uafhængige forsøg. NS, ikke signifikant; * P 0,05, ** p. 0,005

Da disse ikke-transformerede NPU celler er af porcin oprindelse, at evaluere de interspecies forskelle i kolesterol-indhold, vi analyserede kolesterol indholdet af invasive og noninvasive urotelial celler af museoprindelse. Her testede vi NUC-1 og g /g urothelial celler, der afspejler de forskellige faser i urotelial cancerogenesis i mus [37]. NUC-1-celler er tumorigene og invasive, og som sådan, de giver en tæt sammenligning med T24 humane celler, og g /g mus urothelial celler er noninvasive, og er således sammenlignelig med RT4 humane celler. Kolesterolindholdet i den invasive NUC-1-celler var signifikant højere end i den noninvasive g /G-celler (26,3 ± 1,5; 21,8 ± 1,4 ug cholesterol /mg celleprotein, henholdsvis; Fig 1A). På den anden side, havde indholdet af T24 human og NUC-1 Mouse invasive urothelial celler kolesterol ikke signifikant, hvilket også ses for kolesterolindholdet i RT4 human og g /G muse noninvasive urothelial celler. Disse data indikerer, at indholdet af kolesterol har en omvendt korrelation med graden af ​​urothelial transformation cancer (Fig 1A).

MCD inducerer tidsafhængig og dosisafhængig død urothelial cancerceller

virkningen af ​​MCD behandling på celleviabilitet blev undersøgt ved anvendelse af annexin V og PI farvning i kombination med flowcytometri analyse. De repræsentative dot plots i figur 2A viser T24, RT4 og NPU celleprøver behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og disse er ledsaget af kvantificering af effekterne ved forskellige koncentrationer af MCD (3, 5, 7 mM) anvendt for at øge inkubation gange (1, 3, 6 H). Ved 3 mM MCD, ingen eller kun mindre effekter på levedygtigheder blev observeret i alle tre celletyper, uanset inkubationstiden (Fig 2A).

A. Venstre: Repræsentative dot plots fra flowcytometri analyse af T24, RT4 og NPU celler dyrket i kontrolmedium og efter 7 mM MCD behandling i 6 timer. Annexin V-PE og PI blev brugt til at skelne mellem levedygtige (dobbelt negativ), tidligt apoptotiske (enkelt annexin V positiv) og døde (PI positive) celler. Højre: Kvantificering af cellelevedygtigheden fra flowcytometrianalyse af T24, RT4 og NPU-celler efter 3 mM, 5 mM, og 7 mM MCD behandlinger for 1 time, 3 timer og 6 timer. B. Kvantificering af celle kolesterol udtynding i T24, RT4 og NPU celler efter 7 mM MCD behandling i 6 timer. Data er middelværdier ± standardfejl af dobbeltbestemmelser fra tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001

I T24 celler, som var den mest følsomme over for MCD af disse tre celletyper, cellelevedygtighed var. væsentligt reduceret efter 5 mM og 7 mM MCD behandling i 3 timer, til 92% og 89%, hhv. Seks timer efter levedygtigheden behandling blev yderligere reduceret til 77% ved 5 mM MCD og kun 47% ved 7 mM MCD (Fig 2A). I RT4 celler, det eneste signifikant reduktion i levedygtighed over et område af MCD koncentrationer og inkubationstider var efter 6 timer med 7 mM MCD (til 82%, Fig 2A). En endnu mindre virkning blev observeret for NPU-celler, hvor kun behandling med 7 mM MCD i 6 timer viste en mindre reduktion i cellelevedygtighed (til 92%; Fig 2A). Sammenlignet med T24 og RT4 celler, virkningen af ​​6-H behandling med 7 mM MCD på cellelevedygtigheden var statistisk lavere i NPU-celler (fig 2A). Desuden kunne vi observere, at døende, PI positive celler var annexin V negativt eller positivt, hvorimod en population af enkelt annexin V-positive celler var aldrig fremtrædende, hvilket antyder, at celledøden er nekrotisk snarere end apoptotisk (figur 2A).

Interessant efter 7 mM MCD behandling i 6 timer, det totale indhold af T24, RT4 cholesterol og NPU-celler blev reduceret i sammenligning med de respektive ubehandlede celler, med 86%, 57% og 29%, henholdsvis ( fig 2B).

analysen af ​​cellelevedygtighed viste således, at omfanget af cytotoksicitet af MCD forøget med koncentrationen og varigheden af ​​behandlingen. For yderligere at definere disse forskellige følsomheder til MCD behandling af disse tre typer af urothelial celler blev cellemorfologi analyseret efter 7 mM MCD behandling, hvor et markant fald i celle levedygtighed blev set. T24 celler behandlet med 7 mM MCD i 3 timer, og RT4 celler behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, blev afrundet og blev svagt fastgjort (Fig 3). T24-celler fritliggende efter 7 mM MCD behandling i 6 timer (Fig 3). Omfanget af celleafrunding var mest udtalt i T24 celler, og mindre udtalt i RT4 og NPU celler, hvor der blev observeret kun mindre morfologiske virkninger. Disse data korrelerede godt med celledød analyse.

T24, RT4 og NPU celler (som angivet) var ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 7 mM MCD i 3 timer og 6 timer, og derefter undersøgt under et inverteret mikroskop. Cell afrunding var celletype afhængig (T24 RT4 NPU) og tidsafhængig (kontrol 3 h 6 timer). T24 og RT4 celler ændret form fra flad og polygonalt (kontrol) til sfæriske (T24 celler, 3H, 6 h behandling RT4 celler, 6 h behandling pilespidser). Scale bar, 20 um.

I alle tilfælde, med PI-positiv farvning indikerer, at cellelevedygtigheden blev reduceret på grund af nekrose, ultrastrukturelle analyse ved TEM billede yderligere bevis for nekrotisk celledød (figur 4) . Plasmamembran T24 og RT4 celler efter 7 mM MCD behandling i 6 timer blev sprængt og cytoplasmaet blev frigivet, selvom kernekappen forblev intakt (figur 4). Imidlertid viste NPU celler ingen karakteristika nekrose efter denne MCD behandling (figur 4).

T24, RT4 og NPU-celler var ubehandlede (kontrol) eller behandlet med 7 mM MCD i 6 timer, og derefter bearbejdet for TEM . Nekrotiske ændringer blev set i individuelle T24 celler (stjerne) og RT4 celler, herunder plasma-membran forstyrrelser (pilespidser) og frigivelse af celleindhold. NPU celler forblev intakt efter denne MCD behandling, med glycocalyx stadig er til stede (åbne pilespidser). n, nucleus. Scale barer, 1 um.

For at mere specifikt undersøge inddragelse af apoptose efter MCD behandling blev aktiveringen af ​​caspaser analyseret. Ved at overvåge spaltning af det fluorogene Ac-DEVD-AFC substrat ingen signifikant caspaseaktivering blev observeret ved 6 h inkubation med 3 mM, 5 mM eller 7 mM MCD enten i T24, RT4 eller NPU celler. (Fig 5A). Vi var også ude af stand til at detektere caspaseaktivering i celler inkuberet med 5 og 7 mM MCD i 6 timer ved immunoblotting af PARP p85 fragmentet (Fig 5B), som produceres af aktiverede caspaser [44]. Til sammenligning, UV-stråling forårsaget spaltningen af ​​både DEVD peptidet og PARP-protein i T24 og RT4 celler. Manglen på caspaseaktivering kombineret med fraværet af annexin V signal og ultrastrukturelle ændringer karakteristiske for nekrose kollektivt foreslået, at MCD behandling af urothelial celler udløst nekrotisk snarere end apoptotisk celledød.

T24, RT4 og NPU celler blev behandlet med 3 mM (A), 5 mM (A) eller 7 mM (AC) MCD i 6 timer. A. caspaseaktivitet målinger med Ac-DEVD-AFC spaltning viste ingen stigning i caspaseaktivitet. De positive kontroller (UV 30’erne) viste apoptose-relaterede caspase aktiviteter induceret i T24 og RT4 celler på 6 timer. B. Immunoblotting analyse viste ikke spaltning af fuld-længde PARP (120 kDa) i en 85-kDa fragment. C. Immunoblotting analyse viste ikke omdannelse af LC3-I (18 kDa) til LC3-II (16 kDa). Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Dataene er gennemsnit ± standardafvigelse for tredobbelte målinger.

Western blotting af T24, RT4 og NPU celler efter behandling med 7 mM MCD i 6 timer afslørede ingen konvertering af LC3-I til LC3-II (fig 5C). Dette indikerede, at MCD ikke inducerer autofagi. Desuden observation af T24, RT4 og NPU celler ved TEM afslørede ingen typiske autophagic strukturer, såsom dobbelt-membran vesikler eller autophagosomes (Fig 4).

Olya /PlyB-behandling inducerer nekrose af urothelial kræftceller

Olya /PlyB blev brugt til to forskellige applikationer. En nonlytic koncentration af Olya /PlyB (2,5 ug /ml) blev anvendt til at mærke kolesterol /sphingomyelin-rige domæner af plasmamembraner (Fig 6C), og en lytisk koncentration (30 ug /ml) blev påført permeabilisere plasmamembraner. Den mest fremtrædende Olya immunolabeling (antistoffer blev rejst mod Olya henholdsvis) blev set for RT4 celler og afsløret ved kvantificering af Olya fluorescens (Fig 6C). Denne mærkning Olya var mere ensartet over plasmamembranen i RT4 celler. I modsætning hertil Olya distribution i T24-celler var mindre selv, og dens fordeling var diskontinuerlige. Mærkning af NPU celler viste færre Olya-positive celler, der væsentligt adskiller sig fra T24 og RT4 celler (Fig 6C).

A. Repræsentativ fordeling af PI-farvning af T24, RT4 og NPU-celler behandlet med 30 ug /ml Oly /PlyB i 1 time. Åbne histogrammer repræsenterer ubehandlede celler, mens fyldte histogrammer betegne Olya /PlyB-behandlede celler. Procentdelene af levende og døde celler er vist på den venstre og højre del af histogrammerne hhv. B. levedygtighed T24, RT4 og NPU celler efter 1-h og 3-h behandlinger med 30 ug /m Olya /PlyB, som bestemt ved flowcytometri analyse. Data er middelværdier ± SE af dobbelte målinger fra to uafhængige forsøg. C. immunolabeling af kolesterol /sphingomyelin rige membran domæner i de urothelial celler med Olya. Det overlejret billede af optiske snit gennem hele celler repræsenterer omfanget og fordelingen af ​​Olya immunolabeled kolesterol /sphingomyelin rige membran domæner i T24, RT4 og NPU celler. Green, Olya-mærkning; blå, DAPI-farvning af kerner. Målestokke 20 uM. C. Kvantificeringen af ​​Olya immunolabeling præsenteres som den gennemsnitlige fluorescensintensitet pr synsfelt (i arbitrære enheder A.U.). * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,001

Cell levedygtighed efter en-h og 3-h behandlinger med 30 ug /m Olya /PlyB var. analyseret ved flowcytometri. Celle- levedygtighed efter 30 ug /ml Olya /PlyB behandlinger i 1 time og 3 timer blev bestemt som ovenfor, ved hjælp af flowcytometri-analyse. Som annexin-V mærkning var negativ i alle cellerne, blev fraktionerne af PI-positive (dvs. døde) og PI-negative celler bestemt som angivet ved de repræsentative histogrammer er vist i fig 6A. Efter 30 ug /ml Olya /PlyB behandling i 1 time blev cellelevedygtighed af T24 celler faldt betydeligt til 75% (p 0,005), og efter 3-h, til 65% (p 0,001). Tilsvarende cellelevedygtigheden af ​​RT4 celler faldt til 58% (p 0,001) efter 1 time, selv om dette ikke ændrede yderligere for 3-h behandling. I modsætning hertil blev cellen levedygtighed NPU celler ikke signifikant påvirket af den 30 ug /m Olya /PlyB behandlinger for enten 1 time eller 3 timer (Fig 6B). På tværs af alle disse tre testede celletyper, forskellene i cellernes levedygtighed mellem 30 ug /ml Olya /PlyB behandlinger i 1 time og 3 timer nåede ikke signifikans. Resultaterne af immunmærkning af kolesterol /sphingomyelin rige membran domæner med Olya var i overensstemmelse med analysen af ​​cellelevedygtighed.

Nekrotisk celledød af T24 og RT4 celler efter 30 ug /ml Olya /PlyB behandling i 1 time var angivet med PI-positive celler (figur 6a) og deres karakteristiske ultrastrukturelle ændringer (fig 7). For disse celler, blev de mest fremtrædende ændringer ses som forøget plasma-membranpermeabilitet og udsivning af cytoplasma, sammen med organel hævelse (figur 7). Den ultrastruktur NPU celler blev ikke påvirket med 30 ug /m Olya /PlyB behandling i 1 time, med disse kontrol og behandlede celler viser lignende morfologi og med intakt plasmamembran (Fig 7).

T24, RT4 og NPU-celler blev behandlet med 30 ug /ml Olya /PlyB i 1 time og derefter bearbejdet for TEM. RT4 og T24 celler viser tab af membran integritet (pilespidser), frigivelse af cytoplasma, og organel hævelse (stjerner), der angiver celle nekrose. Den Ultrastrukturen af ​​behandlede NPU celler ligner ubehandlede NPU celler, med rigelige glycocalyx (åbne pilespidser). n, nucleus. Scale barer, 1 um.

Diskussion

Blærekræft er den fjerde mest almindelige kræftform diagnose hos mænd [45]. Men på grund af den høje gentagelse sats og behovet for løbende invasiv overvågning, det har de højeste omkostninger levetid behandling per patient af alle kræfttilfælde [46]. Faktisk op til 70% af patienterne har lokale gentagelser efter intravesikal kemoterapi eller immunterapi [47]. Det er sandsynligt, at den lave hærdehastighed skyldes mikrometastatisk sygdom, der kan induceres ved transuretral resektion eller cystektomi, hvilket resulterer i tilbagefald af urothelial tumorer eller i metastaser i lymfeknuderne, knogler, lunge, hud og lever [48]. Desuden er dødeligheden primært forårsaget af invasive, metastatiske urothelial carcinomer, der bliver resistente over for kemoterapi.