PLoS ONE: Differential proteomiske Analyse af Noncardia mavekræft fra Personer i det nordlige Brasilien

Abstrakt

mavekræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Identifikationen af ​​nye kræft biomarkører er nødvendig for at reducere dødeligheden gennem udvikling af nye screening-assays og tidlig diagnose, samt nye mål behandlingsformer. I denne undersøgelse udførte vi en proteomisk analyse af noncardia gastriske neoplasier af individer fra Northern Brasilien. Proteinerne blev analyseret ved todimensional elektroforese og massespektrometri. Til identifikation af differentielt udtrykte proteiner, vi brugte statistiske test med bootstrapping resampling at kontrollere type I fejl i multipel sammenligning analyser. Vi identificerede 111 proteiner involveret i gastrisk carcinogenese. Den beregningsmæssige analyse afslørede flere proteiner involveret i energiproduktion processer og styrket Warburg effekten i mavekræft. ENO1 og HSPB1 udtryk blev yderligere vurderet. ENO1 blev valgt på grund af dets rolle i aerob glycolyse, der kan bidrage til Warburg virkning. Selvom vi observerede to opreguleret pletter af ENO1 i proteomisk analyse blev den gennemsnitlige ekspression af ENO1 reduceret i gastriske tumorer ved Western blot. , Middelværdi ENO1 udtryk synes imidlertid at stige i mere invasive tumorer. Denne mangel på korrelation mellem proteomisk og western blot-analyser kan skyldes tilstedeværelsen af ​​andre ENO1 pletter, der udviser en svagt reduceret ekspression, men med en stor effekt i den gennemsnitlige proteinekspression. I neoplasier, er HSPB1 induceret af cellulært stress at beskytte celler mod apoptose. I den foreliggende undersøgelse HSPB1 præsenteret en forhøjet protein og mRNA-ekspression i en undergruppe af mavekræft prøver. Imidlertid blev der ikke observeret nogen sammenhæng mellem HSPB1 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika. Her har vi identificeret en række mulige biomarkører for mavekræft i personer fra det nordlige Brasilien. Disse biomarkører kan være nyttige for vurderingen af ​​prognosen og lagdeling til behandling, hvis valideret i større kliniske studier sæt

Henvisning:. Leal MF, Chung J, Calcagno DQ, Assumpção PP, Demachki S, da Silva IDCG, et al. (2012) Differential proteomiske Analyse af Noncardia mavekræft fra Personer i det nordlige Brasilien. PLoS ONE 7 (7): e42255. doi: 10,1371 /journal.pone.0042255

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: 9. februar 2012; Accepteret: 3 jul 2012; Udgivet: 30 Jul 2012

Copyright: © Leal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Dr. Chammas, Dr. Smith og Dr. Burbano) og Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Dr. Leal, Dr. Chung og Dr. Calcagno ) som tilskud og fællesskab prisuddelinger. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Den generelle relative 5-års overlevelse er i øjeblikket mindre end 20% [2]. I det nordlige Brasilien, GC er den næsthyppigste neoplasi blandt mænd og den tredje hos kvinder [3]. I Pará State, Northern Brasilien, 5-års overlevelse er omkring 9-10% [4].

De to vigtigste tumor steder af GC er Cardia (proksimale) og noncardia (distale). Cardia GC påvirker fem gange flere mænd end kvinder [5]. Hertil kommer, at forekomst af cardia GC er relativt høje i den professionelle klasser [6]. I modsætning hertil noncardia GC har en han-til-kvinde-forhold på ca. 02:01 og forekomsten stiger progressivt med alderen, med et højdepunkt incidens mellem 50 og 70 år [7]. De risikofaktorer for noncardia GC omfatter

Helicobacter pylori

infektion, lav socioøkonomisk status, rygning, indtagelse af salt og røget mad, og lavt forbrug af frugt og grøntsager [8]. I løbet af de seneste årtier, er forekomsten af ​​noncardia GC væsentligt faldt i udviklede regioner i verden. Men denne undertype stadig udgør størstedelen af ​​GC tilfælde i hele verden og er stadig almindelig i mange geografiske regioner, herunder Kina, Japan, Østeuropa og Centralasien /Syd Amerika [8]. Forståelsen af ​​GC biologi og identifikation af kræft biomarkører er nødvendige for at reducere dødeligheden gennem kræft screeninger i højrisikogrupper, for at øge tidlig diagnose, og at udvikle nye mål behandlingsformer.

GC, som andre neoplasier , menes at skyldes en kombination af miljømæssige faktorer og ophobningen af ​​generaliserede og specifikke genetiske og epigenetiske ændringer, som påvirker onkogener, tumorsuppressorgener, og kontrollere genomisk ustabilitet. Adskillige gener /proteiner er blevet foreslået som GC biomarkører. I flertrins gastrisk carcinogenese, ændringer af onkogener myc KRAS2, CTNNB1, erbB2, FGFR2, CCNE1 og HGFR, samt af de tumorsuppressorer TP53, APC, RB, DCC, RUNX3 og CDH1 er hidtil rapporteret (se anmeldelser [9], [10]). Selv dereguleringen af ​​disse gener /proteiner er blevet intensivt undersøgt i GC, en mere komplet profilering er nødvendig for at forstå carcinogenese proces.

Det sidste årti i biovidenskab var dybt påvirket af udviklingen af ​​”omics” teknologier (genomik, transcriptomics, proteomics og metabolomics), som har til formål at skildre et globalt syn på biologiske systemer og forståelsen af ​​den levende celle [11]. Da proteiner er i sidste ende ansvarlig for den maligne fænotype, kan proteomikanalyser afspejler den funktionelle tilstand af kræftceller, og derfor har klare fordele i forhold genomforskning og transcriptomics undersøgelser [12]. Desuden proteiner er i øjeblikket hovedmålgrupperne molekyler af anticancer narkotika [13].

Nogle proteom-baserede undersøgelser er tidligere udført i humane primære gastriske tumorer (se gennemgang [14]). Men de fleste af disse undersøgelser analyserede tumorer i individer fra asiatiske befolkning og dermed kan afvige de forskellige biologiske og kliniske adfærd blandt GC processer. GC er præget af globale variationer i forekomst, ætiologi, naturlige forløb, og forvaltning [15]. Selv om 90% af mave tumorer er adenocarcinomer [7], adskillige faktorer føre til biologisk og klinisk GC delmængder: forhenværende tumorgene betingelser, såsom

Helicobacter pylori

gastritis og andre kroniske gastriske patologier; placering af den primære tumor (mavemunden og noncardia region); undertyper af adenocarcinom (diffus, intestinal eller blandet [16]); etnicitet af de ramte befolkning (forskellige niveauer af følsomhed og aggressivitet af tumorerne); og en prædiktiv biomarkør (ERBB2) [15]. Således er udtrykket “gastrisk cancer” anvendes til at beskrive flere neoplasier, der påvirker mave-regionen.

I den foreliggende undersøgelse sammenlignede vi ekspressionsprofilen af ​​noncardia GC og den matchende ikke-neoplastisk gastrisk væv af personer fra Northern Brasilien (alle med

H. pylori

infektion), og identificeret et protein signatur, der differentielt blev udtrykt mellem de to grupper ved en todimensional elektroforese (2-dE) metoden. At screene proteiner relateret til udviklingen af ​​gastrisk carcinogenese, vi også sammenlignet ikke neoplastiske gastriske væv med GC prøver af individer med og uden lymfeknudemetastaser. For udvælgelsen af ​​differentielt udtrykte proteiner, brugte vi en statistisk Parametrics test med bootstrapping resampling. Vi har foretaget en omfattende beregningsmæssige analyse af væv proteom data til at opdage veje og netværk, der er involveret i gastrisk onkogenese og progression. De mulige foreninger blandt enolase 1 (ENO1) og varme shock 27 kDa protein 1 (HSPB1) gen og protein udtryk, og klinisk-patologiske karakteristika blev også evalueret i personer fra det nordlige Brasilien. Disse to proteiner er blevet rapporteret hyppigt som liberaliserede molekyler i tidligere GC proteomiske studier i andre populationer. Imidlertid blev de aldrig evalueret i en brasiliansk befolkning.

Metoder

Kliniske prøver

For protein profilering analyse noncardia GC prøver og tilsvarende ikke-neoplastiske gastrisk væv (afsides beliggenhed af primær tumor, kontrolgruppe) blev opsamlet fra 15 patienter. Yderligere parrede prøver blev inkluderet for western blot og real time kvantitativ PCR (RT-qPCR) analyser. Dissekerede vævsprøver var snap-frosset i flydende nitrogen efter kirurgisk dissektion og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Alle mavens prøver blev opnået kirurgisk fra João de Barros Barreto Universitetshospital (HUJBB) i Pará State, Northern Brasilien. I Pará stat, er den menneskelige befolkning består af etniske krydsninger mellem tre vigtigste oprindelse grupper: EU (hovedsagelig repræsenteret af den portugisiske), afrikanere og indianere [17]. Alle patienter havde negative historier om udsættelse for enten kemoterapi eller strålebehandling før operationen, og der var ingen anden samtidig forekomst af diagnosticerede kræftformer. Skriftligt informeret samtykke med godkendelse af den etiske komité af HUJBB blev opnået fra alle patienter forud for prøvetagning.

Alle prøver blev klassificeret i henhold til Lauren [16] og tumorer blev iscenesat ved hjælp af standard kriterier ved TNM mellemstationer [18] . Tilstedeværelsen af ​​

H. pylori

, et klasse I carcinogen, i gastriske prøver blev påvist ved PCR-assay for urease gen [19] og for dets virulensfaktor vakuolerende cytotoksin (CagA) [20] anvendelse af DNA oprenset samtidigt med proteinerne og mRNA’et. I hvert PCR forsøg blev positive og negative kontroller inkluderet.

For at reducere prøve heterogenitet, den 2-DE-analyse omfattede kun noncardia GC og gastriske prøver præsentere

H. pylori

infektion CagA +, som synes at være hyppige i vores befolkning (upublicerede data). Tabel 1 viser de klinisk-patologiske kendetegn ved de prøver, der anvendes til protein profilering analyse.

Protein, mRNA og DNA oprensning

Total protein, mRNA og DNA blev samtidig isoleret fra gastrisk vævsprøver under anvendelse den AllPrep DNA /RNA /Protein kit (Qiagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Proteinet pellet blev opløst i buffer indeholdende 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma), og 0,5% af hver Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 og 2 (Sigma-Aldrich, USA ). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved metoden ifølge Bradford (Sigma-Aldrich, USA). RNA-koncentrationen og kvaliteten blev bestemt under anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Kisker, Tyskland) og 1% agarosegeler. Prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

2-DE-proteomics profilering

Proteiner blev separeret ved 2-DE [21]. Protein prøver (300 ug) blev læsset på IPG strimler (pH 3-10 L, 18 cm, GE Healthcare, USA). Strimlerne blev rehydreret i 12 timer ved 50 V. isoelektrisk fokusering blev udført under anvendelse af følgende program: 200 V 2 h, 300 V 30 min, 500 V 30 min, 1000 V 1 time, 8000 V 1,5 timer og 80.000 Vh. De fokuserede strimler blev reduceret med 50 mM DTT og alkyleret med 100 mM iodacetamid i buffer indeholdende 6 M urinstof, 50 mM Tris-HCI (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS og spore bromphenolblåt. For sekundær elektroforese blev de behandlede strimler fyldt på toppen af ​​12,5% SDS-PAGE (200 mm) sammen med de PeppermintStick ™ phosphoprotein molekylvægtstandarder (Invitrogen, USA). I alle eksperimenter blev GC og parrede kontrolprøver udføres samtidigt. Alle 2-DE-geler blev udført i dobbeltbestemmelse.

Proteinerne på de 2-DE-gelerne blev visualiseret under anvendelse SYPRO® Ruby Gel Stain (Invitrogen, USA) ifølge producentens anbefalinger. Billeder af geler farvet med SYPRO® Ruby blev scannet med en 582 nm excitation og et 610 nm 30 bandpass emission filter på en Typhoon Trio imager (GE Healthcare, USA). For spot udskæring og efterfølgende massespektrometrianalyse blev gelerne visualiseret med Coomassie Brilliant Blue G250-farvning.

Billedanalyse og spot identifikation

Gel billeder blev analyseret med PDQuest Avanceret software version 8.0 (Bio -Rad, USA), ifølge fabrikantens protokol. Automatisk detektering stedet i hver gel blev verificeret ved visuel inspektion. Nogle pletter blev anvendt som landmærker at justere billederne. De spot intensiteter blev normaliseret til at udligne de samlede tætheder af hver gel billedet ved hjælp af Local regressionsmodellen. Normaliseret protein spot mængder i de proteomer blev sammenlignet blandt eksperimentelle grupper

Vi skabte to sæt af analyser til at identificere differentielt udtrykte spots:. (1) sammenligning af protein-ekspression mellem tumor og matchet kontrol ved hjælp af parret t-test; (2) sammenligning af protein-ekspression blandt kontrolprøver, GC uden lymfe-node metastase, og GC med lymfe-knude metastaser hjælp envejs variansanalyse for uafhængige prøver (en-vejs ANOVA). Desuden blev post-hoc sammenligninger udført med Tukey test for normalfordelte variable og med Spil-Howell for fordelinger, hvor ens varianser ikke kunne antages. De parametriske test blev udført med bootstrapping, en resampling metode. Den bootstrapping metode [22] indeholder en kritisk indstillet p-værdi, der kontrollerer et type I fejl (falsk positiv), reducerer over-fit bias og validering af nøjagtigheden skøn. Den bootstrapping teknik kan give en mere præcis og mindre konservativ familywise fejlprocent (FWER) end standardmetoder (fx Bonferroni tilpasning) for multicomparison analyser [23]. Vi udførte alle analyserne til at identificere forskelligt udtrykte proteiner baseret på 1000 bootstrap prøver. I alle analyser, konfidensintervallet (CI) var 95% og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

For proteinidentifikation ved massespektrometri, vi filtreret ud signifikante pletter, der udgør en fold ændring under 1,5-fold i tætheden mellem to forsøgsgrupper. Disse pletter blev observeret i mindre end 30% af prøverne i en gruppe [24].

massespektrometrianalyse

Pletterne af interesse blev manuelt skåret til efterfølgende massespektrometri analyse [25]. Desuden blev tomme gel stykker fra en spot-fri region, og reference- pletter (kendte markørproteiner fra 2-DE) skåret, tjente som kontroller for trypsin fordøjelse, og blev kørt parallelt med protein pletter af interesse. Efter affarvning og vask blev gelpartiklerne udsat for in-gel fordøjelse med 20 ng /pl trypsin Gold (massespektrometri Grade, Promega Corporation, USA) i 25 mM ammoniumbicarbonat ved 37 ° C natten over. Fordøjede peptider blev genvundet, placeret i en Speed-vac centrifuge indtil tør, og blev rekonstitueret i 15 pi 0,1% myresyre i vand. Peptidblandingen blev analyseret ved anvendelse C18 ultra-væskechromatografi (UPLC, NanoAcquity, Waters, USA) kombineret med ESI-kvadrupol TOF massespektrometer (ESI-QTOF Ultima, Waters /Micromass, USA). Gradienten var 0-80% acetonitril i 0,1% myresyre i løbet af 20 eller 10 min. Alle MS /MS-spektre blev søgt mod IPIhuman 379 databasen ved hjælp MASCOT søgemaskine (Matrix Science), accepterer man savnede tryptisk spaltning og carbamidomethyl (C) som fast modifikation og oxidation (M) som variable modifikationer. Peptid tolerance var ± 0,1 Da og MS /MS tolerance var ± 0,1 Da. Højeste identifikation tillid havde statistisk signifikant søgning scores og protein identifikationer var baseret på minimum 2 peptid hits.

Bioinformatik analyse

De identificerede proteiner (fra kun de steder, hvor en protein blev identificeret) var klassificeres i grupper efter subcellulær rumopdeling, biologisk proces, og molekylær funktion baseret på de oplysninger kommenteret i Gene Ontology (GO) Consortium databaser (https://www.geneontology.org/). Denne klassifikation analyse blev udført under anvendelse af DAVID funktionelle annotation værktøj (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [26]. Det kromosomale placering af identificerede proteiner blev åbnet ved hjælp BioMart data mining værktøj direkte fra Ensembl database (https://www.ensembl.org/biomart/martview).

PANTHER-systemet (www.pantherdb.org/) , MetaCore software (GeneGo Inc.) og opfindsomhed Pathways Analyse 9.0 (IPA, Ingenuity Systems Inc.) blev anvendt til pathway, netværk, og funktionelle analyser af differentielt udtrykte proteiner. Alle indberettede stier og biologiske processer er anført i henhold til deres GO berigelse score, som de software-pakker som -log (p-værdier) og med en falsk Discovery Rate (FDR) på 0,05%

Den ukontrollerede clustering analyse. blev udført ved hjælp af Pearsons korrelation af de normaliserede (z-score) værdier for alle væsentlige differentielt udtrykte proteiner (unikt id ved plet) af 30 prøver i analysen sæt. Heat maps blev genereret ved hjælp af Heatmap bygherre (https://ashleylab.stanford.edu/tools_scripts.html) til at arrangere protein udtryk profiler og prøver på grundlag af deres lighed. Hver farvet celle på todimensionale kort repræsenterer proteinekspression værdi af prøven. Stadig positive værdier er angivet med røde af stigende intensitet og i stigende grad negative værdier af greens af stigende intensitet. Dendrogrammer på toppen af ​​zonekort viser gruppering af prøver og på siden af ​​klyngedannelse ved protein udtryk.

ENO1 og HSPB1 udtryk

protein og mRNA anvendes til ENO1 og HSPB1 ekspression analyser blev oprenset samtidig med proteinet prøve, som anvendes 2-dE-gelerne.

i western blot-analyse, reduceret protein (20 ug for ENO1 og 30 ug til HSBP1) af hver prøve blev separeret på 12,5% homogen SDS PAGE gel og elektro-blottet på en PVDF-membran (Hybond-P, GE Healthcare, USA). PVDF-membranen blev blokeret med phosphatbufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20, 5% fedtfattig mælk og inkuberet natten over ved 4 ° C med tilsvarende primære antistoffer til anti-ENO1 (sc-100.812, 1:3000, Santa Cruz Biotechnology, USA ), anti-HSBP1 (sc-13132, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), og anti-ACTB (Ac-74, 1:3000, Sigma-Aldrich, USA). Efter omfattende vask blev et peroxidase-konjugeret sekundært antistof inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Immunoreaktive bånd blev visualiseret ved hjælp af Western blotting Luminol reagens og billederne blev erhvervet ved hjælp af en ImageQuant 350 digitalt billede-system (GE Healthcare, Sverige). ACTB blev brugt som en belastning henvisning kontrol.

For RT-qPCR-analyse, blev den komplementære DNA syntetiseret ved hjælp High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems, Polen) i henhold til fabrikantens protokol. Alle realtid RT-qPCR assays blev udført tre gange for både target gen (

ENO1

: Hs00361415_m1;

HSPB1

: Hs03044127_g1, Applied Biosystems, USA) og interne kontroller (

ACTB

: Hs03023943_g1;

GAPDH

: Hs99999905_m1, Applied Biosystems, USA) ved hjælp af primere og TaqMan prober. Relativ kvantificering (RQ) af genekspression blev beregnet ifølge Pfaffl metoden [27]. En kontrolprøve blev udpeget som en kalibrator af hver parret tumor.

Statistisk analyse af ENO1 og HSBP1 udtryk data

Vi først evalueret den normale fordeling af alle data ved hjælp af Shapiro-Wilk normalitet test bestemme efterfølgende anvendelse af passende tests for statistisk sammenligning.

ENO1

mRNA-niveauer og HSPB1 udtryk data blev ikke normalfordelte og blev omdannet (z-score) til analyse. Parret t-test blev udført for at sammenligne middelværdien af ​​ENO1 og HSPB1 proteinekspression mellem kontrol- og GC-prøver. Foreningerne mellem klinisk-patologiske parametre og gennemsnittet af ENO1 og HSPB1 udtryk blev vurderet ved hjælp T-test for uafhængige stikprøver. Chi-square test (χ

2) blev også anvendt til at vurdere forholdet mellem udtryk data og klinisk-patologiske faktorer. Korrelationen mellem ENO1 og HSPB1 mRNA og proteinekspression (Western blot og 2-DE-analyser) blev analyseret ved Spearman test. I alle analyser, CI var 95% og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater og Diskussion

proteomiske analyse af gastrisk væv

Vi har analyseret proteom af 15 noncardia GC-prøver – 6 uden lymfeknudemetastaser og 9 med lymfeknudemetastaser – og 15 matchede kontrol væv (tabel 1). Under anvendelse af 2-DE med pI området 3,0-10 og molekylær mellem 10 kDa og 120 kDa, blev omkring 1000 pletter klart påvist ved gel og efterfølgende analyseret for differentiel proteinekspression. Figur 1 viser repræsentative gel billeder med pletter og deres protein-id. Nogle proteiner blev afspejlet af flere pletter sandsynligvis på grund af posttranslationel modifikation, der fører til forskydninger i 2-DE-gel. Detaljer af proteinet identifikationer, teoretisk pI værdi, molekylvægt, protein score, sekvensdækning, antallet af matchede peptider, såvel som gennemsnitlige relative ændringer og p-værdier er vist i supplerende tabeller S1 og S2. Disse tabeller viser også, hvilke proteiner der tidligere blev observeret i GC proteom undersøgelser.

Proteiner blev løst over pI intervallet 3-10, efterfulgt af 12,5% SDS-PAGE og farvet med SYPRO® Ruby. De identificerede proteiner, der viste ændrede udtryk betydeligt i gastrisk carcinogenese er mærket med de respektive protein-id’er.

Selv om nogle proteom-baserede undersøgelser, der tidligere blev udført i humane primære gastriske tumorer, til vores viden, kun tre studier fokusere på noncardia GC [28], [29], [30]. De fleste GC proteom undersøgelser identificerede differentielt udtrykte proteiner baseret udelukkende på en fold skift mellem to betingelser [24], [28], [30], [31], [32], [33], [34], [35]. Andre tidligere GC proteom undersøgelser udført statistiske analyser at sammenligne proteinekspression mellem grupperne [29], [36], [37], [38], [39], men uden styring af type I (falsk positiv) fejl. Det er interessant at bemærke, at vi sammenlignede protein profilering af tumorer og ikke neoplastiske prøver under anvendelse parametriske tests med bootstrapping for differentielt udtrykte proteinidentifikation. De resampling metoder, der almindeligvis anvendes i microarray undersøgelser [40], er blevet brugt til at lave p-værdireguleringer for flere testprocedurer, der styrer FWER og tage hensyn til afhængighed struktur mellem teststørrelser [41]. Målet er at skabe mange sæt bootstrap prøver ved resampling med udskiftninger fra de originale data [22].

Sammenligningen af ​​tumor og kontrolprøver af parret T-test og brug af bootstrapping afslørede 133 pletter, blev væsentligt ændret med mere end 1,5 gange ændring. Efter en Mascot database søgning ved hjælp af de overtagne MS-data, blev 97% af de pletter identificeret. Blandt disse pletter, blev 18% identificeret med mere end ét protein. Analyserne af pletter med en unik identificerede proteiner viste, at 33 pletter af 26 proteiner var opreguleret og 72 af 56 proteiner blev nedreguleret i GC-prøver sammenlignet med ikke-neoplastisk væv.

Sammenligningen af ​​tumor og kontrolprøver ved envejs ANOVA viste 143 differentielt regulerede pletter og 98% af disse blev identificeret. Vi observerede, at 94 pletter var almindelige i parret t-test og ANOVA analyser. Hvad angår de pletter med en unik identificeret protein, observerede vi, at 54 proteiner blev nedreguleret og 9 blev opreguleret i tumor uden lymfeknudemetastaser i forhold til kontrolprøver. Vi observerede også, at 68 proteiner blev nedreguleret og 15 blev opreguleret i tumorer med lymfeknudemetastaser sammenlignet med kontrolprøver. Vi har registreret 38 proteiner udtrykkes differentielt mellem ikke-neoplastiske prøver og tumorer uafhængig af lymfeknuderne status.

Fjorten proteiner præsenteres væsentlige ændringer mellem tumorer med og uden lymfeknude metastaser (figur S1). Udtrykket af NNMT konstant steget, mens ATP5H og UQCRFS1 viste en løbende reduktion fra ikke-neoplasi til tumorigenese med lymfeknude metastaser. NNMT blev tidligere rapporteret med forhøjet udtryk i GC sammenlignet med ikke-neoplastiske prøver [24], [42]. Den reducerede ekspression af ATP5H og UQCRFS1 kan skyldes en lavere afhængighed af oxidativ phosphorylering til energiproduktion, grundet Warburg effekt i fremskreden tilstand (se bioinformatik resultater nedenfor).

Funktionel klassifikation af differentielt udtrykte proteiner i GC

GeneGo biomarkør analyse viste, at de fleste af de identificerede proteiner forudsagt markører for gastrointestinale sygdomme, herunder GC (figur 2A, repræsentant for tumor versus nontumor sammenligning). Dette understøtter de aktuelle data og indikerer, at resultaterne bør undersøges nærmere for at identificere eller validere klinisk relevante mål for diagnose og /eller prognose af GC.

A) Berigelse af GeneGo sygdom ved hjælp af forskelligt regulerede proteiner mellem neoplastiske og matchede ikke neoplastiske prøver; B) Cellular rum, C) Biologiske processer, D) Molekylære funktioner og E) Kromosomal placering af alle identificerede proteiner.

De identificerede proteiner blev inddelt i forskellige klasser baseret på funktionel information tilgængelig. De fleste af de identificerede proteiner var intracellulære organel-proteiner og var en del af membranbundne organeller, især mitokondrierne (figur 2B). Disse proteiner er involveret hovedsagelig i cellulære metaboliske processer og oxidation reduktion (figur 2C). Sammenligningen af ​​tumorer med lymfeknudemetastaser og kontrolprøver afslørede transport og etablering af placering som berigede biologiske processer. Dette blev ikke observeret i sammenligningen af ​​tumorer uden lymfeknudemetastaser og kontrolprøver. Oxidoreduktasen aktivitet efterfulgt af coenzym bindingsaktivitet var de vigtigste molekylære funktioner involveret i gastrisk carcinogenese (figur 2D) proteiner.

Vedrørende kromosomal placering, de fleste af proteinerne kodet af gener lokaliseret på kromosom 1 (11 %), kromosom 19 (8%), og kromosom 11 (7%) (figur 2E). Komplekse karyotyper af gastriske tumorer fortrinsvis involvere disse kromosomer, samt kromosomer 3, 6, 7, 8, 13 og 17 (se gennemgang [9]). Gevinst og tab af kromosom regioner af en, 19 og 11 blev tidligere rapporteret af vores forskningsgruppe i GC prøver [43], [44]. Således kan disse kromosomer indeholder flere loci med dosering følsomme gener.

Netværk analyse af differentielt udtrykte proteiner i GC

Vi har foretaget en omfattende beregningsmæssige analyse af væv proteom data til at opdage veje og netværk involveret i gastrisk onkogenese og progression. Tabel 2 viser de væsentligste kanoniske veje ved hjælp af databasen Ingenuity Pathway Analysis (IPA). De væsentligste kanoniske veje i den gastriske carcinogenese proces var involveret i energistofskiftet veje herunder mitokondriel dysfunktion, pyruvat stofskifte, oxidativ fosforylering, citrat cirkel, og glykolyse /gluconeogenese. Den foreliggende undersøgelse viste et stort antal differentieret udtrykte metaboliske proteiner, der ikke er indberettet før i noncardia gastrisk carcinogenese (tabel S1 og S2).

Vores proteomisk analyse afslørede, at flere enzymer citrat cyklus ( Krebs cyklus) og oxidativ fosforylering blev nedreguleret i GC celler. Disse data viser mulige ændringer i mitokondrier funktion og et skift i energiproduktionen i de nuværende GC celler, hvilket tyder på Warburg effekten [45]. Prolifererende tumorceller omprogrammere deres metaboliske veje til at generere energi, og dermed støtte en hurtig celledeling under stressende metaboliske tilstande, som er karakteristiske for den unormale tumormikromiljøet [46]. Selv under normale iltkoncentration, tumorceller skifte fra ATP generation gennem oxidativ phosphorylering til ATP generation gennem glycolyse omdanner mest indgående glucose til lactat [45]. Det er blevet foreslået, at meget aktive glycolysen tilvejebringer en biosyntetisk fordel for tumorceller. Glycolyse giver nok metaboliske mellemprodukter ved at undgå oxidationen af ​​glucose, hvilket er afgørende for syntesen af ​​makromolekyler, såsom lipider, proteiner og nukleinsyrer, under celledeling [47], [48], [49].

lactat dehydrogenase (LDH) og pyruvatdehydrogenase (PDH) -komplekser styrer metabolismen af ​​pyrodruesyre syrer, transformering til enten mælkesyrer eller acetyl-CoA derefter indtaste citrat cyklus. Nedreguleringen af ​​underenheder af LDH og PDH komplekser antyder en reduktion i pyruvat flux ind i citrat cyklus og et fald i hastigheden for oxidativ phosphorylering og oxygenforbruget, styrke den glycolytiske fænotype. Andre nedreguleret proteiner, såsom LiPF og GOT1, fremhæve aktivering af andre metaboliske veje med forringelse af citrat cyklus og oxidativ fosforylering. Adskillige metaboliske ændringer, vi observerede i noncardia GC blev også beskrevet af Cai

et al.

[36] i en Cardia GC proteomisk undersøgelse, tyder på, at disse metaboliske ændringer er ikke specifikke for en GC undertype baseret på tumor placering.

Ved PANTHER-systemet, den mest markant beriget vej er p53 pathway observeret i sammenligningen mellem tumor og kontrolprøver. Udover sin funktion i DNA beskadigelse respons og apoptose, p53 er også en regulator af cellemetabolisme [50]. p53 fremmer oxidativ phosphorylering [51] og også inhiberer glycolytiske vej ved opregulering af ekspressionen af ​​TP53-induceret glycolyse og apoptose regulator (Tigar) [52]. Derfor tabet af p53 bidrager til erhvervelse af glykolytisk fænotype. Tabet af

TP53

locus er et almindeligt fund i GC af personer fra det nordlige Brasilien [53]. Desuden 20% af den analyseret ved 2-DE GC præsenteret p53 immunreaktivitet (data ikke vist). P53 immunreaktivitet sædvanligvis afhænger akkumulering af muterede proteiner i cellen, hvilket fører til en længere halveringstid [54].

De øverste netværk af molekylære interaktioner og funktioner blev også identificeret ved anvendelse af IPA-softwaren (Figur S2 ; tabel 3; Subnetmaske fra MetaCoreTM analyse blev ikke vist). Vi viste flere forskelligt regulerede proteiner involveret i cellulær montering og organisation og i inflammatoriske processer. Den cellulære samling og organisation var den hovedsagelig beriget netværk observeret i sammenligningen mellem kontrol og tumorer med lymfeknude metastaser.