PLoS ONE: Cell-Free Urinary MicroRNA-99a og MicroRNA-125b Er diagnostiske markører for ikke-invasiv Screening af blærekræft

Abstrakt

Baggrund

Beviser impliceret den diagnostiske betydning af microRNA i hele urin /urin sedimenter i urothelial karcinom i blæren (UCB). Men de forurenede blodlegemer hos patienter med haematouria ændret væsentligt udtrykket profiler af urin microRNA, påvirke testen nøjagtighed.

Metoder

miRNA profiler af urin supernatanter af UCB patienter og kontroller uden malignitet og profiler af maligne og tilsvarende normale mucosa væv fra patienter blev bestemt ved microRNA microarray og sammenlignet for at identificere differentielt udtrykte microRNA. Den differentielle ekspression blev verificeret i væv af en uafhængig patient kohorte af RT-qPCR. Den diagnostiske betydning af udvalgte microRNA’er som biomarkører i urinen supernatanten blev undersøgt i de udvidede kohorter.

Resultater

MicroRNA-99a og microRNA-125b blev nedreguleret i urinen supernatanter af UCB patienter . Graden af ​​nedregulering var forbundet med tumoren klasse. En diagnostisk Modellen er udviklet ved hjælp af en kombineret indeks af indholdet af microRNA-99a og microRNA-125b i urinen supernatanten med en følsomhed på 86,7%, en specificitet på 81,1% og en positiv forudsagt værdi (PPV) på 91,8%. Diskriminere mellem høj- og lav kvalitet UCB, modellen med niveauet for microRNA-125b alene udviste en følsomhed på 81,4%, en specificitet på 87,0% og en PPV på 93,4%.

Konklusioner

resultaterne viste en unik microRNA ekspression signatur i urinen supernatanter af UCB patienter for udvikling af molekylære diagnostiske tests. En effektiv celle-fri urin microRNA-baserede model blev udviklet ved hjælp af en kombineret indeks af indholdet af microRNA-99a og mikroRNA-125b til at opdage UCB med god udslagsgivende kraft, høj følsomhed og høj specificitet

Henvisning:. Zhang DZ, Lau KM, Chan ESY, Wang G, Szeto CC, Wong K, et al. (2014) Cell-Free Urinary MicroRNA-99a og MicroRNA-125b Er diagnostiske markører for ikke-invasiv Screening af blærekræft. PLoS ONE 9 (7): e100793. doi: 10,1371 /journal.pone.0100793

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: Februar 11, 2014 Accepteret: 29 maj 2014; Udgivet: 11. juli 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af direkte tilskud for Forskning (2009.1.096), den kinesiske University of Hong Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

urotelial carcinom i blæren (UCB) er den anden mest almindelige malignitet i urinvejene [1]. På grund af sin høje forekomst og hyppig gentagelse, effektive diagnostiske og sygdom overvågningsværktøjer er afgørende for den kliniske behandling af patienter. Cystoskopi er i øjeblikket den standard kliniske test til diagnose og kræft overvågning. Men proceduren er invasiv og ubehagelige, og har flere praktiske begrænsninger. For eksempel kan det ikke være i stand til at detektere små og /eller flade tumorer som karcinom

in situ

. Derfor kræves en alternativ ikke-invasiv tilgang udviser høj specificitet og følsomhed. Selv om mange blod- og urin-baserede biomarkører er blevet identificeret og evalueret i litteraturen, har ingen været ideelle og stærke nok til at erstatte cystoskopi [2].

MikroRNA’er, som er små ikke-kodende RNA’er, har for nylig viste signifikant diagnostisk og prognostisk værdi i forskellige former for kræft [3] – [5]. MikroRNA’er udviser høj stabilitet og nem detekterbarhed selv ved lave niveauer i forskellige typer af kliniske prøver [6] – [8]. Det anses for en fremragende sygdom biomarkør for detektion og overvågning. En undersøgelse viste, at en række af microRNA afvigende blev udtrykt i UCB tumorvæv, og at disse afvigelser kan være engageret i diagnosticering og iscenesættelsen af ​​blærekræft biopsier [9]. Hertil kommer, at vurderingen af ​​indholdet af disse afvigende udtrykte microRNA, der viser unikke signaturer i hele urin eller urin afstødes celler er endnu mere lovende for diagnose og sygdomsovervågning af UCB [10] – [11]. Men resultaterne er til tider upålidelige, når man studerer patienter med hæmaturi, i hvem forurenede blodlegemer i væsentlig grad ændre urin microRNA profiler og dermed maskere signaturer. Faktisk 85% af patienterne udviser varierende grader af hæmaturi [12] – [13]. Som følge heraf kræves en alternativ tilgang til måling microRNA. Beviser har foreslået, at frie nukleinsyrer, såsom DNA-biomarkører i urin supernatanter, giver en højere opdagelse sats og højere følsomhed end i sediment for UCB diagnose [14] – [16]. Derfor vurdering af indholdet af microRNA i urin supernatant kunne forbedre brugen af ​​microRNA som diagnostiske biomarkører til detektering UCB, især hos patienter med hæmaturi. I denne undersøgelse blev muligheden for at anvende cellefrie urin microRNA til diagnosticering UCB blev bestemt og modeller til diagnosticering UCB og diskriminerende tumor kvaliteter udvikles.

Metoder

Patienter og prøver

En oversigt over denne undersøgelse er vist i figur S1. Med skriftligt samtykke fra donorerne og godkendelse af det fælles kinesiske University of Hong Kong – Ny Territories East Cluster Clinical Research etiske komité, vævs- og urinprøver blev indsamlet i Urologi Unit, Institut for Kirurgi, Prince of Wales Hospital, Hongkong . Midtstråleurin blev opsamlet fra blærecancerpatienter før operation. Både tumorvæv og normal blære mucosa placeret 3 cm væk fra tumoren kant blev opnået ved cystoskopi. Den 1973 WHO diagnose og klassificeringssystem for blærekræft [17] blev brugt til diagnosticering. For de normale kontroller, blev urinprøver indsamlet fra patienter, der havde normale cystoskopisk fund, fravær af maligniteter med et 6 måneders opfølgning og hæmaturi. Alle urinprøver blev centrifugeret ved 2.500 r.c.f. i 20 minutter, og de urin supernatanter blev opsamlet.

MicroRNA microarray

Den samlede RNA af urin supernatanter og frosne væv blev ekstraheret ved hjælp af MirVanaPARIS Kit (Ambion) i overensstemmelse med producentens anbefalede protokoller . Agilent menneskelige miRNA mikroarraychippen (Release 13.0, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), som omfatter 866 menneskelige microRNA og 89 virale microRNA’er, blev brugt til at profilere udtryk for disse microRNA’er i urinen supernatanter og kræft og kontrol væv. Datasættet blev deponeret til ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) og tiltrædelse nummer er E-mtab-2573. Signalintensiteten af ​​hver plet var median-normaliseret og yderligere normaliseret ved lineær regression.

revers transkription-kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR)

Første streng cDNA blev syntetiseret ud fra total RNA af urin supernatanter og vævsprøver ved hjælp af en universel cDNA syntese kit (Exiqon, Vedbæk, Danmark) i overensstemmelse med producentens anbefalede protokol. Det resulterende cDNA blev underkastet kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) med SYBR Green Master Mix og microRNA LNA PCR-primer (Exiqon), som specifikt genkendes den målrettede microRNA i en ABI 7900HT hurtig RT-qPCR maskine (Applied Biosystem /Life Technologies, Grand Island , NY, USA). RNU6B blev brugt som reference kontrol. Alle prøverne blev testet in duplo. Det relative niveau af microRNA blev bestemt ved anvendelse af ΔΔC

q metode.

Statistiske metoder

De microarray data blev analyseret ved hjælp af Gene Spring 11.0 software (Agilent) for at normalisere og identificere forskelligt udtrykte microRNA. ABI SDS 2.3 software (ABI /Life Technologies) blev anvendt til at analysere RT-qPCR data. De kvantitative data blev udsat for en Mann-Whitney U test og en Wilcoxon-test ved anvendelse af SPSS 16.0 software (IBM Co, Armonk, NY, USA). I efterfølgende post-hoc analyse blev en bivariate logistisk regressionsanalyse udført for at bestemme den kombinerede Index (CI) for kombinationen af ​​to microRNA ekspressionsniveauer. En modtager operating characteristic (ROC) kurve analyse blev udført under anvendelse af SPSS 16.0 softwaren. Den følsomhed, specificitet, positive og negative prædiktive værdier og positive og negative sandsynligheden nøgletal blev beregnet.

Resultater

Identifikation af differentielt udtrykte microRNA mellem urin supernatanter af UCB patienter og kontrolpersoner og mellem kræft og normale væv ved microRNA microarray

Urin supernatanter fra seks UCB patienter og tre normale kontroller sammen med fire par UCB væv og deres tilsvarende normal blære slimhinder væv blev udsat for microRNA microarray analyse. De patientkarakteristika er vist i tabel 1. Til bestemmelse af nærvær og fravær af microRNAer i prøverne, blev en tærskel signal defineres som det gennemsnitlige baggrund plus tre standardafvigelser. Signaler over denne tærskel blev betragtet som en “tilstedeværelse” og signaler under tærsklen blev betragtet som en “fravær.” Efter global normalisering, 117 ± 63,8 ud af 866 menneskelige microRNA’er blev påvist i urinen supernatanter og blev fundet 314 ± 83,4 microRNA i blæren væv. Der var ingen signifikant forskel i det samlede antal microRNA konstateres mellem de urin supernatanter fra kræftpatienter og kontroller samt mellem cancer og kontrol væv. Sammenligning af profilerne i urinen supernatanter af UCB patienter med de af de normale kontroller, viste 39 microRNA differential udtryk (Mann-Whitney test, p 0,05; fold forskelle 1,60). Der var 78 differentielt udtrykte microRNA mellem kræft og normale væv (parret Mann-Whitney test, p 0,05; fold forskelle 2,0). Ti microRNA var almindeligt dysreguleret i både urin supernatanter og vævsprøver (figur 1 og figur S1). Af disse niveauerne af microRNA-1, mikroRNA-99a, microRNA-125b, microRNA-133a, microRNA-133b, mikroRNA-143 og microRNA-1207-5p faldt betydeligt og de af microRNA-16, mikroRNA-96 og microRNA- 183 steg i UCB prøver (figur 1).

(A) Heat kort over niveauet for 10 udvalgte microRNA i ni urin supernatant prøver og fire par vævsprøver. Den totale RNA blev ekstraheret og underkastet microRNA microarray analyse under anvendelse af en Agilent Humant microRNA mikroarraychippen. Signalintensiteten af ​​hver plet var median-normaliseret og yderligere normaliseret ved lineær regression. De normaliserede signalintensiteter for hver microRNA i urinen supernatanten og prøver af UCB patienter og kontroller væv præsenteres. (B) Scatter plots af de normaliserede signal følsomheder i de 10 udvalgte microRNA’er. En Mann-Whitney U test blev udført for at sammenligne niveauerne af microRNA i urinen supernatanten af ​​UCB patienter (TU) (n = 6) og kontroller (NU) (n = 3), og en parret Mann-Whitney U test blev udført at sammenligne de tumorer (TT) (n = 4) og deres tilsvarende normale mucosa væv (NT) (n = 4) i UCB patienter. Et signifikansniveau på 0,01 blev anvendt til alle sammenligninger. Stjerner (*) angiver en statistisk signifikant forskel (p 0,01).

Validering af de 10 udvalgte microRNA i selvstændige grupper af væv og urin supernatant prøver

For at validere mikroarrayet resultater, niveauerne af de 10 udvalgte microRNA blev kvantificeret ved RT-qPCR i yderligere 18 par af blærecancer og tilsvarende normale mucosa væv (tabel 1). Af disse er forskellen udtryk for seks microRNA mellem kræft og normale væv blev valideret (Wilcoxon signed-rank to-relaterede-prøver test, p 0,05) (Figur 2). MicroRNA-1 blev nedreguleret i alle 18 par af kræft væv (p 0,01) og 17 ud af 18 par viste nedregulering (p 0,01) i de resterende fem mikroRNA (microRNA-99A, microRNA-125b, microRNA- 133a, microRNA-133b og microRNA-143). MicroRNA-1, mikroRNA-99a, microRNA-125b, microRNA-133a, mikroRNA-133b og microRNA-143 blev nedreguleret 266,87 ± 2,06, 130,69 ± 2,30, 49,52 ± 3,39, 263,20 ± 1,99, 261,38 ± 2,11 og 67,18 ± 1,83 gange i kræft væv henholdsvis.

Den samlede RNA blev ekstraheret fra 18 par blærekræft væv og deres tilsvarende normale tilstødende slimhinde væv. Niveauerne af disse microRNA’er blev kvantificeret ved RT-qPCR i to eksemplarer. De relative ekspressionsniveauer (2-ΔCq) præsenteres. En parret Mann-Whitney U test blev udført for at sammenligne de tumorer og deres tilsvarende normale mucosa væv i UCB patienter. Kolonner, Midler; Barer, S. D. .; n = 18. ** betegner p. 0,001

Den effekt diskrimination af de seks validerede microRNA i urinen supernatanter blev derefter vurderet ved hjælp 71 urin supernatant prøver, herunder 50 prøver fra patienter blærekræft (15 tilfælde af lav kvalitet kræft og 35 tilfælde af høj kvalitet kræft) og 21 prøver fra kontroller (tabel 1). I denne udvidet sæt af prøver, urin supernatanter af de UCB patienterne besad lavere niveauer af microRNA-99a (p 0,01), microRNA-125b (p 0,01), microRNA-133b (p 0,05) og microRNA-143 (p . 0,01) end for kontrollerne (figur 3A), men ikke af microRNA-133a og microRNA-1

Udvikling af cellefrie urin microRNA modeller til påvisning af UCB og diskrimination af tumor kvaliteter

ROC kurve blev bestemt til at evaluere den diagnostiske styrken af ​​disse microRNA’er i påvisning UCB. Høj areal under kurven (AUC) værdier blev fundet for microRNA-99a (0,800, der spænder fra 0,715 til 0,886) og microRNA-125b (0,813, der spænder fra 0,729 til 0,897) (figur 3B), hvorimod microRNA-133b og microRNA-143 udviste lav diagnostisk styrke med AUC-værdier omkring 0,6. For yderligere at bestemme den diagnostiske betydning af microRNA-99a og microRNA-125b, var relateret cut-off points bestemt ud fra ROC kurver baseret på Youden indeks regel. De afskårne point for de normaliserede ekspressionsniveauerne af microRNA-99a og microRNA-125b var 2

2,18 og 2

4.1 hhv. En patient med en urin supernatant hvis microRNA niveau var lavere end eller lig med cut-off point blev betragtet som en kræft tilfælde, og betragtes som normalt, hvis niveauet var højere end cut-off point. Ifølge dette system, følsomhed, specificitet, positiv forudsigelse værdi (PPV), negativ forudsigelse værdi (NPV), positiv sandsynlighed (LR +) og negative sandsynlighed (LR) til microRNA-99a var 78,0%, 85,7%, 92,7%, 61,0%, 5,46 og 0,26, henholdsvis og til microRNA-125b var 84,8%, 76,2%, 89,3%, 68,1%, 3,57 og 0,20 (tabel 2). For at opnå en bedre diagnostisk ydelse blev en kombination af de udtryk for microRNA-99a og microRNA-125b udsat for en bivariate logistisk regression. CI klaret sig bedre end brugen af ​​hver microRNA alene. AUC-værdien steg til 0,876. CI formel var CI = 1 /{1 + exp [- (2,332 + 0,425 xΔCq

microRNA-125b + 0,069 xΔCq

microRNA-99a)]}. Når cut-off punkt blev fastsat til 0,6244 baseret på Youden indeks regel forudsigelse systemet forbedret med en øget følsomhed (86,7%) og NPV (71,4%) og en nedsat LR (0,16), med sammenlignelige værdier for specificitet, PPV og LR + (tabel 2).

Den kliniske relevans af de fire microRNA’er er udvalgt til at diskriminere lav kvalitet fra høj kvalitet kræftformer blev også vurderet. Niveauerne af urin mikroRNA-99a og microRNA-125b var signifikant lavere hos patienter med høj kvalitet kræftformer (G2 og G3) end i dem med lav kvalitet kræftformer (G1) (Mann-Whitney U test, p 0,01). Niveauerne af microRNA-133b og microRNA-143 viste ingen tumor kvalitet værdi forskelsbehandling (figur 3A). De AUC-værdier skelnes mellem høj og lav kvalitet kræftformer for microRNA-99a og microRNA-125b var 0,819 og 0,791 henholdsvis (figur 3B). De afskårne punkter de normaliserede niveauer af microRNA-99a og microRNA-125b for tumor grading var 2

1.71 og 2

0,91 hhv. Baseret på disse cut-off point, systemet med niveauet for microRNA-99a udstillet en følsomhed på 74,2%, en specificitet på 83,3%, en PPV på 91,5%, en NPV på 58,1%, en LR + på 4,46 og en LR på 0,31. I tilfælde af microRNA-125b var disse værdier 81,4%, 87,0%, 93,4%, 67,0%, 6,11 og 0,21, henholdsvis til at skelne tumor kvaliteter (tabel 2). Ved kombination af niveauerne af microRNA-99a og microRNA-125b i systemet, CI formel blev CI = 1 /{1 + exp [- (1,742 + 0.0295xΔCq

microRNA-125b + 0.496xΔCq

microRNA-99a )]}, med 0,7398 som cut-off point. Følsomheden, specificitet, PPV, NPV, LR + og LR var 79,4%, 88,0%, 94,7%, 61,1%, 6,61 og 0,23, henholdsvis (Tabel 2). Alle disse værdier var enten sammenlignelige med eller lavere end for de systemer, der anvender enten microRNA-99a eller microRNA-125b alene. Taget helt, systemet ved hjælp microRNA-125b alene udføres bedre til at skelne mellem høj- og lav kvalitet UCB.

Sammenhæng mellem udtryk for microRNA-99a og microRNA-125b i urin supernatanter og blærekræft og kontrol væv

Via en Pearson korrelationsanalyse, de microRNA-99A og microRNA-125b niveauer i både væv og urin supernatanter af de patienter og kontrolpersoner var stærkt korreleret (R = 0,896, p 0,001 for vævsprøver; R = 0,982, p 0,001 for urin supernatant prøver) (figur 3C), hvilket tyder på, at deres udtryk kan have været co-reguleret. Faktisk blev disse gener grupperet på q21.1 region af kromosom 21 (figur 3D).

Restaurering af microRNA-99A og microRNA-125b udtryk i post-operative patienter

For at demonstrere den afgørende forbindelse mellem blærekræft status og nedsat microRNA-99a og microRNA-125b niveauer i urinen supernatanterne blev disse to microRNA’er kvantificeret i urinen supernatanter af præ-operative og postoperative patienter. Tyve patienter blev rekrutteret (tabel 1). Postoperativ urin blev opsamlet 4 uger efter en transuretral resektion. Efter resektion, patienterne var i stand til at gendanne microRNA-99A og microRNA-125b niveauer i urinen supernatanten (Wilcoxon signed-rank to-relaterede-prøver test, p 0,01) (Figur 4) til niveauer sammenlignelige med de af normale kontrolprøver (figur S2).

Den samlede RNA blev ekstraheret fra urin supernatanter af UCB patienter med lav kvalitet (n = 15) (skraveret bar) eller high-grade kræft (n = 35) ( sort bjælke) og normale kontroller (n = 21) (hvid bar). Niveauerne af seks microRNA i prøverne blev kvantificeret ved RT-qPCR in duplo. (A) De relative niveauer (2-ΔCq) af microRNA-133a, microRNA99a, microRNA-1, mikroRNA-143, mikroRNA-133b og microRNA-125b i urinen supernatant prøver præsenteres. En Mann-Whitney U test blev udført for at sammenligne UCB patienter og normale kontroller. Kolonner, Midler; Barer, S. D. .; ** Angiver p 0,01; * Betegner p 0,05. (B) ROC kurver af microRNA-99a alene (blå linje), mikroRNA-125b alene (rød linje) og mikroRNA-99a og microRNA-125b i kombination (sort linje) til diagnosticering af UCB (til venstre) og forskelsbehandling mellem lav- og high-grade tumorer (højre). De cut-off punkter blev indstillet, og AUC-værdier bestemmes baseret på Youden indeks. (C) Resultater af en Pearson korrelationsanalyse af indholdet af microRNA-99a og microRNA-125b i væv og urin supernatant prøver. Scatter plots af de relative niveauer af disse to microRNA i prøverne præsenteres. The Pearson korrelationskoefficienten R blev beregnet via en Pearson korrelationsanalyse og p-værdien blev bestemt. (D) Kromosomale regioner af generne (

HSA-miR-99a

HSA-miR-125b-2

). Human Genome reference Consortium GRCh37 Patch Frigivelse 12 forsamling blev brugt.

Hsa-miR-99a

er placeret på kromosom 21: 17,909,409-17,913,489, og

HSA-miR-125b-2

er placeret på kromosom 21:. 17,960,557-17,964,645

Urinprøver blev indsamlet fra 20 UCB patienter før (præ-operative) og efter (postoperativ) transurethial resektion. Den totale RNA blev ekstraheret fra urin supernatanter og underkastes RT-qPCR at kvantificere niveauet af microRNA-99a (venstre) og microRNA-125b (højre). En Wilcoxon signed-rank to-relaterede-prøver test blev udført for at sammenligne niveauerne af microRNA-99a og microRNA-125b mellem præ- og postoperative prøver. * Betegner p. 0,01

Diskussion

Denne undersøgelse udviklet et effektivt cellefrit urin microRNA-baserede model til påvisning UCB med god diskriminerende effekt (AUC = 0,876) og høj følsomhed (86,7%) og specificitet (81,1%). Muligheden for at anvende urin microRNA’er som blærekræft diagnostiske biomarkører er tidligere undersøgt. Forholdet mellem microRNA-126 til microRNA-152 i urin blev undersøgt for at opdage UCB til en følsomhed på 82% og en specificitet på 72%, med en AUC-værdi på 0,768 [7]. Ved at studere ekspressionsniveauerne af microRNA-96 og microRNA-183 i urin sediment, test ved hjælp af disse to microRNA biomarkører uafhængigt viste følsomhed 71% og 74%, særlige forhold 89% og 77% og AUC-værdier på 0,8331 og 0,817 henholdsvis [ ,,,0],18]. Brug af CI af microRNA-99a og microRNA-125b niveauer i urin supernatant her væsentligt forbedret effektiviteten af ​​den diagnostiske test for UCB detektion. Desuden diagnostiske præstation var bedre end kommercielt tilgængelige urin-baserede biomarkører (tabel S1).

I modsætning til mRNA, der er sårbare over for miljøet RNase, microRNA er relativt stabile i kliniske prøver. MikroRNA’er forbliver intakte, selv under ugunstige forhold såsom høje temperaturer, ekstreme pH-værdier og 10 fryse-tø cykler [6]. Desuden er de let påvises i human plasma eller serum ved hjælp af RT-qPCR, selv ved meget lave niveauer [7] – [8]. Tumor-associerede ændringer microRNA udtryk profiler i omløb systemet har givet en ny tilgang til kræft diagnose og prognose. I 2008 Lawrie et al. [19] rapporterede, at en forhøjet microRNA-21 serumniveau var forbundet med tilbagefald overlevelse af patienter med diffust storcellet B-celle lymfom. Ng et al. [20] viste den diagnostiske betydning af plasma microRNA i kolorektal cancer screening. Disse undersøgelser indikerede potentialet af cirkulerende microRNA i serum /plasma som biomarkører for påvisning af kræft. Foruden serum /plasma, microRNA er meget stabile i urin [17] – [18], og dermed påvisning af intakte microRNA i urin er lovende. Wang et al. [21] identificerede celle-fri urin mikroRNA-146a og microRNA-155 som effektive diagnostiske biomarkører for systemisk lupus erythematosus, der implicerer den kliniske betydning af cellefrie urin microRNA i sygdomsdiagnose og eventuelt prognose. Selvom udbyttet af microRNA fra urin supernatant relativt lav sammenlignet med dem fra hele urin eller urin sediment, er urin supernatant anses det bedste valg som biomarkør for sygdom diagnose og prognose [21]. Sammenligning nytten af ​​urin DNA i supernatanten og sediment for UCB påvisning, Szarvas et al. [11] samtidigt analyseret urin DNA i supernatanter og sediment i patienter og sammenlignede dem med kontroller. Deres resultater indikerede, at urinen supernatanter viste højere følsomhed end sedimentet [11]. Dette var sandsynligvis relateret til forurening af blodlegemer i urinprøver fra hæmaturi patienter. De kontaminerede blodceller kan have ændret urin microRNA /dna-profiler i prøverne og dermed forstyrret klassificering kræft afsløring. I modsætning hertil selv urin supernatanter fra patienter med svær hæmaturi var relativt mere homogene uden indblanding grund af de forurenede blodlegemer i microRNA profiler. Derfor kan urin supernatanter give mere bekvemme og pålidelige prøver til kræft diagnose og overvågning sygdom.

Urinary microRNA profiler er udsat for forskellige modifikationer såsom direkte frigivelse af microRNA fra kræft væv, immunrespons på cancer og blodceller fra hæmaturi patienter. En forundersøgelse involverer en kandidat microRNA tilgang ved qPCR blev udført for at undersøge et lille panel af microRNA i urinen supernatanter af patienter blærekræft [22]. Her blev omfattende microRNA profiler opnået med microRNA mikroopstillingerne cellefrie urinprøver supernatanter fra UCB-patienter og kontroller, som blev bekræftet at have nogen cystological abnormiteter eller andre samtidige maligniteter, og blev sammenlignet for at identificere differentielt udtrykte cellefrie urin microRNAer for UCB. De microRNA blev foretaget fokus på grund af deres direkte frigivelse af kræft væv og niveauet af disse kandidater i kræft væv og deres normale modstykker blev sammenlignet for at validere væv. De microRNA identificeret, er formentlig funktionelt involveret i UCB udvikling og /eller sygdomsprogression. De kan bruges som biomarkører for detektion og overvågning sygdom. De microRNA microarray analyseresultater indikerede tilstedeværelsen af ​​mere end 100 microRNA i urinen supernatanter. Blandt disse var der flere ned-regulerede microRNA end up-regulerede microRNA i kræftpatienters urin supernatanter. Dette fund var ligner tidligere er konstateret, at størstedelen af ​​differentielt udtrykte microRNAer blærekræft væv blev nedreguleret [23]. Disse ned-regulerede microRNA kan spille tumor undertrykkende roller i carcinogenese [24]. Den ændrede udtryk for seks microRNA kandidater identificeret ved sammenligninger af urin cellefrie microRNA profiler af UCB patienter og kontroller blev også observeret i blæren tumorvæv i. Ved hjælp af et uafhængigt sæt urinprøver blev ned-regulerede udtryk for fire microRNA’er bekræftet . Som tumorvæv direkte kan udskille microRNA i en patients plasma [25], er det sandsynligt, at urin microRNA oprindeligt udskilles af blærekræft væv og /eller frigivet fra nekrotiske /apoptotiske maligne og endog ikke-maligne epitelceller, støbning af microRNA profiler af urin supernatanter. Således kunne udtrykket mønstre af forskellige microRNA i blære kræftceller afspejles af deres urin supernatant profiler. Dog kan ikke alle de differentielt udtrykte microRNA i kræft væv anvendes som urin diagnostiske biomarkører for UCB. De udtryk for microRNA-1 og microRNA-133a blev tidligere rapporteret at være nedreguleret i blærekræft væv og viste funktionelle betydning i carcinogenese via målrettet TAGLN2 i kræftcellerne [26]. I den foreliggende undersøgelse blev deres niveauer i urinen supernatanten undersøgt, men ingen statistisk signifikant forskel blev vist mellem kræftpatienter og kontroller. Dette kan indebære andre forstyrrende faktorer, såsom løsladelsen af ​​microRNA fra normale urin epitelceller og immunceller støbning af microRNA profil i urinen supernatanter at maskere den differentierede udtryk for nogle kræftrelaterede microRNA.

Af de fire microRNA’er , mikroRNA-99a og microRNA-125b havde de største AUC-værdier i ROC kurver for detektion og kunne fungere som diagnostiske biomarkører for blærekræft. De blev også fundet at være mere markant nedreguleret i high-grade UCB end i lav kvalitet UCB. Efter en komplet transuretral resektion af tumorerne, niveauerne af tidligere nedreguleret mikroRNA-99a og microRNA-125b i urinen supernatanter steget, implicerer en stærk sammenhæng mellem deres niveauer og patienternes tumor statusser. Dette understøtter yderligere deres potentielle roller som diagnostiske biomarkører for UCB og overvågning biomarkører til overvågning tumor tilbagefald. Baseret på disse modeller, når en patient har en positiv urin supernatant testresultat med en CI større end cut-off (0,6244), han eller hun sandsynligvis har blærekræft, med en nøjagtighed på 91,8%. Hvis den normaliserede ekspressionsniveauet af microRNA-125b er lavere end 2

1,71, er der en 93,4% chance for, at patienten har cancer høj kvalitet. Men fordi den negative forudsige værdien var 71,4% i denne undersøgelse, negative resultater kan ikke bruges til at udelukke muligheden for blærekræft hos patienter.

Den foreliggende undersøgelse viste, at niveauerne af microRNA-99a og microRNA- 125b i urinen supernatanten af ​​UCB patienter og kontrolpersoner blev stærkt korreleret med dem i vævene. Faktisk er de to gener (

HSA-MIR-99a

HSA-MIR-125b-2

) er placeret i intron 6 af den lange intergeniske ikke-proteinkodende RNA 478 (

LINC00478

) i kromosom 21. Deres udtryk er sandsynligvis co-reguleret af promotoren, der styrer transskriptionen af ​​

LINC00478

gen. Den underliggende mekanisme for nedregulering af disse to microRNA’er i UCB kan være relateret til den hyppigt observerede tab af genomisk 21q i UCB. Tzai et al. [27] rapporterede en hyppig allelisk tab på 36,6% i den lange arm af kromosom 21, hvor de to gener er placeret, i UCB. Desuden patienter med Downs syndrom viste en nedsat risiko for at dø af urologiske neoplasmer, hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​gener i kromosom 21 undertrykke urologiske kræftsvulster [28].

MicroRNA-99a og microRNA-125b har vist sig at have tumor-suppressive roller i forskellige humane cancere [29] – [34]. I prostatacancer, microRNA-99a undertrykker ekspressionen af ​​prostata-specifikke antigener og prostatacancer celleproliferation ved at interferere med ekspressionen af ​​to chromatin remodeling faktorer, SMARCA5 (SWI /SNF-relateret matrix-associeret actin-afhængig regulator af kromatin underfamilie Et medlem 5) og SMARCD1 (SWI /SNF-relateret matrix-associeret actin-afhængig regulator af kromatin underfamilie D medlem 1), og væksten regulatoriske kinase mTOR (pattedyr mål for rapamycin) [29]. Faktisk blev en høj ekspression af phosphoryleret mTOR fundet i 74% af muskel-invasiv urothelical carcinomer, i forbindelse med forøget patologiske stadier og nedsat sygdomsrelateret overlevelse [30]. Hæmningen af ​​mTOR fandtes at falde

in vitro

in vivo

blærekræft cellevækst [30]. Som microRNA-99a målretter mTOR i prostatacancerceller [29], nedreguleringen af ​​denne microRNA i UCB demonstreret i den foreliggende undersøgelse kan afskaffe tumorfremmende effekter af mTOR i cellerne, hvilket resulterer i udvikling af cancer. Imidlertid er yderligere demonstration af reguleringen af ​​mTOR af microRNA-99a i blære cancerceller påkrævet.