PLoS ONE: Udvikling af nanopartikler Omfatter en Novel liposommembranen Destabilisering peptid for Effektiv Frigivelse af Cargos ind Cancer Cells

Abstrakt

I anti-cancer terapi medieret af en nanopartikel-baserede lægemiddelafgivelsessystem (DDS), den samlede effekten afhænger af frigivelse effektiviteten af ​​ladninger fra nanopartiklerne i kræftcellerne, samt specificiteten af ​​levering til tumorvæv. Imidlertid konventionelle liposombaserede DDS har ingen mekanisme til specifikt at frigive de indkapslede ladninger inde i cancerceller. For at overvinde denne barriere, udviklede vi nanopartikler indeholdende en hidtil ukendt liposomal membran destabilisering peptid (LMDP), der kan destabilisere membraner ved spaltning med intramembranous proteaser på /i cancerceller. Calcein indkapslet i liposomer modificeret med LMDP (LMDP-lipo) blev effektivt frigivet i nærvær af en membran fraktion indeholdende en LMDP-spaltelig protease. Frigivelsen blev inhiberet af en proteaseinhibitor, hvilket antyder, at LMDP-lipo kan frigøres effektivt sin last til celler som respons på en cancer-specifik protease. Desuden, når LMDP-lipo indeholdt fusogene lipider, blev udgivelsen af ​​lasten accelereret, hvilket tyder på, at fusionen af ​​LMDP-lipo med cellemembraner var det første skridt i den intracellulære levering. Time-lapse mikroskopiske observationer viste, at frigivelsen af ​​gods fra LMDP-lipo skete umiddelbart efter sammenslutning af LMDP-lipo med target-cellerne. Derfor kan LMDP-lipo være et nyttigt nanopartikel i stand til effektiv frigivelse af laster specifikt ind i målrettede kræftceller

Henvisning:. Itakura S, Hama S, Ohgita T, Kogure K (2014) Udvikling af nanopartikler Omfatter en Novel liposommembranen Destabilisering peptid for Effektiv Frigivelse af Cargos til kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e111181. doi: 10,1371 /journal.pone.0111181

Redaktør: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, Portugal

Modtaget: 23, 2014 Accepteret: September 26, 2014; Udgivet: 24 Oktober 2014

Copyright: © 2014 Itakura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af JSP’er KAKENHI Grant Numbers 25860030, 26-9314, og af Kyoto Farmaceutiske Universitet Fonden til fremme af videnskabelig Forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

I cancerterapi, et lægemiddelafgivelsessystem (DDS), der specifikt kan levere forskellige terapeutiske midler til tumorvæv er et effektivt redskab til at opnå cancercelle-specifik terapi uden negative virkninger. Hurtige fremskridt i genom- og proteom forskning har ført til identifikation af molekyler, der medierer udviklingen og progressionen af ​​cancer. Således er det blevet muligt at designe mere specifikke terapeutiske midler mod cancerceller. Generelt meget specifikke lægemidler, såsom peptider, antistoffer, proteiner og nukleinsyrer er høje molekylvægt (HMW) midler. Men den kliniske anvendelse af mange HMW midler er begrænset på grund af deres hurtige nedbrydning af enzymer i blodet samt deres utilstrækkelige levering til celler på deres websteder målretning [1]. For at løse disse problemer, skal HMW agenter indkapsles i nanopartikler, såsom liposomer eller polymere miceller i stand til at beskytte de laster fra enzymatisk nedbrydning og opnå effektiv intracellulær levering. I de nuværende nanopartikler-baserede DDS, ændring med polyethylenglycol (PEGylering) er en væsentlig strategi for deres levering til tumorvæv via forbedret permeabilitet og fastholdelse (EPR) virkninger som PEGylerede luftfartsselskaber kan cirkulere i lange perioder [2], [3]. Dog kun ~ 10% af de injicerede molekyler nå tumorvævet [4]. Derfor er der plads til forbedret levering. Endvidere tumor afgivelse via EPR virkninger afhænger af antallet af umodne tumorkar. Derfor levering effektivitet i kræft med lav vaskulær tæthed, såsom kræft i bugspytkirtlen, er mindre effektiv [5].

Selv om udviklingen af ​​anticancer DDS har hurtigt udviklet sig, er der ingen alternativ strategi, der kan forbedre leveringen af nanopartikler af EPR virkninger. Derfor er det nødvendigt at maksimere den terapeutiske effektivitet af de indkapslede anticancermidler for at kompensere for lav afgivelseseffektivitet til tumorvæv. Når anticancermidler er indkapslet i nanopartikler, terapeutisk effektivitet afhænger af mængden af ​​frie agenter frigivet fra nanopartiklerne. Derfor frigivelse effektiviteten af ​​laster fra nanopartikler er et vigtigt skridt i styrkelsen terapeutisk effektivitet. For at opnå kræftcelle-specifik toksicitet uden uønskede bivirkninger, skal de laster indkapslet i nanopartikler kun frigives, når nanopartiklerne leveres til tumorvæv, ikke i løbet af deres omsætning. I fortiden, for at opnå tumor-specifik frigivelse af ladninger er forskellige nanopartikler er designet til at gøre brug af tumoren miljø. For eksempel har nanopartikler, der kan frigive i tumor-specifikke sure ekstracellulære miljøer udviklet [6] – [8]. Men når en nanopartikel reagerer på det ekstracellulære miljø, er ladningen frigives uden for cellerne. Dette design skaber en ny teknisk problem, fordi mange HMW midler, såsom nukleinsyrer og proteiner skal afleveres og frigives inde tumorcellerne. Desuden specifik frigivelse af en lav molekylvægt (LMW) anticancermiddel inde tumorcellerne udviste mere effektiv anticanceraktivitet end ekstracellulær frigivelse [9].

I denne henseende er en DDS bærer stand til at frigive en last i cancerceller er blevet udviklet. For eksempel er en nucleinsyre bærer afhænger proteinkinase Ca (PKCa), som er overudtrykt i cancerceller [10], [11]. Denne bærer er et kompleks af nukleinsyrer og kationiske polymerer, der inkorporerer et substrat sekvens, der kan målrettes af PKCa. Deres elektrostatisk interaktion reduceres ved phosphorylering af substratet sekvens på polymeren ved PKCa, hvorefter nukleinsyren frigives. En anden fremgangsmåde drager fordel af den forhøjede ATP-koncentration i kræftceller. Det vil sige, et middel indkapslet i chaperonin frigives efter en ATP-medieret trigger [12]. Men i disse release-systemer, levering af midler er begrænset, og

in vivo

ansøgning er vanskelig. Således er yderligere forbedringer i farmakokinetik og intracellulære dynamik påkrævet. I denne henseende kan liposomer indkapsle HMW narkotika og LMW midler. Hydrofobe midler kan transporteres i lipidmembranen og kan tilbageholdes hydrofile midler i den vandige fase [13]. Således alsidigheden af ​​liposomer gør dem spændende for design af nye DDSs.

Med hensyn til frigivelsen af ​​ladninger fra liposomer, har mange systemer blevet udviklet til at inducere fusion af liposomale membraner med endosomale-lysosomale membraner i det sure miljø af endosomet-lysosomet [14]. Men når effektiviteten af ​​flugt fra endosomet er lav, kan lægemidler undergår lysosomal nedbrydning og endocytiske genanvendelse [15]. Derfor er der behov forbedringer i medikamentfrigivelse via membran fusion. Mod herpå vi udviklet et system, der destabiliserer liposommembranen under fusion med kræft cellemembraner. Vi fokuserede på membranen iboende protein γ-sekretase af cancerceller. Denne intramembranous protease kan spalte det transmembrane domæne af substratet protein Notch [16], [17]. For at bruge denne mekanisme, vi indarbejdet peptider efterligner transmembrandomænet af Notch i lipidmembranen af ​​liposomerne. Når således liposommembranen delvist sikringer med cellemembranen, indkapslede ladninger ville blive frigivet i cellerne ved destabilisering af liposomale membraner ved intramembranous γ-sekretase. Hjælp af dette koncept, vi indarbejdet en liposomal membran destabilisering peptid (LMDP) i liposomer (LMDP-lipo), som efterlignede det transmembrane domæne af Notch. Her vil vi vise, at frigivelse af laster fra LMDP-lipo blev lydhøre over for y-sekretase i kræft cellemembraner.

Materialer og metoder

Materialer

æggephosphatidylcholin blev opnået fra NOF Corporation (Tokyo, Japan). 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP) og 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) blev købt hos Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL, USA). Celle Tracker CM-Dil blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Cholesteryl hemisuccinat (CHEMS) og calcein blev erhvervet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Bio-Beads SM-2 adsorbenter blev indkøbt fra Bio-Rad (Hercules, CA, USA). HUEhT-2-celler, en immortaliseret human navlevene endotelcelle (HUVEC) etableret ved elektroporering af pIRES-hTERT-hygr, HeLa-celler, en human cervical epithelioid carcinoma-cellelinje, og MCF-7-celler, en human brysttumor-cellelinje, blev opnået fra JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). A549 celler, en human lunge adenocarcinom cellelinie, blev leveret af Riken Cell Bank (Saitama, Japan). Liposommembranen destabilisering peptid (LMDP), LHLMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRR, blev syntetiseret ved SCRUM (Tokyo, Japan). En fluorescens-quenching peptidsubstrat, NMA-GGVVIATVK (Dnp) RRR-NH

2 og en inhibitor af γ-sekretase, N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycin t -butylester (DAPT), blev opnået fra Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japan). 3 – [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxypropanesulfonate (CHAPSO) blev indkøbt fra Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)

Membran isolering fra celler

Membranfraktionen blev fremstillet ifølge. til tidligere rapporter [18]. Alle procedurer blev udført på is. Dyrkede HeLa-celler, A549-celler, MCF-7-celler og HUEhT-2-celler (ca. 1 x 10

8 celler) blev pelleteret. Cellerne blev resuspenderet i en buffer indeholdende 20 mM Hepes, pH 7,5, 50 mM KCI, 2 mM EGTA, og protease inhibitor cocktail, Complete Mini (Roche Applied Science) og homogeniseret ved anvendelse af 15 slag af en Dounce homogenisator med en stram støder. De cellulære Homogenaterne blev centrifugeret ved 800 ×

g Salg i 10 minutter og igen homogeniseret som ovenfor. Supernatanterne blev centrifugeret ved 100.000 ×

g

i 1 time og gensuspenderet i den samme puffer og genopsamlet ved centrifugering ved 100.000 ×

g

i 30 min ved anvendelse af en Optima XL-90 (BECKMAN COULTER) . Membraner blev resuspenderet i 20 mM HEPES, pH 7,0, 150 mM KCI, 2 mM EGTA, 1% (vægt /volumen) CHAPSO, og Complete Mini og solubiliseret ved 4 ° C i 1 time med ende-over-ende rotation. De solubiliserede membraner blev centrifugeret ved 100.000 ×

g

i 1 time, og supernatanterne blev opsamlet. Den totale koncentration protein blev bestemt med en BCA Protein Assay Kit (Thermo videnskabelig).

γ-sekretaseaktivitet måling

For at måle γ-sekretaseaktivitet, opløste membranpræparationer (15 ug totalt protein) blev inkuberet med otte uM fluorescens-quenching peptidsubstratet ved 37 ° C natten over og centrifugeret ved 16.100 x

g

i 15 min. Fluorescensen af ​​supernatanter blev målt ved Plate Infinite M200 (TECAN) med en excitationsbølgelængde på 355 nm og emissionsbølgelængde på 440 nm.

Fremstilling af LMDP-lipo Salg

Tynde lipidfilm sammensat af EPC , EPC /DOPE /DOTAP (4/4/1), EPC /DOPE /CHEMS (4,5 /4,5 /2) i et glasrør blev hydratiseret i PBS (-) eller 30 mM calcein opløsning i PBS (-) i 10 minutter efterfulgt af sonikering i 5 minutter i et bad-typen sonikator (NEY). Liposomerne blev blandet med 1% Triton X-100 og inkuberet ende over ende i 1 time. Én mM LMDP opløst i 1% Triton X-100 blev tilsat til liposomet opløsning (3-5 mol-%) og inkuberet ende over ende i 1 time. Derefter blev SM-2 Bio-perler tilsat til lipid-LMDP-detergentopløsning i 1 time ved en perler-på-detergent forhold på 30 (w /w) for at fjerne detergent. Den resulterende opløsning blev centrifugeret ved 16.000 x

g

i 10 minutter og supernatanten liposomopløsningen blev opsamlet. For liposomer indeholdende calcein blev fri calcein fjernes med en Sephadex G-50 søjle ækvilibreret med PBS (-). Den lipidkoncentration af liposomer blev bestemt med cholinoxidase-DAOS metode (phospholipider C-test Wako Kit). Partikelstørrelse og overflade potentiale forberedte liposomer blev målt med en Zetasizer nano (Malvern Ins. Ltd.).

LMDP spaltning aktivitet ved γ-sekretase

At studere LMDP spaltning af γ-sekretase, den konkurrencemæssige inhibitoriske virkning af LMDP eller LMDP-lipo på spaltningen af ​​peptidsubstratet (den samme som anvendt i 2.2) blev evalueret. De solubiliserede membranpræparationer af A549 (16,5 ug totalt protein) blev inkuberet med 5 uM peptidsubstrat og 0, 5, 10, 50 eller 100 uM LMDP eller LMDP-lipo som LMDP koncentrationen blev holdt konstant ved 37 ° C natten over. Derefter blev fluorescensintensiteten målt som beskrevet i 2.2.

Spaltningen af ​​LMDP blev også evalueret ved HPLC-assay. De solubiliserede membranpræparationer af A549 (16,5 ug totalt protein) blev inkuberet med 100 pM LMDP eller LMDP-lipo ved 37 ° C i 1 time. LMDP ved en koncentration på 100 uM havde inhiberende virkninger i kompetitiv hæmning undersøgelser og inkubationstiden (1 time) blev matchet med reaktionsbetingelsen i calceinfrigivelse assay. LMDP-lipo blev solubiliseret med 1% Triton X-100, og LMDP forbliver i opløsning blev detekteret ved højtydende væskekromatografi (HPLC) ved anvendelse Alliance systemet (Waters, Milford, MA, USA) forbundet til en søjle af Sunfire C18 ( 5 um, 4,6 x 150 mm, Waters, Milford, MA, USA). Den mobile fase bestod af 0,1% TFA i H

2O (mobil fase A) /og acetonitril i 0,1% TFA (mobil fase B). Gradienten blev startet med en indledende forhold på 80% mobilfase A og 20% ​​mobil fase B, efterfulgt af en lineær gradient fra 80 til 10% mobil fase A i 20 min. Flowhastigheden var 0,3 ml /min, og påvisning bølgelængde var 220 nm.

Calceinfrigivelse assay

For at undersøge frigivelsen af ​​laster fra liposomer, ctrl-lipo eller LMDP-lipo indeholder calcein var inkuberet med solubiliserede membraner (lipid /protein = 2,0 (vægt /vægt)) eller PBS eller 1% Triton X-100 ved 37 ° C i 1 time i nærvær eller fravær af γ-sekretase hæmmer DAPT. De solubiliserede membraner blev præinkuberet med γ-sekretase hæmmer DAPT (10 uM) ved 37 ° C i 30 minutter før behandling med liposomer. Det frigivne calcein blev analyseret ved måling af intensiteten af ​​fluorescens under anvendelse af en plade Infinite M200 (TECAN) med en excitationsbølgelængde på 490 nm og emissionsbølgelængde på 515 nm. Procentdelen af ​​calceinfrigivelse blev beregnet ved følgende formel:

calceinfrigivelse (%) = [(F-F

0) /(F

100-F

0)] × 100, hvor F, F

0 og F

100 var fluorescensintensiteterne af calcein efter inkubering i nærvær af en membranfraktion, i PBS og i 1% Triton hhv.

Konfokal laserscanning mikroskopiske observationer af LMDP-lipo

A549-celler blev dyrket på 0,002% poly-L-lysin- (PLL) overtrukket med 96 brønde billeddannende plader (BD Falcon) ved en densitet på 1 x 10

4 celler /brønd i 24 timer i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). Efter vask med PBS (-), blev cellerne behandlet med ctrl-lipo eller LMDP-lipo indeholdende 0,2 mol% CM-Dil og 30 mM calcein i 1 time i serumfrit DMEM. CM-Dil og calcein var begejstrede med han /Ne (543 nm) og Ar (488 nm) lasere, hhv. En serie af billeder blev opnået ved konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) (LSM 510 META, Carl Zeiss Co. Ltd., Jena, Tyskland) udstyret med en fordybelse olie objektiv linse (Plan-Apochromat 63 /NA1.4). Til hæmning γ-sekretaseaktivitet og endocytotisk vej, A549-celler blev dyrket som ovenfor, og cellerne blev præinkuberet i serumfrit DMEM indeholdende 50 pM DAPT eller 0,4 M saccharose ved 37 ° C eller 30 min, 2,5 mM amilorid ved 37 ° C i 10 minutter og 5 ug /ml FilipinIII ved 37 ° C i 1 time, efterfulgt af behandling med liposomer ved 37 ° C i 1 time og observeret af CLSM, som beskrevet ovenfor. For en detaljeret undersøgelse af calceinfrigivelse blev liposomer observeret af time-lapse billeddannelse af liposomer i levende A549 celler. Cellerne blev dyrket på PLL-overtrukne 35 mm glas-bottom retter (IWAKI) ved en densitet på 2 x 10

5 celler /skål i 24 timer i DMEM indeholdende 10% FBS. Cellerne blev vasket med PBS (-) og behandlet med LMDP-lipo indeholdende 0,2 mol% CM-Dil og 30 mM calcein ved 4 ° C i 10 minutter i serumfrit DMEM. Efter fjernelse af liposomer blev cellerne vasket 3 gange med PBS (-) efterfulgt af tilsætning af frisk serum-frit DMEM. Time bortfalder billeddannelse blev erhvervet ved hjælp af et Nikon A1 CLSM (Nikon Instruments Inc., Melville, USA) udstyret med en olieimmersionsobjektiv linse (Plan Apo VC 60X 1.4 N.A.). Prøverne blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 under alle billeddannelse eksperimenter. Laserlys ved 488 nm og 561 nm blev anvendt til at excitere calcein og Dil hhv. erhvervelse time-lapse var konfigureret til at tage billeder af det samme område hver 30 s i løbet af 30 min. Tidsforskydningen billeddannelse på ca. 3 prikker /celle i 5 celler af hver prøve blev analyseret ved anvendelse af NIS-Elements software (Nikon Instruments Inc., Melville, USA).

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt under anvendelse Students t-test og Tukey-Kramer HSD-test. Forskelle med P-værdier på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

System design:. Frigivelse af laster i celler gennem γ-sekretaselignende afhængig spaltning af LMDP inkorporeret i liposommembranen

Vi udtænkt et system, hvor et substrat peptid med γ-sekretase blev inkorporeret i liposomale membraner. Sådanne liposomer bør være i stand til at bære en last og effektivt frigive den til kræftceller. Peptidet, som vist i fig. 1, bestod af 29 aminosyrerester, som omfattede en hydrofil sted inde i cellen og en hydrofob sekvens af det transmembrane domæne af Notch. Det blev betegnet “liposommembranen Destabilisering Peptid” (LMDP). Den sekundære struktur af LMDP blev forudsagt under anvendelse SOSUI software [19]. Som illustreret i fig. 1, blev det vist, at 23 rester af N-terminalen antaget en spiralformet struktur og trængte membranen, og 6 rester af C-terminale side var stærkt hydrofil og blev placeret uden for lipidmembranen. Derfor blev LMDP designet til at trænge ind i lipiddobbeltlaget. Desuden kunne LMDP spaltes ved 3 point ved γ-sekretase [17]. For at bestemme specificiteten af ​​LMDP for γ-sekretase, vi udførte en homologi søgning af LMDP ved BLAST. Der var ingen protein med høj homologi med LMDP. Således kan LMDP ikke være et substrat for proteaser stærkt udtrykt af cancerceller, såsom matrixmetalloproteinase. Når således inkorporeret i liposomer (LMDP-lipo), bør spaltning af LMDP destabilisere lipiddobbeltlaget ved at udløse membranfusion, efterfulgt af frigivelse af ladninger i cellen.

Dette billede viser begrebet bærerne inkorporerer LMDP i den liposomale membran (LMDP-lipo). Lipiddobbeltlagsmembranen af ​​LMDP-lipo destabiliseres ved at spalte LMDP som en udløser for membran fusion. Den destabilisering fremmer laster slipper ind i cellen.

Spaltningen af ​​LMDP ved γ-sekretase

For at bekræfte, at LMDP blev kløvet af γ-sekretase, vi valgte A549 (human lunge carcinom), MCF-7 (human brystcancer) og HeLa (human cervical cancer) cellelinjer i hvilke høje aktivitet af γ-sekretase er blevet beskrevet [20] – [22]. Den γ-sekretaseaktivitet i membranfraktionen af ​​disse celler blev undersøgt under anvendelse af fluorescerende substrat peptid prober, der kan spaltes af γ-sekretase. Desuden blev HUEhT-2 (en human vaskulær endotel cellelinie) også undersøgt som en normal kontrol. Før spaltning, blev fluorescens af substratpeptider standset på grund af fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) mellem en quenching-gruppe (Dnp) og en fluorescerende gruppe (NMa) ved N-terminalen af ​​peptidet på tværs af spaltningsstedet. Således ville fluorescens optrådte ved eliminering af FRET grund spaltning af peptiderne. Sådanne peptid-prober anvendes ofte til vurdering af γ-sekretaseaktivitet [18]. Vi fandt, at y-sekretase aktiviteter var næsten den samme i HeLa-celler og normale HUEhT-2-celler, men var signifikant højere i MCF-7 og A549-celler (fig. 2a). Endvidere blev ekspressionen af ​​presenilin-1, som er et aktivt center af γ-sekretase, undersøgt ved flowcytometri. Som vist i fig. S1, udtryk for presenilin-1 blev observeret på samme niveau i alle celler. Den specifikke aktivitet af γ-sekretase (γ-sekretaseaktivitet /presenilin-1-ekspression) blev beregnet og γ-sekretaseaktivitet var højere i MCF-7 og A549-celler end i andre cellelinier. Da A549-celler havde større plasmamembran områder end MCF-7-celler, blev de foretrukket til assays intracellulære frigivelse.

(a) γ-sekretaseaktivitet i dyrkede celler. Fluorescensen peptid probe blev inkuberet med membranfraktioner fra HUEhT-2, HeLa, MCF-7 og A549-celler. (B) kompetitiv hæmning af LMDP. Peptidet sonde og LMDP blev inkuberet ved de angivne koncentrationer i membranfraktionen af ​​A549-celler ved 37 ° C natten over. Værdier og søjler repræsenterer de midler og SD hhv. (C) Repræsentative kromatogrammer af LMDP med eller uden membranfraktionen som bestemt ved HPLC-analyse fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 versus HUEhT-2 (a), 0 uM LMDP (b), n = 3.

Membranfraktionen blev isoleret fra A549-celler og blev vurderet for LMDP spaltningsaktivitet . For at vurdere vekselvirkningen af ​​LMDP med γ-sekretase, undersøgte vi kompetitive hæmning af LMDP på ​​spaltningen af ​​det fluorescerende substrat peptid probe ved en membranfraktion indeholdende γ-sekretase. Fluorescensintensiteten af ​​substratet probe blev signifikant reduceret i en LMDP koncentrationsafhængig måde (IC

50:29 pM) (fig. 2b). Dette resultat antydede, at spaltning af fluorescerende substrat peptid med γ-sekretase kompetitivt blev forhindret af LMDP. Et signifikant fald i fluorescens intensitet blev ikke observeret, når det blev undersøgt på samme måde under anvendelse af en anden polypeptid, der havde en tilsvarende størrelse (30 rester) (Fig. S2). Disse resultater antydede, at LMDP sekvens specifikt blev anerkendt af γ-sekretasen.

Spaltningen af ​​LMDP ved γ-sekretase var næste undersøgt af HPLC. Toparealet for LMDP blev reduceret ca. 22,6 ± 10,5% i nærvær af en membranfraktion med γ-sekretaseaktivitet (tabel 1), hvilket bekræfter spaltning af LMDP. Fig. 2c viser et repræsentativt kromatogram af LMDP behandlet med eller uden membranfraktionen. Disse resultater antydede, at syntetisk LMDP blev spaltet af en A549 cellemembran fraktion besidder høj γ-sekretaseaktivitet.

Konstruktion af LMDP-lipo

LMDP blev inkorporeret i liposomale membraner med et vaskemiddel fjernelse metode. LMDP blev solubiliseret med et overfladeaktivt middel (1% Triton X-100) og blev blandet med phospholipid. Derefter blev det overfladeaktive middel i lipid /LMDP blandingen fjernet for at fremstille liposomer, der inkorporerer LMDP af en vulst adsorption fremgangsmåde som beskrevet i Materialer og Metoder. Vi bestemt, at 2,3 ± 0,2% LMDP blev inkorporeret i liposomer ved HPLC-analyse. Calcein blev anvendt som en model fragt og var indkapslet i liposomer. Vi vurderede lækage af calcein i nærvær af en fraktion A549 cellemembranen. Når indarbejde LMDP i liposomer bestående af EPC, var der ingen forskel i udsivning på calcein sammenlignet med liposomer uden LMDP (fig. 3). I dette system, det transmembrane domæne af substratet peptid i liposommembranerne skal spaltes af y-sekretase i cellemembranen. Fordi det var nødvendigt at optimere lipidsammensætningen af ​​liposomerne, vi har forsøgt at give liposomer membranfusion kapacitet.

Kontrol-lipo bestod af EPC eller EPC /DOPE /DOTAP (DOTAP) eller EPC /DOPE /CHEMS (Chems). LMDP-lipo indeholdt 5 mol% LMDP. De blev inkuberet med membranen fraktion fra A549-celler ved 37 ° C i 1 time. Hvide og sorte søjler angiver Kontrol-lipo og LMDP-lipo hhv. Værdierne repræsenterer hjælp af tre individuelle eksperimenter. Søjler repræsenterer SD. *, P. 0,05

Således DOPE indgik i lipidsammensætningen. Eftersom LMDP havde et hydrofobt transmembrant domæne og et hydrofilt site med basiske aminosyrer (arginin og lysin) (fig. 1), vi formodede, at den elektrostatiske vekselvirkning mellem overfladen ladning af liposomerne og ladningen af ​​den hydrofile site ville påvirke både indarbejdelse af LMDP i liposomer og deres funktionalitet. Således har vi forberedt membran fusion liposomer med positive eller negative ladninger, der indeholder DOTAP eller CHEMS i EPC /DOPE og indarbejdet LMDP i hver.

lækage af den indkapslede calcein fra den negativt ladede EPC /DOPE /Chems liposomer øget tre gange i nærvær af en membran fraktion indeholdende γ-sekretase. På den anden side, når sammensætningen indeholdt det kationiske lipid DOTAP, lækage af calcein blev ikke forøget med LMDP (fig. 3). Resultaterne antydede, at inddragelse af CHEMS og DOPE med EPC var forpligtet til at optimere funktionaliteten af ​​LMDP. De fysisk-kemiske egenskaber af liposomer og deres sammensætninger er sammenfattet i tabel 2.

Mekanismen for lægemiddelfrigivelse fra LMDP-lipo

Vi først, om LMDP blev spaltet ved γ-sekretase når det blev inkorporeret i liposomer. Således testede vi evnen hos LMDP-lipo til kompetitivt at inhibere spaltningen af ​​et fluorescerende substrat probe ved y-sekretase. Vi verificerede, at spaltningen af ​​det fluorescerende peptid probe blev signifikant hæmmet selv når LMDP-lipo blev tilsat til membranen fraktionen indeholdende γ-sekretase (fig. 4a). Selvom den inhiberende virkning af LMDP-lipo var mindre end LMDP alene, blev det bekræftet, at LMDP i liposomale membraner kunne reagere med γ-sekretase. Spaltningen af ​​LMDP i liposomale membraner blev også evalueret ved HPLC i nærvær af γ-sekretase-indeholdende membranfraktionen. Toparealet for LMDP i liposomerne blev reduceret med ca. 36,8 ± 7,0%, og spaltningen af ​​LMDP er vist i nærvær af en membranfraktion (tabel 3). Fig. 4b viser de repræsentative kromatogrammer af LMDP-liposom med eller uden membranfraktionen.

(a) kompetitiv hæmning af LMDP i liposomer. Den fluorescens peptid sonde blev inkuberet med kontrol-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) eller LMDP-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /3 mol% LMDP) ved de angivne LMDP koncentrationer i overværelse af membranen brøkdel af A549 celler ved 37 ° C natten over. Hvide og sorte søjler angiver Kontrol-lipo eller LMDP-lipo hhv. (B) Repræsentative kromatogrammer af LMDP-liposomer med eller uden membranfraktionen som bestemt ved HPLC-analyse fra tre uafhængige forsøg. (C) Størrelse fordeling af liposomer i nærvær af membranfraktion opnået fra A549-celler med eller uden γ-sekretase inhibitor blev målt under anvendelse af Zetasizer nano. Solid linje og stiplede linje indikerer Kontrol-lipo og LMDP-lipo hhv. (D) Polydispersitetsindeks (PDI) af toppen ved hjælp af Ctrl-lipo eller LMDP-lipo. Hvid, grå og sorte søjler angiver liposomer alene, liposomer i nærvær af en A549-celle membranfraktion eller liposomer i nærvær af en membranfraktion med 10 pM DAPT hhv. (E) Overflod fordeling af toppen for kontrol-lipo (sorte cirkler) og LMDP-lipo (sorte trekanter) under samme betingelser som (d). (Værdier og søjler repræsenterer de midler og SD, henholdsvis *, P. 0,05 og ***, P 0,001 versus 0 uM LMDP (a), Kontrol-lipo (c, d), n = 3.

Dernæst vurderede vi ændringen af ​​LMDP-lipo partikelstørrelse i nærvær af γ-sekretase-holdige membranfraktion. vi vurderede også indflydelsen af ​​partikelstørrelsen i nærværelse af N- [N- (3, 5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycin t-butylester (DAPT), en γ-sekretase hæmmer. Den inhiberende effekt af DAPT blev bekræftet ved anvendelse af et substrat peptid probe. Specifikt γ-sekretaseaktivitet blev inhiberet med omkring 60% ved tilsætning af DAPT (fig. S3). fig. 4b viser, at partikelstørrelsesfordelingen af ​​LMDP-lipo bred blev sammenlignet med kontrol-lipo i nærvær af en membranfraktion. Denne brede fordeling blev inhiberet ved behandling med DAPT. det polydispersitetsindeks (PDI) af LMDP-lipo blev øget betydeligt i nærværelse af membranen fraktion i forhold til kontrol-lipo, en forskel, der blev reduceret ved behandling med DAPT. Derudover blev PDI i Kontrol-lipo behandlet med membranfraktionen steget en smule i forhold til, at der i Kontrol-lipo uden membranfraktionen. Imidlertid blev denne stigning ikke ændres ved samtidig behandling med γ-sekretase hæmmer, DAPT, hvilket antyder, at stigningen i PDI i kontrol-lipo skyldtes tilstedeværelsen af ​​membranfraktionen. (Fig. 4c). Den overflod fordeling af hovedtoppen af ​​liposomerne blev sammenlignet i fravær eller nærvær af membranfraktionen. Den overflod af hovedtoppen af ​​LMDP-lipo blev signifikant reduceret i nærvær af membranfraktionen. Disse ændringer blev undertrykt af DAPT, og det blev ikke observeret i Control-lipo (fig. 4d). Disse resultater antydede, at størrelsesfordelingen blev ændret fordi LMDP blev spaltet ved γ-sekretase, hvilket forårsager destabilisering af den liposomale membran og skiftende partikelstørrelse.

γ-sekretase-afhængig frigivelse af laster fra LMDP-lipo

Vi undersøgte, om frigivelse af laster afhang γ-sekretaseaktivitet. Således blev LMDP-lipo indkapsling calcein blandet med membranfraktionen fra A549-celler, HeLa-celler, MCF-7-celler eller HUEhT-2-celler. Når LMDP-lipo blev blandet med membranfraktioner isoleret fra A549-celler og MCF-7-celler med meget høje y-sekretase aktiviteter, øget lækage af calcein sammenlignet med kontrol-lipo. Den øgede lækage blev signifikant undertrykt ved behandling med DAPT. På den anden side, havde calcein lækage ikke stige når membranfraktioner af HeLa-celler og normale HUEhT-2-celler (lidt høj eller lav γ-sekretaseaktivitet, henholdsvis) blev anvendt (Fig. 5). Derfor resultaterne tyder på, at frigivelsen af ​​laster fra LMDP-lipo er afhængig af høj γ-sekretaseaktivitet i kræftceller.

Kontrol-lipo (EPC /DOPE /CHEMS) eller LMDP-lipo (EPC /DOPE /CHEMS /5 mol% LMDP) blev inkuberet i nærvær af membranfraktionen fra HUEhT-2-celler (hvide søjler), HeLa-celler (stiplede søjler), MCF-7-celler (dobbeltskraverede søjler), A549-celler (sorte søjler) eller A549-celler med 10 pM DAPT (grå søjler) ved 37 ° C i 1 time. Data repræsenterer middelværdier ± S.D. (N = 3-7) *, P 0,05, ** P 0,01 og ***, P. 0,001

Intracellulær frigivelse af laster fra LMDP-lipo