PLoS ONE: ARP2, en roman proapoptotiske protein udtrykt i Epithelial Prostata Cancer LNCaP Celler og Epithelial ovarie CHO transformerede celler

Abstrakt

Neoplastiske epitelceller generere de mest aggressive former for kræft som dem, der findes i lunge, bryst, colon, prostata og ovarie. Under fremskredne stadier af prostatacancer, er epitelceller associeret til udseendet af androgen-uafhængige tumorer, en apoptotisk-resistent fænotype, som i sidste ende overgrows og fremmer metastatiske begivenheder. Vi har tidligere identificeret og elektrofysiologisk karakteriseret et nyt Ca

2 + -permeable kanal aktiveres under apoptose i androgen-uafhængige prostata epitelial cancercellelinie, LNCaP. Desuden har vi rapporteret for første gang kloning og karakterisering af denne kanal-lignende molekyle navngivet apoptose reguleret protein 2 (ARP2) forbundet med et dødbringende tilstrømning af Ca

2+ i

Xenopus

oocytter. I den foreliggende undersøgelse LNCaP-celler og kinesisk hamster-ovarieceller (CHO cellelinie) transficeret med

arp2-

cDNA induceres til at undergå apoptose, der viser en betydelig indvirkning på cellelevedygtighed og aktivering af caspaser 3 og 7 i forhold til serum berøvet dyrkes celler og ionomycin behandlede celler. Den subcellulære lokalisering af ARP2 i CHO-celler undergår apoptose blev undersøgt under anvendelse af konfokal mikroskopi. Mens apoptose skrider frem, ARP2 oprindeligt lokaliseret i peri-nuklear region af celler migrerer med hen mod plasmamembranen region. Baseret på de foreliggende resultater og vore tidligere undersøgelser, er det faktum, at ARP2 udgør et nyt kationkanal understøttet. Derfor ARP2 bliver et værdifuldt mål at modulere tilstrømningen og koncentration af calcium i cytoplasmaet i epitelcancerceller viser en apoptotisk-fænotype under indtræden af ​​en apoptotisk begivenhed

Henvisning:. Mas-Oliva J, Navarro -Vidal E, Tapia-Vieyra JV (2014) ARP2, en roman proapoptotiske protein udtrykt i Epithelial Prostata Cancer LNCaP Celler og Epithelial ovarie CHO transformerede celler. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10,1371 /journal.pone.0086089

Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italien

Modtaget: 15. marts 2013; Accepteret: 11. december 2013; Udgivet: 22 Jan 2014

Copyright: © 2014 Mas-Oliva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CONACYT (Grant 141.588) og DGAPA-UNAM (Grant IN-205.711 /2) tildeles Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal blev støttet af legater fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, (CONACYT) (251.040). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Carcinomer der finder deres oprindelse i epitelceller er den mest almindelige form for kræft hos voksne og der fyldes op til 80-90% af alle kræfttilfælde, herunder dem, der findes i lunge, bryst, prostata, æggestok og tyktarm. Epitelceller blandt andre lokaliseringer, line indre hulheder og danner foring af glandulær væv. Prostata består hovedsagelig af epitelceller og interstitielle stromaceller der kommunikerer indbyrdes og kontrol, ikke kun den normale udvikling af kirtlen, men også indtræden af ​​neoplastisk vækst [1]. Prostatacancer er en af ​​de hyppigst diagnosticerede noncutaneous cancere. De indledende stadier af prostatakræft progression afhænger androgener, der øger proliferation og inhiberer apoptose. Derfor har androgen-deprivation terapi været den store behandlingsforløb i recidiverende og metastatisk prostatacancer. Prostata epitelceller, der primært luminal omfatter en blanding af flere celletyper, herunder basal og neuroendokrine celler [2], [3], mens hosliggende stromaceller sammensat af en blanding af fibroblaster, nerve, og glatte muskelceller [2], [ ,,,0],4], [5], intervenere i udviklingen af ​​epitelcancerceller og påvirke deres reaktion på hormoner [6]. Under processen med carcinogenese, selv om antallet af neuroendokrine celler stiger i de senere faser prostatacancer, epitelceller, der repræsenterer den vigtigste tumorcelletype er i højere grad ansvarlig for androgen-ufølsom celleproliferation [7]. Disse celler præsenterer en apoptose-resistent fænotype, ikke undergår apoptose som respons på fysiologiske stimuli [8], [9], og derfor reagerer ikke på konventionelle kemoterapeutiske midler [10] – [13].

mellemtiden, epitelial ovariekræft har vist sig at være den sjette mest almindelige kræftform hos kvinder med de højeste satser bliver observeret i de nordeuropæiske lande og USA, mens de laveste priser findes i udviklingslandene. På grund af det faktum, at patogenesen af ​​epitelial ovariecancer er dårligt forstået, har tidlig påvisning hovedsagelig været mislykket og nye terapeutiske tilgange knappe. Da epiteliale ovariecancerceller også har vist sig at udvise en apoptose-resistent fænotype på grund af overekspression af anti-apoptotiske gener, såsom Bcl-2, Bcl-xl og Survivin [14], opdagelsen og aktivering af nye pro-apoptotiske veje har været en vigtig strategi for kontrol proliferation og vækst af denne transformerede celletype [15]

Apoptose, en type programmeret celledød [16] – [20]., har vist sig at være af afgørende betydning i cellehomeostase, fosterudviklingen, flere sygdomme, såsom cancer [21], [22]. Apoptose aktiveres ved celle-type specifikke mekanismer [16], [22], og forekommer i flere stadier [19], [21], [23], [24]. Den første fase er forbundet med interne eller eksterne stimuli, mens det andet omfatter signaltransduktionsmekanismer. Den tredje etape udgøres af udførelse mekanismer, som involverer den proteolytiske aktivitet af caspaser, en biokemisk base for den apoptotiske fænotype [25] – [28], og endelig det fjerde trin, der svarer til kondensation af nukleart chromatin, nuklear fragmentering og fagocytose af apoptotiske organer ved tilstødende celler eller makrofager [24], [29]. Samlet set en vedvarende stigning i [Ca

2+] i er blevet vist at aktivere en række af cytotoksiske mekanismer associeret med apoptose i forskellige celletyper [30], [31]. Da apoptose er blevet foreslået at være en mekanisme, der regulerer tumorvækst, modulering af apoptose aktiverende mekanismer er derfor blevet betragtet som et værdifuldt mål at kontrollere spredning og vækst af epitelcancerceller [32] – [36]. I denne henseende afhængigt af tilstanden af ​​plasmamembranen af ​​transformerede celler og mængden af ​​ekstracellulært calcium, der kommer ind i cytoplasmaet, opnås en fin balance mellem indtræden af ​​en apoptotisk begivenhed og /eller aktivering af en nekrotisk død pathway [37 ], [38]

Som svar på to forskellige inducere af apoptose.; ionomycin og serum deprivation, har vi tidligere vist baseret på elektrofysiologiske fund, aktiveringen af ​​en Ca

2+ gennemtrængelig, ikke-selektiv kationkanal i prostata epitelial LNCaP-celler [15]. For yderligere at undersøge disse resultater, en serie af Ca

blev analyseret 2 + -permeable kanaler til udtryk under apoptose [15], [39] – [41]. Under forløbet af disse undersøgelser, to cDNA’er,

arp1

ARP2

, svarende til to molekyler syntetiseres under apoptose induceret af serum deprivation, blev klonet. Når

ARP2

mRNA blev injiceret i

Xenopus laevis

oocytter, ARP2 blev induceret efterfulgt af en tilstrømning af Ca

2+ gennem cellemembranen og induktion af apoptose [40].

Under hensyntagen til, at de fleste epitelceller deler væv organisation karakteristika samt mekanismer involveret i tumorogenesis [42], den nuværende undersøgelse viser, at

ARP2

cDNA transfektion udføres med de originale epitelial prostatacancerceller (LNCaP-cellelinje), hvorfra det pro-apoptotiske calciumkanal blev beskrevet, fremmer celledød via en apoptotisk proces, når cellelevedygtighed og caspaser aktivering måles. For at gøre klart, at de apoptotiske initierings- og succesraten mekanismer deles af forskellige epitelceller, har vores undersøgelse blevet udvidet til transfektion med

ARP2

cDNA af epiteliale ovarie transformerede celler (CHO-cellelinje). De viste resultater i den foreliggende undersøgelse understøtter vores tidligere resultater og holde op den tanke, at ARP2, en hidtil ukendt calciumkanal placeret i plasmamembranen i celler under et arrangement, der kan bringe cellelevedygtighed og ville føre til apoptose, kan betragtes som et værdifuldt nyt mål at bekæmpe væksten af ​​de mest aggressive epithelialkræftcelletyper.

Materialer og metoder Salg

Materialer

den humane androgen-ufølsom prostatacancer-cellelinie, LNCaP, og kinesisk hamster ovarie cellelinje, CHO (

Cricetulus griseus

), blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), hvor de regelmæssigt kontrolleres af genotypiske og fænotypiske tests. Original LNCaP cellelinier modtaget fra ATCC inkluderet androgen-sensitive og androgen-ufølsom celler. I løbet af deres anvendelse langs år, har de fremlagt differentierede reaktioner på vækst afhængig af tilstedeværelsen eller fraværet af androgen-analoger. Alle reagenser til celledyrkningsmedier blev opnået fra Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). Vektorer, der blev brugt inkluderet: pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO-vektoren (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ

vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), og pEGFP-N1 vektor (Clontech, Mountain View, CA, USA). Lipofectamin og Fura-2 /AM blev modtaget fra Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). Bis-acrylamid, Nonidet-P40, ethidiumbromid, aprotinin, phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), benzamidin, dimethylsulfoxid (DMSO), blev ionomycin og dithiothreitol (DTT) opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA). r

Tth

DNA-polymerase XL blev opnået fra Roche Molecular Systems (Branchburg, NJ, USA) og deoxyribonucleotid dNTP’er blev opnået fra Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Tyskland).

Plasmid konstruktion for ARP2 ekspression

til amplifikation af

ARP2

cDNA, 20 picomol af en sense-primer (5′-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 ‘) og en antisense degenererede primer, som svarer til en konserveret region af trp familie af proteiner (5’-TGY-TCK-MGC-AAA-YTT-CCA-YTC-3 ‘) blev anvendt [40], [43] – [45]. PCR-reaktioner også inkluderet 10 ng /mL lineariseret pCR 4Blunt-TOPO-ARP2 plasmid, 10 × buffer, 25 mM MgCl

2 og 10 mM dNTP’er. Følgende cykler blev udført: 94 ° C i 5 min, 30 cyklusser ved 94 ° C i 45 s, 65 ° C i 45 s, 72 ° C i 2 minutter, og en endelig cyklus ved 72 ° C i 10 min. PCR-produkter blev separeret og visualiseret i 1% w /agarosegeler indeholdende ethidiumbromid, og bånd blev udskåret og oprenset ved anvendelse af en koncert gel ekstraktionssystem (Gibco, Gaithersburg Maryland). PCR-produkter blev klonet ind i pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO-vektor derefter opformeret i

E. coli

DH5a kompetente celler (American Type Culture Collection, Manassas VA, USA). Den opnåede plasmid blev opkaldt pcDNA3.1 ARP2 V5-His. CDNA, der koder for forbedret grønt fluorescerende protein (

eGFP

) blev derefter indsat mellem

Xhol

og

Xbal

steder i pcDNA3.1 ARP2 V5-His-plasmidet, hvorved der genereres af pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His plasmid.

Cellekultur og transfektioner til transient ekspression

Androgen-ufølsomme LNCaP-celler og CHO-celler blev dyrket i RPMI 1640 og DMEM /F -12 medium hhv. Disse dyrkningsmedier blev også suppleret med 10% vol /vol føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 0,2% vægt /volumen natriumhydrogencarbonat, og 1% v /v penicillin-streptomycin. Kulturer blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2, indtil cellerne nåede 60-70% konfluens. Apoptose blev induceret ved at inkubere celler med dyrkningsmedium berøvet FBS i forskellige tidsrum. Ionomycin blev fremstillet som 5 mM stamopløsninger i DMSO. Lonomycin i en slutkoncentration på 10 uM anvendtes til CHO- og LNCaP-celler kulturer og inkuberet i forskellige tidsrum. Begge cellelinier blev transficeret med pcDNA3.1 ARP2 V5-His (transfektionseffektiviteten: TE /LNCaP 32%; TE /CHO 46%) og pcDNA3.1 /V5-His-TOPO

lacZ Salg plasmider (TE /LNCaP 43%; TE /CHO 54%) for at inducere transient ekspression af ARP2-V5 og β galactosidase-V5 hhv. For normalisering af cellelevedygtighedsassays blev begge cellelinier også transfekteret med plasmid pcDNA3.1 V5-His (uden

ARP2

cDNA) (TE /LNCaP 68%, TE /CHO 80%). CHO-celler blev transficeret med pEGFP-N1 (TE 82%) og pcDNA3.1 ARP2-eGFP V5-His plasmider (TE 50%) til opnåelse eGFP og ARP2-eGFP ekspression hhv. Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine 2000 som beskrevet i pcDNA3.1 /V5-His TOPO TA Expression Kit insert fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

[Ca

2+] i målinger i hele cellesuspensioner ved brug Fura-2

Androgen-ufølsomme LNCaP-celler og CHO-celler dyrket som tidligere beskrevet, blev fjernet fra dyrkningsskåle ved hjælp høst puffer indeholdende 10 mM HEPES-bufret 0,9% saltvand plus 0,05 EDTA, pH 7,4 ifølge Hirst et al. [46]. Cellerne anbringes i suspension, og baseret på samme metode sedimenteret ved 500 ×

g

i en lav hastighed centrifuge i 3-5 min og skyllet to gange med Krebs HEPES buffer indeholdende 140 mM Na

+, 4.7 mM K

+, 1,3 mM Mg

2+, 125 mM Cl

-, 25 mM HCO

3, 1,2 mM H

2PO

4, 1,2 mM SO

4

2-, 10 mM glucose, 0,1 mM EGTA og 10 mM HEPES, pH 7,4. Supernatanter blev fjernet og pellets resuspenderet med Krebs HEPES puffer. En Fura-2 /AM (3 uM) belastningstid på 30 minutter blev udført under anvendelse Krebs HEPES puffer ved 37 ° C i mørke. Efter denne procedure er afsluttet, blev celler sedimenteret ved 500 ×

g

, resuspenderet i Krebs HEPES puffer og inkuberes yderligere i 20 minutter ved stuetemperatur for at tillade de-esterificering af Fura-2 /AM.

efter behandling blev celler to gange sedimenteret ved 500 ×

g

i 3 min og resuspenderes i Krebs HEPES-Ca

2+ buffer (udelade EGTA og tilføjet på 2,5 mM Ca

2+ ). Fura-2 /AM blev fremstillet som en stamopløsning (1 mM) ved opløsning i dimethylsulfoxid, og alikvoter (10 pi) opbevaret ved -20 ° C indtil brug.

Cellesuspensioner blev holdt på is og for hvert forsøg placeret i kvartskuvetter og inkuberet i 2 minutter ved 37 ° C før målingerne blev udført. En SLM-Aminco spektrofluorometer (Rochester, NY) blev anvendt ved hjælp af en excitation forhold på 340/380 nm og maksimale fura-2 fluorescens emissionsværdier ved 510 nm. Kalibrering af fluorescens blev udført ved tilsætning af 0,1% Triton X-100 til frembringelse af cellelyse befriende fura-2 ind i Ca

2+ eller EGTA holdige medier. Maksimale og minimale fluorescens værdier blev erstattet i Grynkiewicz, Poenie Tsien ligning til at beregne [Ca

2+] i [47].

Western blot-analyse

Transient ekspression af ARP2 og β-Gal blev opnået i LNCaP-celler og CHO-celler ved transfektion med

ARP2

cDNA og

lacZ

cDNA hhv. Disse proteiner blev udtrykt som fusionsproteiner med V5-epitopen ved carboxylterminalen af ​​hver (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev dyrket i 16, 24, 48 og 72 timer, derefter høstet og lyseret med følgende puffer: 10 mM Tris-HCI (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF og 5 mM benzamidin. Protein kvantificering blev udført under anvendelse af en bicinchoninsyre-metoden (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA), og 20 ug totalt protein blev elektroforesebehandlet i 10% SDS-PAGE geler. Proteiner blev derefter elektroblottet på 0,45 um nitrocellulose membraner (Trans-Blot Transfer medie BIO-RAD, Hercules, CA, USA), derefter blokeret i 1 time ved 37 ° C med en “mættende” opløsning [tris-bufret saltvand (TBS) ( pH 7,6), 20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 100 mM NaCl, 0,1% volumen /volumen Tween-20 og 2,5% vægt /volumen skummetmælk]. Primær anti-V5 monoklonalt antistof (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) blev fortyndet i den samme mættende opløsning (1:5000) og inkuberet med membraner til 12 timer ved 4 ° C. Efter membraner blev vasket tre gange med mættende opløsning ved 37 ° C (15 minutter hver vask) blev membranerne inkuberet ved 37 ° C i 2 timer med anti-muse-sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) fortyndet i mætning opløsning ( 1:5000). Membran blev derefter vasket med TBS /0,1% volumen /volumen Tween-20 tre gange i 15 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af en fjerde vask med TBS ved 37 ° C. Lige belastning blev verificeret ved at inkubere membranerne med anti β-actin-antistof (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Visualisering af antistofbinding blev opnået ved anvendelse af et forøget kemiluminescens (ECL) detektion kit (Pierce, Rockford, IL, USA) og eksponering af membraner til røntgenfilm (Kodak, Rochester, NY, USA).

3- ( 4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay

Ubehandlede celler blev opretholdt i dyrkningsmedium suppleret med serum (negativ kontrol), mens apoptotiske celler blev opnået ved serum afsavn (positiv kontrol). Celler (2 x 10

4 /brønd) blev udpladet i plader med 96 brønde og holdt i kultur i 16, 24, 48 og 72 timer. Derefter blev 30 pi MTT-stamopløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) tilsat til hver brønd til en slutkoncentration på 0,5 mg /ml reagens. Plader blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer for at tillade væksten af ​​formazankrystaller, som senere blev solubiliseret ved tilsætning af lysepuffer [20% SDS, 50% N, N-dimethylformamid (pH 3,7)]. Pladerne blev inkuberet i 12 timer, og absorbansværdier blev målt ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser. Levedygtighed i celler transficeret med plasmid pcDNA3.1-V5-His blev anset for normalisering af levedygtighed resultater af pcDNA3.1 ARP2 V5-Hans transfekterede celler. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange (n). The Student to-tailed

t-

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskelle med hensyn til kontrol. Data udtrykkes som gennemsnit X ± SEM og

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Symboler betegne:

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

s

0,001

trypan blue celleviabilitetstest

LNCaP-celler blev inkuberet i 16, 24, 48, 72, 96, og 120 timer, mens CHO-celler blev inkuberet i 16, 24, 48 og 72 timer. Celler blev farvet med 0,1% volumen /volumen trypanblåt derefter anbragt i Neubauer kamre. I alt 300 celler blev talt for hver prøve ved anvendelse af en Motic lyse felt optisk mikroskop. Levedygtighed celler transficeret med plasmid pcDNA3.1-V5-His blev anset for en normalisering af pcDNA3.1 ARP2 V5-Hans transfekterede celler. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange (n). The Student to-tailed

t-

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskelle med hensyn til kontrol. Data udtrykkes som gennemsnit X ± SEM og

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Symboler betegne:

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

s

0,001

aktivitetsmålinger af caspaser 3 og 7

CHO og LNCaP-celler (3 x 10

5 /brønd) blev udpladet og dyrket i 16, 24, 48 og 72 timer. Celler blev vasket med PBS, høstet og underkastet fire fryse-tø cykler i en lyseringsbuffer (10 mM HEPES (pH 7,0), 40 mM b-glycerophosphat, 50 mM NaCI, 2 mM MgC

2). Prøverne blev centrifugeret i 30 minutter ved 15 800

x

g. Proteinkoncentration for supernatanterne opsamlede blev bestemt under anvendelse af BCA-metoden (Pierce, Rockford, IL). Prøver (total protein, 20 ug) blev fortyndet i assaybuffer (50 mM HEPES, 10% saccharose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT) til et slutvolumen på 1000 pi. Assaypufferen blev også suppleret med Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluormethylcoumarin (Z-DEVD-AFC), et fluorogent substrat af caspaser 3 og 7, og prøver blev inkuberet i 10 minutter ved 30 ° C. Fluorescens blev målt ifølge en Molecular Probes protokol ved at anvende en luminescens-spektrometer. Excitationsbølgelængden var 365 nm, og emissionsbølgelængden var 505 nm. Den maksimale absorbans bølgelængde viste sig at være 488 nm. Fluorescens blev målt i cellefri ekstrakt blindprøver for at detektere signal-til-støj-forhold af prøverne. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange (n). The Student to-tailed

t-

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskelle med hensyn til kontrol. Data udtrykkes som gennemsnit X ± SEM og

s

0,05 blev betragtet som signifikant. Symboler betegne:

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

s

0,001

konfokal mikroskopi og differentiel interferens kontrast mikroskopi (DIC)

konfokal billeder blev opnået under anvendelse af en spektral FluoView FV 1000 laser scanning konfokal systemet (Olympus, Tokyo, Japan) fastgjort /interface med et Olympus IX81 inverteret lysmikroskop med 10 × og 40 × olie-nedsænkning mål. eGFP blev anslået ved 488 nm under anvendelse af en krypton /argon laser linje og udsendte fluorescens detekteret mellem 515 nm og 540 nm under anvendelse af et båndpasfilter. Laser operation blev udført ved lav effekt (97-99% dæmpning), der væsentligt reduceret fotoblegning og solskader til prøver. DIC mikroskopi billeder blev opnået ved hjælp af et Olympus IX81 mikroskop og en IX2-LWUCD kondensator med 10 × og 40 × mål. Konfokal og DIC billeder blev visualiseret, behandles og konverteres til TIFF formateret billeder ved hjælp af FV10-ASW 6.1 software (Olympus).

Resultater

ARP2 udtryk og cellernes levedygtighed i LNCaP celler

Western blot-analyser viser udtryk for ARP2-V5 i LNCaP celler først observeret 16 timer efter transfektion, med de højeste niveauer af udtryk opdaget 72 timer efter transfektion (figur 1A). Dette assay viser bånd med molekylvægte lavere end den for fusionsproteinet ARP2-V5 (54 kDa) detekteres 24, 48, og 72 h efter transfektion. Disse bands er sandsynligvis relateret til nedbrydningsprodukter af ARP2-V5 genereres under apoptose.

(A) Western blots opdaget udtryk for β-gal-V5 (112 kDa) og ARP2-V5 (54 kDa) i alt cellelysater. (B) Normalized cellelevedygtighed% af kontrollerne blev vurderet ved anvendelse MTT-assays med 2 x 10

4 celler dyrket i fravær af serum eller transficeret med

ARP2

cDNA. Levedygtighed af disse to behandlingsgrupper blev analyseret ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. (C) Normalized cellelevedygtighed% af kontrol analyseret ved anvendelse af en trypan fremgangsmåde blå-udelukkelse. Celler blev dyrket i fravær af serum eller transficeret med

ARP2

cDNA og analyseret ved 16, 24, 48, 72, 96, og 120 h tidspunkter. Middelværdier præsenteres (n = 3, X ± SEM),

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

p

. 0,001 sammenlignet med kontrolgrupper

Normaliseret cellernes levedygtighed% af kontroller af LNCaP celler dyrket i fravær af serum, samt LNCaP celler transficeret med

ARP2

cDNA , blev målt ved anvendelse MTT-assays. Cellelevedygtighed blev observeret at falde markant efter 16 timer, og en yderligere reduktion blev set ved 72 timer (figur 1b). Et fald i cellelevedygtighed ~63% blev observeret i

ARP2

cDNA-transficerede celler efter 72 timer, hvilket er højere i forhold til et fald ~23% i levedygtighed i LNCaP-celler dyrket i fravær af serum. Det er derfor meget sandsynligt, at androgen-ufølsom LNCaP celler i fravær af serum aktiverer apoptotiske mekanismer sent med hensyn til

ARP2

cDNA-transfekterede celler. Normaliseret levedygtighed celle% af kontrollerne blev også vurderet ved hjælp af den trypan metode blå eksklusion. En mild nedgang i levedygtighed blev opdaget inden for de første 24 timer til både eksperimentelle betingelser (figur 1C). Cellernes levedygtighed faldt yderligere til serum berøvet og

ARP2

cDNA-transficerede celler op til 120 t, med et fald på ~44% og ~42% i celle levedygtighed, henholdsvis.

ARP2 udtryk og cellelevedygtighed i CHO-celler

Western blot assays viser ekspressionen af ​​ARP2-V5 i CHO-celler først detekteres ved 16 timer efter transfektion og nåede de højeste niveauer 72 timer efter transfektion. Nedbrydning af ARP2-V5 (54 kDa) er vist med en lavere molekylvægt bånd detekteret mellem 48 og 72 timer efter transfektion, tyder på, at den apoptotiske begivenhed også finder sted i denne celletype på samme måde som tidligere vist for LNCaP-celler (figur 2A). Det er interessant at bemærke, at den forsinkede fremkomsten af ​​disse nedbrydningsprodukter, når CHO-celler sammenlignes med LNCaP-celler, kan være relateret til den kendsgerning, at CHO-celler udgør en fremragende model til ekspression af heterologe proteiner siden proteinnedbrydning holdes på et minimum.

(a) Western blots påvist ekspression af β-gal-V5 (112 kDa) og ARP2-V5 (54 kDa) i totale cellelysater. (B) Normalized cellelevedygtighed% af kontrollerne blev vurderet ved anvendelse MTT-assays med 2 x 10

4 celler dyrket i fravær af serum eller transficeret med

ARP2

cDNA. Levedygtighed af disse to behandlingsgrupper blev analyseret ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. (C) Normalized cellelevedygtighed% af kontrollerne blev vurderet ved hjælp af en trypan metode blå eksklusion. Celler blev dyrket i fravær af serum eller transficeret med

ARP2

cDNA og analyseret ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. Middelværdier præsenteres (n = 3, X ± SEM),

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

p

. 0,001 sammenlignet med kontrolgrupper

Under cellelevedygtighedsassays beskæftiger reduktion af MTT blev et konstant fald i levedygtighed observeret for CHO celler mellem 16 timer og 72 timer af kultur. Efter 72 timer, levedygtighed faldt med ~44% for serum berøvet celler, mens levedygtigheden af ​​

ARP2

cDNA-transficerede celler faldt med ~51% (figur 2B). Trypan levedygtighed blå celle assays viser ingen signifikante ændringer i CHO-celler observeret op til 48 timer efter serum deprivation. Imidlertid blev en drastisk nedgang i levedygtighed påvist efter 72 timers inkubation, hvilket antyder, at op til denne gang den apoptotiske begivenhed begyndt at påvirke integriteten af ​​plasmamembranen. For

ARP2

cDNA-transfekterede celler, blev der observeret et gradvist fald i levedygtighed mellem 16 og 72 timer efter transfektion. Procentdelen af ​​levedygtige celler for begge grupper på 72 timer var meget ens, med levedygtighed ~51% observeret for serum berøvet celler og ~53% levedygtighed observeret for

ARP2

cDNA-transfekterede celler (Figur 2C). Derfor ligner LNCaP-celler, vises celledød indeks for CHO-celler at være afhængig af niveauet af ARP2-V5-ekspression. Det er interessant at bemærke, at i tilfælde af

ARP2

cDNA-transficerede celler i sammenligning med serum udtømte celler, forskelle opnået mellem de to assays anvendes til at vurdere cellernes levedygtighed er sandsynlige relateret til det faktum, at kritiske metaboliske veje forbundet til et intracellulært calcium overbelastning og tab af intracellulære organel integritet påvirkes primært, før cellemembranen bliver beskadiget.

Fura-2 måling af cytosolisk frit Ca

2+ i LNCaP og CHO-celler

Da anvendelsen af ​​Fura-2 at måle ændringer i intracellulært calcium ved anvendelse af hele cellesuspensioner har været en af ​​de mest succesrige fremgangsmåder beregnet til dette formål blev LNCaP og CHO cellesuspensioner ladet med Fura-2 og [Ca

2+] i måles. Som vist i tabel 1, Fura-2 belastede kontrolceller udsat for ionomycin (10 uM) i nærvær af et calcium- buffer, fremstillet i en kort periode en stigning i [Ca

2+] i. Interessant, LNCaP og CHO

ARP2

transficerede celler viste også en øget [Ca

2+] i demonstrere en forbedret calcium permeabilitet i sammenligning med kontrol cellelinier. Selvom celler inkuberet i fravær af føtalt kalveserum også blev testet, udsivning af Fura-2 belastede celler var vigtigt og derfor forskelle mellem eksperimenter for store til at indgå i dette sæt af resultater.

Apoptose progression og aktivering af caspaser 3 og 7 i CHO og LNCaP-celler

caspaser 3 og 7 klassificeret som effektor-caspaser aktiveres af caspaser 8 og 9 (også kendt som initiatorer). Caspaser 3 og 7 har også vist sig at bidrage under apoptose til nedbrydningen af ​​substrater, såsom proteiner, nukleinsyrer og lipider. Figur 3 viser aktivitetsniveauer påvist for caspaserne 3 og 7. baseline repræsenterer caspaser aktivitet i ubehandlede (kontrol) celler, eftersom behandling af prøver tog næsten 30 minutter og en vis grad af enzymaktivering altid detekteres. Data er udtrykt som procentvise værdier i forhold til den positive kontrol. For serum berøvet CHO celler, blev registreret en gradvis aktivering af caspaser 3 og 7 mellem 24 og 48 timer, med de højeste aktivering niveauer, der findes efter 72 h og aktivering satser 75% over kontroller. Mens

ARP2

cDNA-transficerede CHO celler eller ionomycin (10 uM) behandlede CHO celler udviste en gradvis stigning i caspaseaktivering bemærkede stigning mellem 24 og 72 timer efter transfektion eller ionomycin behandlingen var lavere end de opnåede resultater med CHO-celler inkuberet i fravær af serum ved de samme tidspunkter (figur 3A). Interessant caspaser aktivering i LNCaP-celler dyrket i fravær af serum,

ARP2 Salg cDNA-transficerede celler, eller ionomycin behandlede celler, viste det samme niveau af aktivering, resultater der korrelerer godt med de ovennævnte levedygtighed data. Disse resultater understøtter en gang, at LNCaP-celler synes at være mere modstandsdygtige over for indtræden af ​​en apoptotisk begivenhed end CHO-celler (figur 3B).

Caspase-aktivitet blev bestemt under anvendelse af et fluorometrisk assay anvender Z-DEVD-AFC som et substrat. (A) CHO celler dyrket i fravær af serum, transficeret med

ARP2

cDNA eller inkuberes med 10 pM ionomycin analyseret på 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. (B) LNCaP-celler dyrket i fravær af serum, der var transficeret med

ARP2

cDNA (72 h) eller inkuberet med 10 pM ionomycin analyseret ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. Middelværdier præsenteres (n = 3, X ± SEM),

#

s

0,05, *

s

0,01,

¶

p

. 0,001 sammenlignet med kontrolgrupper

subcellulære lokalisering

for at visualisere den subcellulære lokalisering af ARP2, ekspressionen af ​​en eGFP-mærket-ARP2 fusionsproteinet i CHO-cellelinje gennem transfektion med

ARP2

–

EGFP

cDNA og

EGFP

cDNA (kontrol) blev undersøgt ved 24 timer efter transfektion ved hjælp af en 10 × objektiv. Sammenlignet med e

GFP

cDNA transficerede CHO kontrolceller (figur 4A),

ARP2-EGFP Salg cDNA-transficerede celler udviste et fluorescerende signal lokaliseret omkring kernemembranen (figur 4C). De samme områder blev analyseret ved anvendelse af DIC mikroskopi (figur 4, B og D).