PLoS ONE: BTN3A2 Expression i Epithelial kræft i æggestokkene er forbundet med højere tumorinfiltrerende T-celler og en bedre prognose

Abstrakt

BTN3A2 /BT3.2 butyrophilin mRNA-ekspression af tumorceller tidligere blev identificeret som en prognostisk faktor i en lille gruppe af høj kvalitet serøs epitelial ovariecancer (HG-EOC). Her har vi vurderet den prognostiske værdi af BT3.2 på proteinniveauet i prøven fra 199 HG-EOC patienter. Som den eneste kendte rolle butyrophilin proteiner i immun regulering, vi vurderet sammenhængen mellem BT3.2 udtryk og intratumoral infiltration af immunceller ved immunhistokemi med specifikke antistoffer mod BT3.2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 og CD206. Epiteliale BT3.2 udtryk var signifikant associeret med længere samlet overlevelse og lavere risiko for sygdomsprogression (HR = 0,651, p = 0,006 og HR = 0,642, p = 0,002, henholdsvis) og signifikant associeret med en højere tæthed af infiltrerende T-celler, især CD4 + -celler (0,272, p 0,001). Vi observerede også en stærk sammenhæng mellem den relative tæthed af CD206 + celler, som evalueret af forholdet mellem intratumoral CD206 + /CD68 + udtryk, og risiko for sygdomsprogression (HR = 1,355 p = 0,044, henholdsvis). Afslutningsvis BT3.2 protein er et potentielt prognostisk biomarkør til identifikation af HG-EOC patienter med bedre resultat. I modsætning hertil er høj CD206 + /CD68 + udtryk forbundet med høj risiko for sygdomsprogression. Mens rolle BT3.2 er stadig ukendt, vores resultat tyder på, at BT3.2 udtryk ved epitelceller kan modulerer intratumoral infiltration af immunceller

Henvisning:. Le Side C, Marineau A, Bonza PK, Rahimi K, Cyr L, Labouba I, et al. (2012) BTN3A2 Expression i Epithelial kræft i æggestokkene er forbundet med højere tumorinfiltrerende T-celler og en bedre prognose. PLoS ONE 7 (6): e38541. doi: 10,1371 /journal.pone.0038541

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 6, 2012; Accepteret: 7 maj 2012; Udgivet: 7 juni 2012

Copyright: © 2012 Le Page et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Cancer Research Society og Fondation Carole Epstein. Dr. Cailhier har en clinicien-chercheur stipendium fra Fonds de Recherche en Santé du Québec. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er en førende dødsårsag blandt gynækologiske maligniteter [1]. På grund af sin mangel på symptomer, er denne sygdom ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium (stadium III eller IV), når kræften har allerede spredt sig til sekundære sites. Den standard behandling for disse patienter er kirurgi og platinbaseret kemoterapi, selv om sygdommen ofte skrider selv efter kirurgi og bliver resistente over for standard kemoterapi [2]. Derfor overlevelsesraten for patienter med fremskreden fase EOC er ekstremt lav ( 40%). Kliniske variabler, såsom sygdom scenen og residual sygdom, er prognostiske [3], [4], men stort set uninformative for dem med fremskreden-stadie sygdom.

I en tidligere undersøgelse [5], vi udførte et mRNA ekspression profilering af høj kvalitet serøse EOC tumorvæv at identificere molekylære markører for prognose under anvendelse af en Affymetrix-baseret genekspression microarray platform. Blandt de prognostiske markører identificeret, fandt vi BTN3A2, også kendt som BT3.2 og BTF4, et gen, der tilhører BT3 butyrophilin familien, også en B7-underfamilien. BTN3A2 mRNA var den mest robuste biomarkør blandt 8 andre testede. Ikke kun gjorde det har en prognostisk betydning i univariate og multivariate analyser, men det viste også den højeste hazard ratio sammenlignet med de andre molekylære og kliniske prognostiske variable. Høj mRNA ekspressionen af ​​BT3.2 var stærkt forbundet med en god prognose i forhold til sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelse. Som en EOC prognostisk markør nåede 87% specificitet og 77% sensitivitet til at forudsige tidligt recidiv ( 18 måneder). I en kohorte af 52 patienter [5]

butyrophilin (BTN) familie indeholder BTN1A1, BTN2A1 , BTN2A2, BTN2A3, BTN3A1, BTN3A2, BTN3A3, og BTN-Ligesom medlemmer. Interessant, disse hidtil ukendte BTN familiemedlemmer deler betydelig homologi med B7 familiemedlemmer, som har en IgV-lignende exoplasmic domæne efterfulgt af en anden exoplasmic IgC-lignende domæne. Den cytoplasmatiske domæne indeholder et protein bindende SPRY /PRY B30.2 domænet [6], [7], [8]. I modsætning til andre BTN, nægter BT3.2 ikke en B30.2 domæne i den intracellulære region [7], [9]. Bt3 molekyler (BTN3A1 /BT3.1, BTN3A2 /BT3.2 og BTN3A3 /BT3.3) vides at blive udtrykt på endotelceller [10], i membranlaget omgivende mælkefedt-udskillende dråbe fra mammaepitelceller [11] på immunceller, og på nogle tumorcellelinjer [5], [12].

B7-molekyler kan være negative eller positive regulatorer af T-celleaktivering. B7-H1 /PD-L1, B7-H3, B7-H4, B7DC /PD-L2, B7S3, B7S1, BTNL2, BTN1A1, BTN2A2 kan hæmme T-celle proliferation leverer en hæmmende signal. Omvendt har B7-H3 blevet betragtet som en positiv og negativ regulatorisk molekyle i stand til at stimulere eller inhibere CD4 + og CD8 + T-celler afhængig af den cellulære kontekst [13], [14], [15], [16]. Ligeledes har nogle BTN familiemedlemmer nylig vist sig som nye regulatorer af immunsystemet. Disse omfatter BTNL2 [17] – [18] BT1.1, BT2.2 [19], BTNL1 [20], [21] og Bt3 molekyler. F.eks Yamashiro

et al.

[22] behandles PMBC med et antistof mod BT3.3 og observeret en inhibering af CD4 + og CD8 + celleproliferation, samt nedsat cytokinsekretion af begge typer T-celler. I en anden rapport, Cubillos-Ruiz

et al

. viste, at BT3 ekspression på antigenpræsenterende celler (APC) inhiberede

in vitro

T-celleproliferation og Th1 cytokinsekretion [23]. Mens disse studier har set på funktionen af ​​B7 familiemedlemmer, når de udtrykkes på immunsystemet komponent, er det ikke klart, hvordan disse molekyler kan påvirke immunresponset, når det udtrykkes af andre celletyper. Faktisk offentliggjorte data understøtter ekspressionen af ​​BT3 på EOC celler i primære væv og metastatiske væv [23]. Desuden Messal N.

et al

. nylig rapporteret, at BT3 virker som et co-stimulerende molekyle på CD4 + T-celler og NK-celler [24]. Interessant nok observeret en differentiel immuno-regulatoriske rolle af de forskellige Bt3 isoformer. Alt i alt tyder det komplekse mekanismer kan styre funktionen af ​​Bt3 molekyler. er behov for yderligere observationer at forstå den nøjagtige rolle af disse molekyler i en kontekst specifik måde.

For bedre at forstå den rolle, BT3.2 i kræft i æggestokkene og især at bekræfte vores observeret sammenslutning af mRNA BT3.2 udtryk med en god patient prognose [5], udførte vi en immunhistokemisk analyse af BT3.2 proteinekspression på en stor kohorte af 199 høj kvalitet serøse EOC patienter og bekræftede sammenslutningen af ​​BT3.2 og prognose af EOC patienter. Sideløbende analyserede vi densiteten af ​​intratumorale immunceller og fundet en positiv sammenhæng mellem BT3.2 ekspression ved EOC celler og intratumoral infiltrering af T-celler, mens en høj CD206 + /CD68 + ekspression forholdet var forbundet til kortere sygdomsfri overlevelse. Disse resultater tyder på en rolle BT3.2 i tumor infiltration af immunceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Etik godkendelse blev opnået ved den lokale institutionelle etik bord (Comité d’éthique de la recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal). Tumor prøver blev indsamlet og krænges efter passende skriftlig tilladelse fra patienter, der gennemgår kirurgi i Onkologisk afdeling på Centre Hospitalier de l’Université de Montréal fra 1993 til 2010.

Patienter og vævsprøver

Tumor prøver blev indsamlet og krænges efter passende samtykke fra patienter, der gennemgår kirurgi inden afdelingen for gynækologisk onkologi på Centre Hospitalier de l’Université de Montréal fra 1993 til 2010. en uafhængig patolog scorede tumor kvalitet og scene og en gynækologisk onkolog scorede tumor residual sygdom efter til kriterier fra den Internationale sammenslutning af Gynækologer og obstetrikere [25]. Mindre end 10% af prøven blev udelukket på kvalitet, og dette blev ikke korreleret til alder af prøven. Kliniske data om progressionsfri interval blev defineret i henhold til scan billeddannelse og niveau af blod CA125 [26]. Samlet overlevelse blev defineret som tiden fra operation til død af kræft i æggestokkene. Patienter kendt for at være i live på tidspunktet for analysen blev censureret på tidspunktet for deres sidste opfølgning. Patient sygdomsfri overlevelse (DFS) blev beregnet ud fra tidspunktet for kirurgi, indtil den første progression. Kriterier for optagelse i undersøgelsen var som følger: ingen præoperativ kemoterapeutiske behandling for ovariecancer, platinbaseret postoperativ kemoterapi behandling, høj kvalitet tumorer, serøs histopatholgy undertype og afsluttet informeret samtykke. Alle patienter fik en platinbaseret kemoterapi som en indledende behandling efter kirurgi med retardationstal af patienter, der døde kort tid ( 3 måneder) efter operationen. Patienter, som døde af en anden sygdom, blev bedømt på tidspunktet for sidste opfølgning. En gynækologisk onkolog revideret de kliniske data for alle patienter. For sygdomsfri progression undersøgelse blev kun patienter med klinisk opfølgning på mindst 18 måneder eller indtil recidiv inkluderet. De kendetegn for tumorer og patient resultat for prøven sæt er opsummeret i tabel 1.

cellekulturer og Cell Træpiller i Histogel

For at verificere specificitet af BT3.2 antistoffer , TOV-112D-celler og afledte cellelinier blev dyrket i OSE-medium (50:50 blanding af 199 og 105 Sigma medier) suppleret med 0,5 ug /ml amphotericin B, 50 ug /ml gentamycin og 10% FBS (føtalt bovint serum). Afledte celler medier blev også suppleret med 0,5 ug /ml puromycin. Celler blev holdt i en inkubator befugtet ved 37 ° C med en atmosfære indeholdende 5% CO2 i det væsentlige som beskrevet [27]. Celler pellet indlejret i paraffin blev fremstillet som beskrevet tidligere [28].

plasmider

BT3.1 blev BT3.2 og BT3.3 sekvenser subklonet i pef6v5 vektorer og var en generøs gave Dr. Rhodes (Cambridge, UK) [7]. Alle plasmider blev verificeret ved sekventering. De Bt3 isoform sekvenser blev PCR-amplificeret og subklonet i pENTR ™ /D-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) og derefter rekombineret i pLenti-CMV /TO-puoDest (Abgene) [29]. Lentivirale partikler produktion og celle-infektion blev udført som tidligere rapporteret [30].

Tissue Microarray

Områder med tumor blev udvalgt på grundlag af gennemgang af en hæmatoxylin-eosin-farvede dias. FFPE tumorblokke blev derefter biopsi ved hjælp af en 0,6 mm væv diameter arrayer og deraf kerner blev klædt i et gitter i en modtager paraffin blok. Vævet matrix var sammensat af 260 ovariecancer prøver og 11 prøver af områder fra normale æggelederne af kræftpatienter. Efter gennemgang af kliniske data 61 patienter blev udelukket fra den endelige analyse som de ikke opfyldte inklusionskriterierne. Denne vævsarray blev derefter sektioneret, farvet med hematoxylin-eosin og modtog en anden patologi gennemgang at bekræfte tumor indhold.

Immunhistokemi (IHC)

formalin-fikserede paraffin indlejrede tumorer blev snittet ved 4 um og slides blev farvet manualy på bænken eller ved hjælp af benchMark XT automatiserede farvningsværktøjet (Ventana Medical System Inc.). For den manuelle metode, blev vævssnit opvarmet kortvarigt ved 50 ° C i 15 minutter, afparaffiniseret i toluen og rehydreret i en ethanol-gradient. Objektglas blev neddykket i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA indstillet til pH 9,0) og tryk kogte for 15 min at afsløre antigener. En 0,6 eller 3% H

2O

2 behandling blev anvendt til at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Snittene blev blokeret med et protein blokerende serumfrit reagens (DakoCytomation Inc., ON, Canada) og inkuberet med forskellige antistoffer i 60 eller 120 minutter ved stuetemperatur. Den optimale koncentration for hver primært antistof blev bestemt ved seriefortyndinger. Antistoffer og IHC betingelser er anført i tabel S1. Væv blev inkuberet med et gede-anti-muse-HRP-konjugeret antistof (1:150) (sc-2005 Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). For BT3.2, blev vævene inkuberet med et sekundært biotinyleret antistof (DakoCytomation Inc., ON, Canada) i 30 minutter efterfulgt af inkubering med et streptavidin-peroxidase-kompleks (DakoCytomation Inc., ON, Canada) i 30 minutter ved stuetemperatur. Reaktionsprodukter blev udviklet under anvendelse af diaminobenzidin indeholdende 0,3% H

2O

2 som et peroxidasesubstrat. Kerner blev modfarvet med hematoxylin. Med den automatiske farvningsværktøjet blev antigen hentning for CD206 og CD4 udført med Cell Conditioning 2 (VMSI; # 950-123). Præfortyndet antistof blev automatisk dispenseret, og objektglassene blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. UltraView DAB afsløring kit (VMSI; # 760-091). Slides blev modfarvet med hæmatoxylin (VMSI; # 760-2021). Alle snit blev iagttaget ved lysmikroskopi ved 400 ganges forstørrelse. Substitution af det primære antistof med phosphatbufret saltvand tjente som en negativ kontrol.

Immunofluxorescence (IF)

formalin-fikserede paraffin indlejrede tumorer blev farvet manualy efter antigen-genvinding i Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1 mM EDA indstillet til pH 9,0) i 15 minutter i pressur komfur. Snittene blev blokeret med et protein blokerende serumfrit reagens (DakoCytomation Inc., ON, Canada) og inkuberet med anti-CD68-antistoffer i 90 minutter ved stuetemperatur. Væv blev derefter inkuberet med et gede-anti-muse Cy5 (1/200) i 45 minutter. Muse IgG-antistoffer blev derefter blokeret natten over med M.O.M. ™ reagens (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Anti-CD206-antistoffer blev inkuberet i 90 minutter ved stuetemperatur. Væv blev derefter inkuberet med gede-anti-muse Alexa Fluor A488 (1/250) i 45 minutter før vask og behandling med 0,1% Sudan sort B i 10 min for at reducere autofluorescens. Objektglas blev modfarvet med ProLong® guld antifade fluorescerende montering medier med DAPI (Molecular Probes). Aflæsningen blev udført af mikroskop analyse på høj effekt og derefter dobbelt immunoflourescent farvning blev vurderet til validering.

Farvning Kvantificering

Tumor sektioner blev scannet og digitalt visualiseret. For BT3.2 blev epiteliale zoner scoret efter farvningen intensitet epithelmembranen (værdi på 0 for fravær, 1 for svagt, 2 til moderat og 3 for høj intensitet) som illustreret i figur 1. I kerner hvor farvning var af variabel intensitet den gennemsnitlige intensitet blev rapporteret. Kvantificeringen af ​​infiltrerende lymfocytter blev udført ved at tælle antallet af kerneholdige celler med positiv farvning i intraepitel øer. Resultaterne blev derefter kategoriseret som 0 (ingen celler), 1 (0 n 10), 2 (10 n 90) og 3 (n 90) i overensstemmelse hermed af antallet af celler tælles. Kvantificeringen af ​​makrofager blev udført ved at evaluere procentdelen af ​​farvede celler i intraepithelial område. Den relative massefylde af CD206 + -celler blev beregnet ved forholdet CD206 + /CD68 + farvede celler. Hvert array blev uafhængigt analyseret i en blindtest af to uafhængige observatører. Inter-rating korrelationen var 75%. Når stærke forskelle i scoring mellem de to observatører (mere end 1 enhed pr kerne) opstod kernen blev revurderet for at nå en samstemmende scoring mellem de to observatører. Gennemsnittet af alle kerner med kræft fra den samme patient blev anvendt til analyse.

A. Western-blot-analyse af de samlede proteinekstrakter fra TOV112D cellelinje inficeret med Plenti (vektor kontrol), BT3.1, BT3.2 eller BT3.3 virale konstruktioner. Ekstrakter blev lagt i tre eksemplarer på 10% SDS /PAGE-gel og membraner blev hybridiseret med anti-CD277 (eBioscience), anti-BT3.3 (Atlas Antibodies) og anti-BT3.2 (SDIX Inc.) som angivet ved bunden af figuren. B. Immunhistokemi analyse af paraffinindlejrede cellepellets fra TOV112D cellelinje inficeret med enten Plenti (vektor kontrol), BT3.1, BT3.2 eller BT3.3 virale konstruktioner. Kun celler transficeret med BT3.2 konstruktionen farvedes positivt med anti-BT3.2 (SDIX Inc.). C. Immunhistokemi af xenotransplantattumorer fra TOV112D transficeret med enten tom vektor eller BT3.2 konstrukt. Kun celler inficeret med BT3.2 konstruktionen farvedes positivt med anti-BT3.2 (SDIX Inc.). D. repræsentant farvning for immunhistokemi af BT3.2 på en høj kvalitet serøs EOC TMA. Fra venstre til højre:. Negativ, lav, moderat og høj intensitet

Western blot analyse

Celler blev lyseret med kold lysebuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM DTT /1 mM NaF /0,5% NP-40 /og proteininhibitorer) og centrifugeret i 10 min ved 13000 rpm. Klare lysater blev derefter kogt i påsætningsbuffer, adskilt af 10% SDS-PAGE og overført på en nitrocellulosemembran. Membraner blev mættet med 5% mælk /PBS /0,1% Tween 20. Immunodetektion blev udført som beskrevet i protokollen af ​​ECL-kittet (Amersham Pharmacia): dvs. inkuberet 2 timer ved stuetemperatur eller O /N ved 4 ° C med den specifikke antistof, vasket med PBS /Tween 0,01% og inkuberet i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur med peroxidase-konjugeret antistoffer (Santa-Cruz Biotechnology Inc.). Western-blot-analyse blev udført med beta-actin AC-15 (ab6276 fra Abcam inc. MA, USA), anti-CD277 /BT3.1 (# 14-2779 fra eBioscience, San Diego, CA, USA), anti-BT3 0,2 (SDIX, Newark DE, USA), anti-BT3.3 (HPA007904, Atlas Antistoffer, Stockholm, Sverige). Eksperimenter blev udført tre gange.

Statistical Analysis

Pearson korrelation test (to-halet) blev anvendt til at estimere korrelation med klinisk-patologiske variabler og markører som kontinuerlige variabler. Overlevelseskurver blev afbildet under anvendelse af Kaplan-Meier-kurve analyse og af log-rank testen blev anvendt til at teste for signifikante forskelle. Modtager operative karakteristiske (ROC) kurver blev anvendt til at bestemme tærskelværdien for hver markør svarer til den bedst følsomhed og specificitet for patient progression inden 18 måneder (tidlig sygdomsprogression) eller efter 20 måneder (sen sygdomsprogression) fra første diagnose (p 0,05 og område 0,60) som allerede rapporteret [5]. Univariate og multivariate Cox proportional hazard modeller blev anvendt til at estimere hazard ratio for hver markør som kontinuerte variable. Multivariat analyse blev udført ved hjælp af en fremadrettet trinvis fare model på univariat analyse kræves for indrejse i modellen. Kun fire variabler blev også i multivariat Cox regressionsmodellen for at undgå over-montering. Multivariat analyse blev udført under anvendelse af en indtaste fare model. Stikprøver (n 100, hvor n = 10k /p) og normal fordeling af BT3.2 udtryk blev anset før anvendelse af Cox-modellen. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistiske pakke til Samfundsvidenskab softwareversion 11.0 (SPSS, Inc.), og statistisk signifikans blev sat til

P

. 0,05

Resultater

Angivelse af BTN3A2 /BT3.2 i EOC væv

for at undersøge sammenhængen mellem af BT3.2 udtryk i EOC-celler og patient overlevelse, vi udførte en immunhistokemisk analyse i en kohorte af 199 høj kvalitet serøs æggestokkene kræftpatienter. Først, vi evaluerede specificiteten af ​​tilgængelige antistoffer mod Bt3 isoformer. Vi fandt 3 forskellige antistoffer kommercielt tilgængelige: anti-CD277 (eBioscience Inc.), anti-BT3.3 (Atlas) og anti-BT3.2 (fra SDIX Inc.). Antistoffer blev testet ved western-blotting på cellulære uddrag af TOV112D æggestokkræft cellelinje inficeret med enten BT3.1 eller BT3.2 eller BT3.3 retrovirale partikler. Som det ses i figur 1A, anti-CD277 anerkendt BT3.1 og BT3.2 isoformer. Som forventet, anti-BT3.3 antistof udelukkende anerkendte BT3.3 isoform og anti-BT3.2 specifikt anerkendt BT3.2 isoformen. For at bekræfte specificiteten af ​​den anti-BT3.2 antistof på paraffin indlejret væv, vi analyserede også farvning af paraffinindlejrede cellepellets og xenograft væv fra 112D TOV celler transficeret med enten en tom vektor eller BT3 isoform konstruktioner. Som det ses i figur 1B og 1C, anti-BT3.2 antistof var i stand til at farve kun BT3.2 cellepelleten og BT3.2 xenograft tumor.

Membran og cytoplasmatisk ekspression af BT3.2 i ovariecancer væv blev observeret og afsluttet efter intensiteten af ​​farvning som fraværende, lav, moderat eller stærk (0, 1, 2, 3 henholdsvis) (figur 1D). Tilstedeværelse af BT3.2 protein blev observeret på epitelceller og i nogle vævskerner, kunne det også findes i stroma. Næsten alle EOC kerner (n = 193, 97,5%) viste ekspression af BT3.2. På epitelceller, blev både cytoplasmatisk og membran-farvning ses (figur 1D) og varierede fra fraværende til stærk (figur 1 D, tabel 1). De epitelial BT3.2 Ekspressionsniveauerne ikke signifikant korreleret med patientens alder ved diagnose eller tumor klasse. I modsætning hertil patienter med højere grad af epiteliale BT3.2 tendens til at have lavere tilbageværende sygdom og lavere stadie sygdom (p = 0,058 og p = 0,043 henholdsvis tabel 2).

BT3. 2 Protein Expression er associeret med Samlet overlevelse og Sygdomsfri Progression

Vi har tidligere undersøgt forholdet mellem BT3.2 mRNA-ekspression og ovariecancer patient prognose. Kaplan-Meier og Cox proportional hazard model blev brugt til at estimere sammenhængen mellem BT3.2 mRNA og prognose som defineret af den samlede overlevelse eller sygdomsfri overlevelse (DFS) senest 18 måneder efter operationen [5]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om BT3.2 protein også kunne være af prognostisk værdi. Til dette formål blev der protein udtryk for BT3.2 analyseret i 199 high-grade serøse patienter og statistiske analyser blev udført med hensyn til den samlede overlevelse og DFS. De kohorte egenskaber er beskrevet i tabel 1.

Kaplan-Meier kurver viste, at der var en stærk sammenhæng mellem høj ekspression af BT3.2 protein og steget patient overlevelse (p = 0,014; log rank = 6,03) ( Figur 2A). Mean overlevelse interval var 85 måneder for patienter med højere BT3.2 sammenlignet med 59 måneder for patienter med lavt niveau af BT3.2. Tilsvarende patienter med højere ekspression af BT3.2 havde en gennemsnitlig progression interval på 86 måneder sammenlignet med 55 måneder for patienter med lav ekspression af BT3.2 (p = 0,002, logaritmisk rangeret = 9,65) (Figur 2B).

Kaplan-Meier kurver af samlet overlevelse (A) og sygdomsfri overlevelse (B) i 194 og 171 patienter. Signifikans (p) er angivet med log rank.

I univariate Cox regressionsanalyse var behandling med kontinuerlig niveau af BT3.2 protein evalueret for at afspejle forholdet mellem stigende BT3.2 udtryk og forbedret prognose . I denne analyse blev forøget ekspression af BT3.2 forbundet med en relativt høj risiko risiko (HR) for overlevelse (HR = 0,651, 95% CI 0,479-0,884, p = 0,006, tabel 3). Tilsvarende blev forøget BT3.2 udtryk signifikant associeret med senere sygdomsprogression (HR = 0,642,% 95CI 0,483-0,853, p = 0,002) (tabel 3).

multivariat Cox regressionsanalyse, når standard prognostiske variable blev foretaget (alder, stadium og resterende sygdom), BT3.2 forblev en uafhængig variabel forudsige en høj risiko for overlevelse (HR = 0,597,% 95CI 0,415-0,859, p = 0,005) og sen progression risiko i denne multivariat model (HR = 0,675,% 95CI 0,487-0,935, p = 0,018) (tabel 3).

Forholdet mellem BT3.2 Expression og Immune Infiltrere

Vi hypotese, at forholdet mellem epitel BT3. 2-ekspression og en god prognose skyldtes indflydelse på tumorinfiltrerende immunceller, eftersom det er kendt, at B7-familien molekyler har co-regulatoriske funktioner på T-celler. Desuden er niveauet af intratumoral immuncelle infiltration blevet relateret til prognose af patienter med ovariecancer [31]. For at undersøge denne hypotese, vi vurderet ved immunohistokemi tilstedeværelsen af ​​T-celler ved CD3 +, CD4 + og CD8 + farvning i samme TMA anvendes til BT3.2 analyse. Vi vurderede også betydningen af ​​intratumoral B-celle (CD20 +) og makrofag (CD68 +) infiltration. To klasser af makrofager er blevet beskrevet, antitumorale (M1) og pro-tumorale (M2). Da der i de fleste tumorer, tumor-associerede makrofager (TAM) har en M2-fænotype [32], [33], bestemte vi tætheden af ​​infiltrerende CD206 + celler som et surrogat markør for alternative pro-tumor M2 makrofager da de har tendens til at udtrykke højere niveau af CD206 markør end M1 makrofager. For at bekræfte specificiteten af ​​CD206-ekspression af makrofager i EOC tumorer, vi udførte en kontrol dobbelt immunfluorescensfarvning på et begrænset antal væv (Figur S1). CD206 ekspressionen næsten altid co-lokaliseret med CD68-ekspression antyder makrofag ekspression.

Som det ses i figur 3 og figur 4A-B, immun infiltrering af T-celler, B-celler og TAM blev observeret i EOC væv ved forskellige tætheder i de intraepithelial områder. Den intraepithelial infiltrering af T-celler, CD3 +, CD4 + eller CD8 +, var stærkt korreleret med tilstedeværelsen af ​​CD20 + B-celler (p 0,001) og CD68 + makrofager (P 0,001), herunder CD206 + -celler (tabel 4). Den intraepithelial infiltration af B-celler var også forbundet med tilstedeværelsen af ​​CD68 + og CD206 + celler (r = 0,364 og r = 0,171, p 0,001 og p = 0,022, henholdsvis). Interessant nok er andelen af ​​CD206 + celler i forhold til den totale densitet af CD68 + makrofager, forholdet CD206 + /CD68 + ekspression, blev omvendt korreleret med tilstedeværelsen af ​​CD3 + T-celler og tendens til at korrelere med tilstedeværelsen af ​​B-celler (r = -0,216, p = 0,005 og r = -0,141, p = 0,063, henholdsvis) (tabel 4).

signifikant, blev ekspressionen af ​​BT3.2 af EOC celler korreleret med intraepithelial infiltration af CD3 + celler (r = 0.174 , p = 0,018), herunder CD8 + celler (r = 0,176, p = 0,018) og CD4 + -celler (r = 0,272, p 0,001). Ingen signifikant korrelation mellem BT3.2 ekspression og tilstedeværelsen af ​​CD20 + -celler eller makrofager blev set (p = 0,137, tabel 4).

Høj og lav tæthed af CD3 + (T-celler), CD4 + (T-celler), CD8 + (T-celler) og CD20 + (B-celler), der er vist i venstre og midterste paneler. En forstørrelse på den høje infiltration området vises på højre panel for hver farvning.

Foreningen af ​​intratumoral Lymfocytter, makrofager og EOC Patient Prognose

Som rapporteret af andre [ ,,,0],31], blev tilstedeværelsen af ​​CD4 + -celler også omvendt korreleret med tidlig sygdomsprogression (r = -0,187, p = 0,021, tabel 5). Kaplan-Meier-kurve analyse og log rank test bekræftede, at høj intraepithelial densitet af CD4 + var forbundet med en bedre prognose (tabel S2). Den gennemsnitlige progression interval af patienter med høje intra-epiteliale CD4 + -celler var 69 måneder, sammenlignet med 59 måneder for patienter med lav intraepithelial CD4 + densitet (p = 0,011, logaritmisk rangeret = 6,5). Men vi ikke observere nogen signifikant sammenhæng mellem intraepithelial tæthed af CD3 + eller CD8 + celler og patient prognose (tabel 5 og tabel S2). Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem CD20 + celleinfiltration og samlet overlevelse (log rank p = 0,039), mens der blev opnået kun en tendens til en bedre sygdomsfri overlevelse (log rank p = 0,0677). Imidlertid blev foreningen med samlede overlevelse ikke ses, når CD20 + blev betragtet som en kontinuerlig variabel i univariate Cox regressionsmodel (p = 0,21).

Mens vi ikke observere en sammenhæng mellem tætheden af ​​CD68 + eller CD206 + celler og patient prognose (tabel 5), en forøget forhold af CD206 + i forhold til CD68 + -celler var positivt korreleret med sygdomsprogression (r = 0,157, p = 0,049, tabel 5). Denne relation blev bekræftet af Kaplan-Meier-kurve analyse (p = 0,005, log rank = 7.83, figur 4D, tabel S2) og univariate Cox regressionsanalyse (HR = 1,355, 95% CI 1,223-5,332, p = 0,044). Desuden CD206 + relativ massefylde tendens til at associere med dårlig samlet overlevelse (log rank = 3,53, p = 0,06) (Figur 4C, tabel S2) med en hazard ratio på 2,077 (% CI 95, 0,947-4,558, p = 0,068).

høj og lav tæthed af CD68 + (tumorassocierede makrofager, TAM) (A) og CD206 + (M2 undertype af TAM) celler (B). Forstørrelse i den høje infiltration område vises på højre panel for hver farvning (øverst). C og D. Kaplan-Meier-analyse af forholdet mellem infiltrerende intraepiteliale CD206 + /CD68 + celler repræsenterer den relative tæthed af CD206 + M2 TAM over den samlede tæthed af CD68 + intraepitel infiltrerende makrofager. Kaplan-Meier kurver af samlet overlevelse (C) og sygdomsfri overlevelse (D) i 180 og 174 patienter. Signifikans (p) er angivet med log rank.

Diskussion

I denne undersøgelse immunhistokemi afslørede BTN3A2 /BT3.2 farvning i høj kvalitet EOC serøse tumorer fra 199 patienter. Ekspression blev detekteret ved høj frekvens (97,5%) i overensstemmelse med tidligere data analysere mRNA-ekspression i serøse EOC væv [5]. Det vigtige aspekt ved denne undersøgelse er bekræftelsen af ​​BT3.2 som en potentiel prognostisk markør for høj kvalitet serøs EOC på proteinniveauet. Den første undersøgelse identificerer BT3.2 mRNA som en prognostisk markør var begrænset til et relativt lille sæt af 52 tilfælde. Her, ikke kun vi bekræftede forholdet mellem BT3.2 og et bedre resultat i en stor gruppe, men også på proteinniveau ved immunhistokemi. Dette udgør en lettere overføres teknik i en klinisk patologi afdeling end mRNA detektering såsom Q-PCR. Patienter med højt epitel farvning af BT3.2 havde 1,53 gange mindre risiko for at dø af sygdommen end patienter med lavt niveau af BT3.2 ekspression. Foreningen af ​​BT3.2 til overlevelse og til sygdomsprogression var en uafhængig parameter i en multivariat Cox-regressionsanalyse (tabel 3). Kombination med andre uafhængige molekylære markører kunne forbedre dets kliniske præstation som til dato ingen individuel markør har vist tilstrækkelig følsomhed og specificitet.

En begrænsning af vores undersøgelse er det lave antal patienter uden residual sygdom (n = 23) , der ikke tillod os at analysere dem som en selvstændig kohorte. Optimalt debulked patienter, samlet har bedre prognose end patienter med residual sygdom [34], for hvilken en prognostisk biomarkør kan være mindre informativ.