PLoS ONE: hæmning af både EGFR og IGF1R Sensitized Prostata Cancer Cells for stråling ved Synergistisk Undertrykkelse af DNA homolog rekombination Repair

Abstrakt

Reduceret følsomhed af prostatakræft (PC) celler til strålebehandling udgør en betydelig udfordring i klinikken. Aktivering af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), type 1 insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF1R), og krydstale mellem disse to signalveje er blevet impliceret i udviklingen af ​​stråling resistens i PC. Denne undersøgelse vurderede effekten af ​​at målrette begge receptorer om reguleringen af ​​radio-følsomhed i PC celler. Specifikke inhibitorer af EGFR og IGF1R, Erlotinib og AG1024 samt siRNA rettet mod EGFR og IGF1R, blev anvendt til radio-sensibilisere PC celler. Vores resultater viste, at co-hæmmende begge receptorer betydeligt dæmpet cellulær vækst og DNA-skader reparation og øget radio-følsomhed i PC celler. Disse virkninger blev udført gennem synergistisk inhibering af homolog rekombination-rettet DNA-reparation (HRR), men ikke via hæmning af non-homolog ende sammenføjning (NHEJ). Endvidere blev kompromitteret HRR kapacitet forårsaget af reduceret phosphorylering af insulin-receptor substrat 1 (IRS1) og dets efterfølgende interaktion med RAD51. Den synergistiske virkning af EGFR og IGF1R inhibitorer blev også bekræftet i nøgne mus xenograft assay. Dette er den første undersøgelse testning co-inhiberende EGFR og IGF1R signalering i forbindelse med radio-følsomhed i PC og det kan give en lovende adjuvans terapeutisk fremgangsmåde til at forbedre resultatet af PC patienter til strålebehandling

Henvisning.: Wang Y, Yuan JL, Zhang YT, Ma JJ, Xu P, Shi CH, et al. (2013) Hæmning af både EGFR og IGF1R Sensitized Prostata Cancer Cells til Stråling ved Synergistisk Undertrykkelse af DNA homolog rekombination Repair. PLoS ONE 8 (8): e68784. doi: 10,1371 /journal.pone.0068784

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: December 21, 2012; Accepteret: Juni 2, 2013; Udgivet: 12. august 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansieret af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.100.185, No. 81.250.036, No. 30.973.000, No. 30.872.583, No. 81.072.116) og Natural Science Foundation of Shaan’xi provinsen (2009JQ4003). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer (PC) er den mest almindelige malignitet og den næsthyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt mandlige patienter [1]. Under cancer progression, den initiale vækst af PC celler er androgen-afhængige, og disse celler undergår apoptose ved androgen depletion. Som følge heraf blev androgen ablation betragtes som den standard behandling til PC i over 50 år [2]. Mange patienter med tiden udviklet en hormon-refraktorisk sygdom på grund af væksten af ​​androgen-refraktære cancerceller, hvilket fører til svigt af androgen ablation terapi og efterlader patienter med færre behandlingsmuligheder [3], [4]. Kombination af endelige lokale terapier, såsom radikal prostatektomi sammen med adjuvans strålebehandling, har vist sig at forbedre overlevelsen af ​​PC patienter [5], [6]. Imidlertid er en sådan terapi udfordret af fremkomsten af ​​resistens i tumorceller. Det er derfor af største betydning at udvikle nye terapeutiske strategier for at overvinde radioresistance og forbedre radio-følsomhed ved at målrette molekylære machineries i androgen-uafhængige PC celler.

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og insulin-lignende vækst faktor receptor (IGF1R), to vigtigste tyrosinkinasereceptorer, spiller kritiske roller i udviklingen af ​​kræft og progression gennem forordningen om celleproliferation, apoptose, forankringsuafhængig vækst, invasion, angiogenese, cancer immunitet og modstandsdygtighed over for kemo- og /eller strålebehandling [7]. Disse to receptorer er ofte overudtrykt i en række forskellige humane cancere, herunder PC [8], [9], [10], og derfor kunne anvendes som kandidater til målrettet cancerterapi. Faktisk hæmmere af EGFR og en anden EGFR familiemedlem Her2, herunder Erlotinib, Lapatinib, Cetuximab, og Gefitinib, er de mest succesfulde muligheder i nuværende klinisk behandling af forskellige menneskelige kræftformer, som forventet dog udviklingen af ​​

de novo

er blevet observeret resistens i klinikken efter lang tids brug af disse lægemidler, hvilket tyder eksistensen af ​​bypass mekanismer inden tumorceller [11]. Mekanistiske undersøgelser af cellulære og molekylære begivenheder viste, at omfattende krydstale mellem EGFR og IGF1R signalering sker på flere niveauer, og at blokering af EGFR-signalering fører til forbedrede reaktioner på IGF1R ligand, IGF [12], [13]. Disse data indebærer, at målretning begge receptorer på samme tid kunne give bedre effektivitet i kræftbehandlingen og overvinde tumor resistens over for et enkelt inhibitor, og samtidig forbedre følsomheden af ​​individuelle inhibitorer til cancerterapi. Konsekvent, har undersøgelser vist, at dobbelt målretning af begge receptorer blokerer deres gensidige hyperphosphorylering, hæmmer formeringen og fremkalder apoptose i flere cancerceller, herunder pc og kolorektal cancer [14], [15].

I denne undersøgelse, vi vurderet virkningerne af at målrette både EGFR og IGF1R signalering i svarene fra PC celler til y-bestråling. Vores data viste styrken af ​​at målrette begge veje i modulering af adfærd af PC celler efter strålebehandling og afslørede de underliggende mekanismer. Dette er en skelsættende undersøgelse, der yderligere retfærdiggør det kombinatoriske anvendelse af inhibitorer for EGFR og IGF1R veje i behandlingen af ​​PC.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og behandling

human androgen-uafhængig PC celler DU145, PC3, ARCaP

E og ARCaP

M og humant normalt prostata epitel celle linje Prec blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Den R503 var fra Experimental Animal Center den fjerde Military Medical University. Cellerne blev behandlet med dimethylsulfoxid (DMSO, som vehikelkontrol), 10 uM Erlotinib (EGFR inhbibitor, Eton Bioscience, San Diego, CA) og /eller 10 pM AG1024 (IGF1R inhibitor, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) (som eksperimentelle grupper) i 1 time. Celler blev bestrålet som beskrevet af Liu et al [16]. I nogle forsøg blev cellerne også transficeret med IRS1 eller ikke-dæmpende kontrol (NSC) siRNA’er (50 nm, Invitrogen, Shanghai, Kina) i henhold til producentens protokol.

At etablere bestråling-tolerante underlinjer, PC celler blev bestrålet på 2 Gy per dag, 5 dage om ugen i en FCC-8000C

60Co bestråler. Efter seks måneder blev underlinjer af DU145 der overlevede ioniseret bestråling etableret og navngivet DU145-IIRR. Disse underlinjer blev derefter udsat for lægemiddelbehandling og yderligere forsøg.

klongenicitetsassayet

Den synergistiske kolonidannelse efter kombineret behandling med af EGFR og IGF1 inhibitorer og bestråling blev undersøgt ved monolag klonogene assays. Celler var serum-udsultet natten over. Fem tusinde celler blev podet i 10-cm diameter vævskulturskåle med 10-ml medium. Cellerne blev behandlet med AG1024 eller Erlotinib i 1 time og bestrålet ved angivne dosering efter de havde klæbet til skålene. Kolonidannelse blev bestemt med krystalviolet farvning ved anvendelse af en Coulter partikeltæller på dag 10 efter cellepodning. Overlevende fraktion blev defineret som klondannelseseffektivitet de behandlede celler divideret med den for kontrolcellerne. Forsøg blev gentaget tre gange.

flowcytometriassayet

At analysere celle apoptose, celler (1 x 10

4 /brønd) blev udpladet på plader med 6 brønde. Efter 24 timer blev cellerne serumudsultet i 24 timer og derefter behandlet med enten AG1024 eller Erlotinib i 1 time. Celler blev derefter bestrålet i en dosis på 2 Gy. 4 timer efter bestråling blev cellerne høstet ved trypsinisering, fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C i 2 timer og vasket i 5 ml PBS. Celler blev derefter farvet med 1 ml propidiumiodid (PI) opløsning (0,2 mg RNAse A, 0,02 mg PI, og 1 ml Triton X-100). DNA-indholdet i forskellige celle-cyklus faser blev bestemt ved FACS-flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA). For at detektere apoptotisk sats i behandlede celler, blev cellerne farvet med Annexin V og PI, og derefter underkastet flowcytometri som beskrevet [16]. De Annexin V-positive og PI-negative celler, som undergår apoptose tidligt blev talt som apoptotiske celler. Alle forsøg blev udført i dubletter og viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Protein udvinding og Western blotting

Forskellige grupper af celler blev lyseret med 1% SDS-lysepuffer (Beyotime Inc., Beijing, Kina). Til ekstraktion nuklear protein blev cellerne vasket med hypotonisk lysepuffer (Teknova, Beijing, Kina), og dounced i cellen douncer (Wheaton Ltd, Millville, NJ). De nukleare komponenter blev derefter adskilt fra cytosoliske ekstrakter ved centrifugering, efterfulgt af lysis i RIPA-buffer (Pierce Inc., Beijing, Kina).

Immunopræcipitation og Western-blot-assay blev udført som beskrevet af Liu et al [17 ]. Følgende antistoffer var fra Cell Signaling: anti-γH2AX, anti-IRS1, anti-phospho IRS1 (pY612), anti-IGF1R, anti-phospho IGF1R, anti-EGFR, anti-phospho EGFR (Y1068), anti-β-tubulin , anti-ERK, anti-phospho-ERK, anti-AKT, anti-phospho AKT (S473), anti-DNA-PK, anti-Ku70, anti-Ku80, og anti-XRCC4. Anti-Lamin antistof var fra Abnova (Shanghai, Kina). Den anti-HP-1α antistof var fra Millipore (Shanghai, Kina). β-tubulin, Lamin og HP-1α blev brugt som lastning kontrol.

Immunofluorescens

γH2AX og RAD51 foci dannelse blev undersøgt i henhold til Barber et al [18]. For immunfluorescensfarvning for γH2AX og RAD51 blev celler fikseret i 1% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 70% ethanol i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter vask med PBS indeholdende 0,1% Triton i 10 minutter blev cellerne permeabiliseret med 0,5% Triton i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Efter tre vaske i PBS blev cellerne blokeret med 5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i 60 min. Derefter anti-γH2AX (Trevigen, Gaithersburg, MD, 1:2000) eller anti-RAD51 antistof (Oncogene forskning, 1:300) blev tilsat i 5% BSA i PBS og inkuberet med cellerne ved 4 ° C natten over med forsigtig omrystning. Efter fire vaskninger i PBS blev cellerne inkuberet i mørke med et FITC-mærket sekundært antistof i 5% BSA ved en fortynding på 1:2000 for γH2AX og 1:200 for anti-RAD51 påvisning i 1 time ved stuetemperatur. Efter yderligere fire vaske i PBS blev kernerne farves i mørke med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 ug /ml, Invitrogen) i PBS i 5 minutter, og dækglas blev monteret med Fluoromount G ( Southern Biotech., Birmingham, AL). Slides blev undersøgt på et Leica fluorescensmikroskop, med billeder taget af et CCD-kamera og importeres til Avanceret SPOT Billedanalyse software (SPOT Imaging Solutions, Sterling Heights, MI). For hver behandling tilstand blev γH2AX eller RAD51 signaler bestemt i mindst 50 celler. Alle observationer blev valideret fra mindst tre uafhængige forsøg.

Analyser for HR-rettet DNA-reparation (HRR) og non-homolog ende sammenføjning (NHEJ)

Den kvantitative

in vitro

homolog rekombination (HR) assay blev udført under anvendelse af PDR-GFP rekombination reporter-system [19]. Kort fortalt blev PDR-GFP plasmid, der udtrykker to ikke-funktionelle GFP-gener stabilt transficeret ind DU145 celler. En andet plasmid, der koder for restriktionsenzymet I Sce-I og et tredje plasmid, der udtrykker rødt fluorescerende protein (RFP) med en mitokondrie lokaliseringssignal for at indikere transfektionseffektiviteten blev forbigående transficeret ind i DU145 celler indeholdende PDR-GFP plasmid. Når jeg-Scel blev udtrykt, det producerede DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) inden for SceGFP fragmentet og stimuleret HRR at genoprette intakt GFP-genet. DNA-reparation af HRR blev vurderet ved at tælle celler med både nuklear GFP signal og mitokondriel RFP signal vs. alle positivt transficerede celler, det vil sige forholdet mellem celler med både røde og grønne signaler til dem med kun røde signaler.

cellen-fri NHEJ assay blev udført som beskrevet tidligere [20] med nukleare ekstrakter fra 1 × 10

7 DU145 celler.

In vivo

tumor strålebehandling

forsøgene dyr blev godkendt af Etniske Udvalg for fjerde Military Medical University (Xi’an, Kina). 5 × 10

6 DU145-celler blev for-blandet med Matrigel (BD Biosciences) til subkutan injektion i flanken af ​​10 uger gamle nøgne hunmus. Toogtyve dage senere (dag 0), blev musene tilfældigt opdelt i 5 grupper, 5 mus pr gruppe, baseret på de behandlinger, de ville modtage: dvs., kontrolgruppe modtaget behandlinger; IR gruppe modtog γ-bestråling af forskellige doser på dag 3, 6, 8, og 10, henholdsvis; IR + Erlotinib gruppe modtog γ-bestråling som bestrålingen gruppe samt 100 mg /kg /d af oral Erlotinib i 10 dage; IR + AG1024 gruppe modtog γ-bestråling, plus100 mg /kg /d af oral AG1024 i 10 dage; IR + AG1024 og Erlotinib modtog γ-bestråling, plus 100 mg /kg /d begge lægemidler i 10 dage. Tumorvolumen (V) blev overvåget hver tredje dag i syv uger ved at måle længden (L) og bredde (W), og beregnet som V = 0,5 × L × W

2. Resultatet blev udtrykt som spredning (PI, PI = V behandling /V-kontrol).

Statistisk analyse

Effekten af ​​Erlotinib og AG1024 om hæmning af celleproliferation, xenograft vækst, klonogene overlevelse og caspaseaktivering blev analyseret statistisk ved hjælp af en uparret tosidet Students

t

test. Alle kvantitative data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg for

in vitro

eksperimenter eller fra alle dyr i gruppen for

in vivo

eksperimenter. P-værdi på ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant. * Og ** blev mærket for P 0,05 og P. 0,01 henholdsvis sammenlignet med kontrolcellerne i alle figurerne

Resultater Salg

Reduktion af levedygtighed tumorcelle og induktion af apoptose ved målretning af EGFR og /eller IGF1R før strålebehandling

i denne undersøgelse vi først vurderede den inducerede følsomhed forskellige kræftceller for stråling

in vitro

. Vi voksede og behandlet forskellige cancercellelinier med Erlotinib (10 uM) og /eller AG1024 (10 uM) i 1 time og derefter bestrålet dem med 2 Gy. Vores data viste, at tumor cellelevedygtighed blev markant reduceret, og tumorcelle apoptose forøges ved bestråling for hæmmere af både EGFR og IGF1R, sammenlignet med strålebehandling alene eller bestråling plus blokering af enten receptor (figur 1A, B). Specifikt sammenlignet med vehikelbehandlede kontrolceller, enten AG1024 eller Erlotinib signifikant reduceret tumor cellelevedygtighed i epiteliale PC cellelinier (P 0,05), men den mest robuste vækst-inhibitoriske virkning ved bestråling blev opnået med samtidig anvendelse af begge inhibitorer (P 0,05, sammenlignet med AG1024 eller Erlotinib behandling i DU145, PC3 og ARCaP

E-celler) (figur 1A). I modsætning hertil AG1024 eller /og Erlotinib kunne ikke radio-sensibilisere normal prostata epitel cellelinie Prec (figur 1A). Vore data viste også, at i begge DU145 og PC3-celler, AG1024 reducerede signifikant phosphorylering af IGF1R, hvorimod Erlotinib dramatisk inhiberede phosphorylering af EGFR, og hverken viser cross-aktivitet på den anden receptor, hvilket indikerer, at begge inhibitorer fungerer potent og specifikt (figur S1).

A, Radio-følsomhed assay af celler behandlet med EGFR og IGF1R hæmmere. Cancerceller hos forskellige grupper blev behandlet uden (kontrol) eller med AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge i 1 time og derefter udsat for radioaktiv sensitivitet klonogene assay. Efter 10 dage blev kloner fikseret og farvet. Overlevende fraktion blev beregnet ifølge de kolonitællinger og udpladningseffektivitet. B, Radio-følsomhed assay af celler behandlet med EGFR og IGF1R siRNAs. Celler af forskellige grupper blev transficeret med ikke-silencing kontrol siRNA (NSC-siRNA), EGFR og /eller IGF1R siRNA, og derefter udsat for radioaktiv sensitivitet klonogene assay som beskrevet i panel A. C, apoptose af celler behandlet med EGFR og IGF1R inhibitorer. Prostatakræft-cellelinier blev forbehandlet med AG1024 eller Erlotinib ved angivne koncentrationer i 1 time, og derefter bestrålet i 2 Gy. Efter 4 timer blev de farvet med Annexin V og propidiumiodid til flowcytometri til bestemmelse procentdel af apoptotiske celler. D, Apoptose af prostatakræft-cellelinier transficeret med EGFR og /eller IGF1R siRNA. Celler af forskellige grupper blev transient transficeret med NSC siRNA, IGF1R siRNA eller EGFR siRNA i 24 timer, og derefter bestrålet i 2 Gy. Apoptose blev analyseret som i panel C. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med kontrol- celler

Udover epitel PC celler, vi også vurderet effekten af ​​at målrette både EGFR og IGF1R signalering i radioen-sensibilisering respons. af mesenchymal-lignende PC celler. Til dette formål anvendte vi ARCaP

M, den mesenkymale modstykke til ARCaP

E udviklet af Graham et al [21]. Begge cellelinier udviser minimal ekspression af androgen receptor [22]. I overensstemmelse med tidligere resultater fra Buck et al [14], kombineret behandling med EGFR og IGF1R hæmmere kunne ikke synergistisk hæmmer mesenchymale cellevækst i respons på bestråling, som det gjorde for epitelial vækst (figur 1A).

For at undgå de ikke-specifikke effekter forbundet med små molekylære inhibitorer, gentog vi også eksperimentet i figur 1A ved hjælp siRNA specifikt for EGFR og IGF1R (figur 1B). Som vist i figur S2, både siRNA arbejdet effektivt i banker ned IGF1R og EGFR hhv. Med en enkelt eller dobbelt knockdown af EGFR og /eller IGF1R af siRNA, vi opnåede tilsvarende resultater som i figur 1A (figur 1B).

Dernæst vi kendetegnet de potentielle apoptotiske virkninger af disse to inhibitorer under anvendelse af flowcytometri assay. Som vist i figur 1C, DU145, PC3 og ARCaP

E celler viste forbedret radio-følsomhed efter stigende doser af AG1024 og /eller Erlotinib, mens ARCaP

M var kun følsom over AG1024, men ikke til Erlotinib. Kombineret behandling med Erlotinib og AG1024 synergistisk radio-bevidstgøre DU145, PC3 og ARCaP

E celler, men ikke ARCaP

M-celler. Når man sammenligner DU145 celler til PC3-celler, fandt vi, at førstnævnte er mere følsomme over Erlotinib end sidstnævnte, idet 10 pM Erlotinib inducerede en robust apoptotisk respons over 1 pM Erlotinib i DU145-celler, mens ikke meget stigning i apoptose blev observeret i PC3 celler ved de samme doser af erlotinib. Lignende resultater blev også opnået med siRNA rettet mod EGFR og /eller IGF1R (Figur 1D).

Forbedring af radio-følsomhed af EGFR og IGF1R hæmmere gennem nedskrivning af DNA DSB reparere

For at forstå den molekylære mekanismerne bag forstærket radio-følsomhed af cancerceller som respons på AG1024 og /eller Erlotinib behandling, bestemte vi kapaciteten af ​​DNA dobbelt-strenget pause (DSB) i DU145 og PC3-celler, idet DSB udøver den mest dødbringende virkning på celler induceret af γ bestråling. Ved at overvåge niveauet af histon-protein H2AX phosphorylering på C-terminale serin 139-rest, også kendt som γH2AX, en velkendt og følsomme DSB markering, demonstrerede vi, at der var en hurtig og robust phosphorylering af H2AX på 1 time efter bestråling i både vehikelbehandlede kontrolgruppe DU145 og PC3-celler (figur 2A), som hurtigt faldt ved 4 timer og vendte tilbage til det basale niveau ved 24 timer, hvilket indebærer udførelsen af ​​DSB-reparation. I modsætning hertil tumorceller forbehandlet med AG1024, Erlotinib eller begge viste en H2AX phosphorylering top forsinket ved 4 time og kontinuerlig H2AX phosphorylering Til 24 timer efter bestråling, hvilket tyder på svækkelse af DSB-reparation efter AG1024 og Erlotinib behandling (figur 2A, B ). Desuden var der en signifikant forskel mellem AG1024 + Erlotinib gruppe og AG1024 eller Erlotinib gruppe (5 og 10 Gy, P 0,01), hvilket indikerer en additiv effekt af samarbejdet inhibtion på DSB reparationen (figur 2B)

A, DSB markør γH2AX udtryk tidsforløb efter bestråling: Cellerne blev serum sultet natten over, derefter behandlet med 10 pM AG1024 og /eller 10 pM Erlotinib. Western-blot af celler bestrålet i en dosis på 2 Gy, og høstet ved de angivne tidspunkter. HP-1α-protein blev anvendt som en loading kontrol. Dataene blev derefter kvantificeret af Image J software og udtrykt som procent af kontrol. B, Immunofluorescens påvisning af γH2AX foci-dannelse efter bestråling. Cellerne blev behandlet med eller uden AG1024 og /eller Erlotinib i 1 time og bestrålet ved forskellige doseringer. Cellerne blev fikseret efter 24 timer. De mellemværker viser repræsentative billeder med grøn γH2AX signal og blå DAPI nukleare farvning. C, DSB-reparation assay for HRR. Serum-udsultede DU145-celler i fravær eller nærvær af AG1024 (10 uM) eller Erlotinib (10 uM) blev transient transficeret med to vektorer, en der udtrykker I-Scel cDNA til frembringelse DSB’er af GFP-cDNA, og en anden, der udtrykker rødt fluorescerende protein med en mitochondrial lokaliseringssignal for at indikere transfektionseffektiviteten. DNA-reparation af HRR blev vurderet ved forholdet mellem celler med både røde og grønne signaler til dem med kun røde signaler. Indsatsene viser repræsentative billeder af celler positive og negative for HRR. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD af procentdelen af ​​celler positive for DNA-reparation af HRR fra tre uafhængige forsøg. D DSB reparation assay for NHEJ. DU145 celler forbehandlet med eller uden AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge dele. Tilsvarende kerneekstrakter blev inkuberet med det lineariserede plasmid pBluscript KS (+) i et cellefrit system til at måle NHEJ. Det lineariserede plasmid-DNA uden behandling med kerneekstrakterne (kun DNA) og den kerneekstrakt fra kontrolcellerne uden plasmidet (nuklear kun ekstrakt) blev anvendt den negative kontrol. Kerneekstrakt fra R503 fibroblaster blev anvendt som en positiv kontrol. Pile viser positionerne for lineariserede plasmid og dimerer. E, Western-blot-assay påvisning NHEJ relateret protein. DU145 celler forbehandlet med eller uden AG1024 (10 uM), Erlotinib (10 uM) eller begge og derefter bestrålet i NHEJ-relateret kerneprotein (DNAPK, K70 /80, XRCC4). Lamin blev anvendt som en loading kontrol. * P 0,05, ** P 0,01, sammenlignet med kontrol- celler

Virkninger af EGFR og IGF1R inhibitorer på nedskrivning af DSB reparere gennem hæmning af HRR, men ikke af NHEJ

.

for at skelne, om det forringet DSB reparation skyldtes en defekt i HRR eller NHEJ, de to store veje for DSB reparation, vi kvantitativt vurderet HRR hjælp PDR-GFP rekombination reporter-system og undersøgt NHEJ ved hjælp af en

in vitro

cellefrit assay [20]. Som vist i figur 2C, for DU145 celler, kombineret behandling med AG1024 og Erlotinib reduceret HRR niveau sammenlignet med kontrolgruppen køretøjet eller hvert middel alene (P 0,05). I modsætning hertil kerneekstrakt behandlet med individuel inhibitor eller begge var ude af stand til at ændre

in vitro

ligering af pBluescript KS (+), når der sammenlignes med den kerneekstrakt fra køretøjets kontrolceller (Figur 2D). Til denne analyse blev kerneekstrakt fra R503-celler anvendt som positiv kontrol, som det fremgår af Yang et al [23]. Desuden ekspression af NHEJ-relaterede DNA-reparationsmekanismer proteiner, herunder DNA-PK, Ku70, Ku80 og XRCC4, blev ikke påvirket af AG1024, Erlotinib eller begge i DU145-celler (figur 2E), hvilket antyder, at inhibering af disse to signalveje ikke forringe NHEJ-initieret DNA DSB reparation, en af ​​de mest almindelige former for DSB reparation i pattedyrceller.

Undertrykkelse af signal krydstale på flere niveauer ved at hæmme både EGFR og IGF1R

Tidligere undersøgelser viste omfattende krydstale mellem EGFR og IGF1R signalvejen på flere niveauer [14]. Ovenstående Vores data har vist, at co-hæmning af EGFR og IGF1R kunne additivt radio-sensibilisere PC celler gennem nedskrivning af HRR DSB reparation. For yderligere at undersøge, hvordan samspillet mellem de to receptorer påvirker DSB reparation, vi udførte immunopræcipitation-Western blot for at undersøge den fysiske interaktion mellem EGFR og IGF1R i DU145 og PC3 celler efter γ-bestråling. Vores data viser, at uden bestråling, disse to receptorer interagerede med hinanden i begge tumorcellelinjer og at denne associering blev ikke ændret signifikant ved 24 timer efter bestråling (figur 3A). Desuden har vi bestemt den nedstrøms signaltransduktion af én receptor som respons til liganden på den anden receptor. Som vist i figur 3B, for DU145 og PC3-celler, phosphorylering af EGFR blev forøget på en dosis-afhængig måde til IGF-I-behandling i begge celler, men blev signifikant reduceret ved samtidig behandling med EGFR-inhibitor, erlotinib. Tilsvarende phosphorylering af IRS1, de store IGF1R signalmolekyle, blev forbedret efter behandling med stigende koncentrationer af EGF, men blev inhiberet efter tilsætning af AG1024 (figur 3C). Desuden fandt vi, at liganden for hver receptor, dvs. IGF-I og EGF, var tilstrækkelig til at aktivere disse målgener i DU145 og PC3-celler. Imidlertid blev den mest robuste aktivering opnået med co-behandling med både IGF-I og EGF, hvorimod blokering af disse receptorer signalering med enten AG1024 eller Erlotinib kunnet reducere aktivering af disse målgener, men den mest potente reduktion blev observeret i DU145 og PC3-celler forbehandlet med begge inhibitorer (figur 3D). Disse data antyder, at co-behandling med EGFR og IGF1R inhibitorer kunne undertrykke deres krydstale og dermed blokere deres nedstrøms signalering, herunder PI3K /AKT pathway og MAPK-vejen.

A, Immunpræcipitation påvisning EGFR /IGF1R interaktion. DU145 og PC3-celler blev bestrålet ved en dosis på 2 Gy. Derefter cellulære proteiner blev ekstraheret og underkastet immunpræcipitationsassay påvisning EGFR og IGF1R interaktion. B, IGF-I aktiverer EGFR i DU145 og PC3-celler. Celler blev serum-udsultet natten over, og derefter underkastet IGF-I-stimulering i 30 min. EGFR phosphorylering blev påvist ved Western blot. C, EGF aktiverer IRS1, den vigtigste faktor for IGF1R signal pathway i DU145 og PC3 celler. Celler blev serum-udsultet natten over, og derefter udsat for EGF-stimulering i 30 min. IRS1 phosphorylering blev påvist ved Western blot. D, MAPK eller AKT aktivering efter EGFR og IGF1R simulering af inhibering. DU145 og PC3-celler blev behandlet med eller uden AG1024 (10 uM), Erlotinib (10 uM), AG1024 plus Erlotinib; IGF (50 ng /ml), EGF (50 ng /ml), eller EGF plus IGF i 30 min. Så ERK1 /2 udtryk og phosphrylation, AKT udtryk og phosphrylation, IRS1 udtryk og phosphrylation blev bestemt ved Western blotting. β-tubulin blev anvendt som en belastning kontrol.

Virkninger af EGFR og IGF1R inhibitorer på undertrykkelse af IRS1 /RAD51-medieret homolog rekombination

Vores nuværende data om AG1024 og Erlotinib regulerer IRS1 phosphorylering /aktivering impliceret den potentielle inddragelse af IRS1 /RAD51-medieret HRR som reaktion på y-bestråling i PC celler, som tidligere undersøgelse også vist [24]. Faktisk viste vores data, at IRS1 phosphorylering blev induceret ved γ-bestråling med peak aktivering opnået 4 timer efter γ-bestråling i DU145 og PC3-celler, medens toppen af ​​IRS1 phosphorylering blev forsinket til 8 timer efter γ-bestråling efter behandling med AG1024 eller Erlotinib alene. I modsætning hertil samtidig behandling med både AG1024 og Erlotinib væsentligt reduceret IRS1 aktivering ikke kun på det basale niveau (0 timer efter bestråling), men også på alle tidspunkter op til 24 timer efter bestråling (figur 4A).

A, Western blot, der viser niveauet af p-IRS1 på forskellige tidspunkter efter 2 Gy γ-bestråling af DU145 og PC3-celler forbehandlet med eller uden AG1024 (10 uM), Erlotinib (10 uM) eller begge i 24 timer. β-tubulin blev anvendt som en loading kontrol. Den repræsentative gel billede vises øverst og kvantificering p-IRS1 /β-tubulin-forhold fra tre uafhængige forsøg er vist i bunden. B, Immunpræcipitation viser interaktionen mellem IRS1 og RAD51 i den nukleare ekstrakt af DU145 og PC3-celler. C, Dannelsen af ​​nukleare RAD51 foci som analyseret ved immunfluorescensfarvning. DU145 og PC3-celler blev opretholdt med eller uden AG1024 (10 uM), erlotinib (10 uM) eller begge (venstre fire søjler), mock-transficeret (pseudotreated) eller transficeret med ikke-specifik kontrol siRNA (NSC siRNA) eller med IRS1 siRNA (højre tre søjler). Indsatsene viser repræsentative billeder med grøn RAD51 signal og blå DAPI nuklear farvning. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med AG1024 /Erlotinib- behandles eller pseudotreated celler; ** P 0,01, sammenlignet med AG1024- eller Erlotinib-behandlede celler. D, RAD51 immunfluorescensfarvning af DU145 og PC3-celler behandlet med LY292004, PD98059, eller Erlotinib efterfulgt af γ-bestråling. Den nukleare RAD51 foci dannelse blev bestemt i det samme som i C. Inlays viser repræsentative billeder med grøn RAD51 signal og blå DAPI nukleare farvning. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P. 0,05, sammenlignet med de bestrålede-kun celler

Næste, vi bestemt den fysiske vekselvirkning mellem IRS1 og RAD51 i den nukleare brøkdel af celler fulgte γ-bestråling ved hjælp immunopræcipitation. Som vist i figur 4B, behandling med vehikel, AG1024, Erlotinib eller AG1024 plus Erlotinib ikke signifikant ændre niveauerne af IRS1 eller RAD51-protein, hvorimod niveauer af IRS1-forbundet med RAD51 drastisk reduceret i celler behandlet med AG1024 plus Erlotinib, som er konsistent med betydeligt reduceret niveau af phospho-IRS1 i disse celler. Disse data viste, at AG1024 plus erlotinib behandling undertrykt IRS1 interaktion med RAD51, hvilket indikerer EGFR og IGF1R co-hæmning kunne hæmme DNA dobbelt streng pause reparation ved hæmning af HRR.

Derudover har vi bestemt også den subcellulære lokalisering af RAD51 der danner nukleare foci ved steder med DNA-læsioner. Vores data viser, at ca. 15% af vehikelbehandlede kontrolceller var positive for RAD51 nuklear foci efter udsættelse for y-bestråling.