PLoS ONE: Identifikation af mutationer i forskellige regioner af p85 Alpha i urothelial Cancer

Abstrakt

Blære kræftformer viser almindeligt genetiske afvigelser i phosphatidylinositol 3-kinase signalvej. Her har vi screenet for mutationer i

PIK3R1

, som koder p85α, en af ​​de regulatoriske underenheder af PI3K. To hundrede og fireogtres blæretumorer og 41 blære tumorcellelinjer blev screenet og 18 mutationer blev påvist. Tretten mutationer var i C-terminale domæner og forventes at forstyrre interaktionen mellem p85α og p110α. Fem mutationer var i BH-domænet i PIK3R1. Denne region er blevet impliceret i p110α-uafhængige roller p85α, såsom binding til og ændring af aktiviteter PTEN, Rab4 og Rab5. Angivelse af disse mutant BH-p85α former i muse embryonale fibroblaster med p85α knockout viste, at alle former, undtagen afstumpningsmutanter, kunne binde og stabilisere p110α men øgede ikke AKT fosforylering, hvilket tyder på, at BH mutationer fungere uafhængigt af p110α. I et panel af 44 blære tumorcellelinjer, havde 80% reduceret PIK3R1 mRNA-ekspression i forhold til normale urothelial celler. Dette, sammen med mutation af

PIK3R1

, kan ændre BH domænenavn fungerer. Vores resultater antyder, at mutantformer af p85α kan spille en onkogen rolle i blærecancer, ikke kun via tab af evne til at regulere p110α, men også via ændret funktion af BH-domæne.

Henvisning: Ross RL, Burns JE, Taylor CF, Mellor P, Anderson DH, Knowles MA (2013) Identifikation af mutationer i forskellige regioner af p85 Alpha i urothelial Cancer. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10,1371 /journal.pone.0084411

Redaktør: Karl X Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: September 30, 2013; Accepteret: November 18, 2013; Udgivet: 18. december 2013 |

Copyright: © 2013 Ross et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte fra Yorkshire Cancer Research (https://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) og University of Leeds MRC studentship (MK, RR), canadiske Institutes of Health Research (http: //www.cihr-irsc.gc. CA /e /193.html) (MOP84277) (DA), og Saskatchewan Health Research Foundation Fellowship (https://shrf.ca/)(PM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalvejen spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​cellevækst, proliferation og overlevelse [1], og mutationer, der fører til afvigende aktivering af vejen findes i stort set alle typer af kræft. I urothelial carcinoma (UC) af blæren, har flere genomiske ændringer, der fører til deregulering af vejen blevet identificeret. Disse omfatter inaktivere mutationer i

PTEN

TSC1

aktiverende mutationer i

PIK3CA

Akt1

[2,3,4,5,6, 7,8]. Tidligere viste vi, at flere af disse begivenheder er ikke-redundante, hvilket antyder, at mutation af mere end én vej element kan have additive eller synergistiske virkninger [4]. Disse ændringer forekommer både ved lav kvalitet, ikke-invasiv og muskel-invasiv UC, hvilket indikerer, at denne reaktionsvej spiller en kritisk rolle i UC udvikling og antyder, at det er et vigtigt terapeutisk mål i disse kræftformer.

PE3 kinaser phosphorylere 3 fastsatte stikprøver stilling på inositol ring af phosphinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) til at generere den lipid second messenger phosphinositol-3,4,5-triphosphat (PIP3), som aktiverer AKT nedstrøms signalering. Klassen IA PI3Kαis en obligat heterodimer bestående af den p110αcatalytic underenhed (p110α), kodet af

PIK3CA

gen, og en regulatorisk subunit, kodet af en af ​​tre gener,

PIK3R1, PIK3R2

PIK3R3

. De regulatoriske underenheder er afgørende for stabiliteten af ​​p110α og i hviletilstand undertrykke dens katalytiske aktivitet [9]. Hver har to SH2-domæner, der kan binde aktiverede membranbundne vækstfaktorreceptorer eller adaptormolekyler, ændre dets konformation, lindre hæmning af p110α og tillade p110α at phosphorylere PIP2 [10]. Salg

Mutationer af

PIK3R1

, kodning p85α, er blevet rapporteret i nogle kræftformer. I en muselymfom fremkaldt af X-bestråling, en afkortet (p65) formular, der kun indeholder aminosyrer 1-571 blev identificeret og vist til at give øget

in vitro

kinase aktivitet på p110α [11]. Denne afkortede form af p85α blev senere vist at mangler den kritiske inter-SH2 (iSH2) region kræves til inhibering af p110α aktivitet [12]. En tilsvarende afkortede form blev rapporteret i en human Hodgkins lymfom cellelinie [13] og 4 mindre deletioner, inden exonerne 14 eller 15, som koder for iSH2 området, ovarie- og coloncancer [14]. To splejsning mutationer blev også identificeret, som begge førte til spring i exon 15. Ekspression af et af disse mutantformer med en deletion af exon 13 resulterede i konstitutiv aktivering af PI3K pathway i celler, som godtgør, at mutant p85 kan fungere som en onkogen i human cancer. En 9 bp deletion omfatter exon-intron junction af exon 12 [15] og 9 andre mutationer, hvoraf 8 var i iSH2 region blev identificeret i glioblastomer [16] og 15 mutationer blev fundet i tyktarmskræft, hvoraf størstedelen var vist sig at reducere sin p110α-inhiberende aktivitet samtidig bevare evnen til at stabilisere den komplekse [17]. En enkelt

PIK3R1

mutation blev for nylig rapporteret i en undersøgelse af UC, der screenede exon 12, 14 og 15, ( 1% frekvens) [18]. I modsætning til disse lave mutation frekvenser, er det for nylig blevet rapporteret, at 20 – 40% af endometrioide livmoderkræft indeholder

PIK3R1

mutationer, de fleste i nSH2 og iSH2 domæner [19,20].

Vores tidligere fund af mutationer i flere dele af PI3K vej hos UC, og konstateringen af ​​

PIK3R1

mutationer i andre typer kræft, fik os til at søge efter mutationer i

PIK3R1

. Som bevis har vist, at, at N-terminale domæner af p85α har onkogene funktioner, valgte vi at screene hele den kodende sekvens af

PIK3R1

, frem for at fokusere på exonerne 12, 14 og 15. Her rapporterer vi en serie af mutationer i UC-afledte cellelinjer og primære UC tumorer, herunder deletioner i iSH2 regionen og en række missense-mutationer, flere i breakpoint cluster region homologi (BH) domæne, som har GTPase aktivitet over Rab5 [21] og kan binde PTEN [22,23]. Vores resultater antyder, at mutantformer af p85α kan spille en onkogen rolle i blærecancer, ikke kun via tab af evne til at regulere p110α, men også via ændret funktion af BH-domæne.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af Leeds East Research Ethics Committee (99/156) og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Patient prøver og DNA Isolation

Kolde kop biopsier af 264 urothelial karcinomer (UC) blev indsamlet, snap-frosne og opbevares i flydende kvælstof. Resten af ​​vævet blev indlejret i paraffin til diagnostisk vurdering. Tumoren Panelet bestod af 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 pT2G3, 5 G1, 8 G2 og 4 G3 tumorer uden underliggende stroma (PTX) og 11 tumorer med ingen oplysninger [24,25]. Alle var overgangsperiode cellecarcinom. DNA blev ekstraheret fra frosne sektioner og venøse blodprøver som beskrevet tidligere [4].

urotelial cellelinjer

Fyrre-fire UC cellelinier (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97-24, 97-7, BC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, HT1376, J82, JMSU1, JO’N, KU -19-19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, SCaBER, SD, SW780, SW1710, T24, TCCSUP, U-BLC1, UM-UC3, VM -CUB-1, VM-CUB-2 og VM-CUB-3) blev undersøgt (tabel S1). LUCC1-LUCC8 linjer blev etableret i forfatternes laboratorium fra blære tumorvæv opnået med skriftligt informeret samtykke. Cellelinie identitet blev verificeret ved korte tandemgentagelse DNA-typebestemmelse under anvendelse Powerplex 16 kit (Promega). Profiler blev sammenlignet med offentligt tilgængelige data (ATCC, DSMZ), eller hvor ingen henvisning profil var til rådighed, blev bekræftet som unik. DNA blev ekstraheret som tidligere beskrevet [4].

Mutation analyse

Hele den kodende sekvens af

PIK3R1

blev undersøgt i 18 fragmenter ved høj opløsning smeltning analyse som beskrevet [26 , 27]. DNA fra matchede blodprøver blev analyseret for at bekræfte somatisk mutation status. Primersekvenser er angivet i tabel S2. Mutationer blev registreret med reference til NM_181523.

allelspecifik PCR (AS-PCR) blev udført for at fastslå fasen af ​​parrene af mutationer i cellelinjen LUCC3 og i tumor prøve 2 (tabel 1). En fremadrettet primer blev designet til specifikt at amplificere mutant allelen ved 5 ‘mutationssitet og blev matchet med en revers primer positioneret til at omfatte anden mutation i PCR-produktet (tabel S3). Produkter blev kørt på en agarosegel for at identificere vellykket amplifikation fra tumor /cellelinje-DNA alene og ingen amplifikation fra blod og WT DNA. PCR-produkter var sekvens-verificerede

Sample Turklasse /fase

Exon

Nukleotid ændre

Forudsagt aminosyre ændring

1TaG32

1c..409G . AE137K2TxG35c.652GT E218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310

2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W

3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 splejsning acceptorc.1986-1 G Cunknown Tabel 1. Mutationer i PIK3R1 identificeret i blæretumorer og cellelinier

1cDNA henvisning sekvens:. NM_181523;

2 mutation i kun en mindre population af sekvenser;

3cell linje. CSV Hent CSV

Expression vektorer og transduktion af cellelinjer

Kloning af indsatse, der koder for fuldlængde vildtype (WT) humant p85α og kvæg p85α R274A mutant i pGEX-6P (GE Healthcare Life Sciences) er blevet beskrevet [21]. Mutanter E137K, R162 *, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q blev skabt ved site-directed mutagenese ved anvendelse af QuikChange fremgangsmåden (Stratagene, CA, USA) og klonet ind pFB Hyg [28] i-ramme med en N-terminal HA-mærke hjælp infusionen metoden (Clontech, CA, USA).

Kontrol cDNA’er, N564D og p85Δ, blev venligst leveret af Genentech [17] og subklonet ind pFB Hyg ved den samme metode. Alle plasmider blev sekvens-verificeret. Konstruktioner blev transficeret i Phoenix A celler under anvendelse Transit 293 (Mirus, Madison, USA). Muse embryonale fibroblaster (MEF’er) med knockout af p85α, β, δ (en venlig gave fra Lewis Cantley, Harvard Medical School), NIH3T3 musefibroblaster og Rat1 rottefibroblaster, blev inkuberet med retroviral supernatant indeholdende 8 ug /ml polybren og selekteret med 500 , 200 og 250 pg /ml hygromycin hhv.

Funktionel karakterisering af BH domæne mutanter

Celler blev lyseret og protein udvundet ved hjælp CelLytic pattedyr Cell Lysis Reagent (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) ifølge fabrikantens anvisninger og kvantificeret som beskrevet tidligere [29]. Anti-HA Immunfældning Kit (Sigma-Aldrich) blev anvendt ifølge producentens instruktioner for co-immunopræcipitation eksperimenter. Immunblottet proteiner blev inkuberet med primære antistoffer; anti-p85α (Abcam, Cambridge, UK), anti-p110α, anti-Pakt (Ser473), anti-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, UK) og anti-tubulin alfa (ABD Serotec, Kidlington, Oxford, UK). blev påvist bundne primære antistoffer ved anvendelse HRP-konjugeret sekundært antistoffer og Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore, Watford, UK). Anchorage-uafhængig vækst blev udført som beskrevet tidligere [29] og kolonier med en diameter ≥ 50 um blev talt inden for 2,5 mm

2.

Analyse af PIK3R1 mRNA og protein-ekspression i UC

PIK3R1 mRNA udtryk data for 105 blære tumor prøver og 52 normale blære prøver rapporteret af Sanchez-Carbayo et al [30] blev åbnet. PIK3R1 proteinekspression blev vurderet i 44 UC-cellelinjer og puljet normale humane urothelial celler (NHU-pool) ved western blotting og normaliseret til tubulin.

Resultater

Identifikation af somatiske

PIK3R1

mutationer

Vi screenede hele den kodende sekvens af

PIK3R1

for mutationer i 264 UC tumorvæv og 41 UC cellelinier. De tre kendte isoformer af PIK3R1, p85α p55α og p50α indeholder forskellige exons. Exon 1-6 er unikke for p85α, exon 7 er kun til stede i p50α og exon 8 kun p55α. Exon 9-17 er til stede i alle isoformer men brugen af ​​et kryptisk splejsningssite inden exon 16 resulterer i genereringen af ​​cDNA’er, der afviger i længde med 8 kodoner [31], som begge var omfattet af denne skærm. Atten mutationer blev identificeret i 13 tumorer. En tumor (tumor 2) indeholdt tre og en (tumor 5) indeholdt to mutationer (tabel 1). Alle blev bekræftet som somatiske mutationer ved deres tilstedeværelse i det tumor-afledte DNA, men ikke patientens blod. En tumor-afledt cellelinje (LUCC3) indeholdt to mutationer og disse blev også bekræftet som somatisk oprindelse. Alle mutationer blev bekræftet ved gentagne PCR-amplifikationer at udelukke PCR artefakter. Arten og fordelingen af ​​mutationerne er vist i forhold til p85α proteinstruktur i figur 1. Fem blev placeret i BH-domæne (fig S1). Ingen var i exoner der er unikke for p50α eller p55α, selvom flere blev placeret i exon 2, 5 og 6, der er unikke for p85α. Ingen mutationer blev identificeret i region exon 16, som er alternativt splejsede.

allelspecifik PCR (AS-PCR) blev anvendt til at bestemme, om de 2 mutationer i cellelinjen LUCC3 (c.1519GC og c.1670GC, E507Q og R557P) og 2 exoniske mutationer i tumor 2 (c.652GT og c.862AC, E218 * og K288Q) var til stede i

cis

eller i

trans

. I LUCC3, en mutation primer for c.1519C held amplificeret et PCR-produkt fra exon 13.- 14. (Figur S2A). Sekventering af dette produkt bekræftede tilstedeværelsen af ​​mutation c.1670C, hvilket indikerer, at begge iSH2 domæne mutationer er på samme allel. AS-PCR-analyse af tumor 2 bekræftede også, at de 2 exoniske mutationer (BH domænenavn E218 * og K288Q mutationer) var til stede på den samme allel (figur S2B).

tumor 5, sekvens profiler viste, at én af mutationerne (R358 *) var til stede som kun en mindre population af molekyler, mens den anden (Q579_Y580del) syntes heterozygot. Det genomiske afstand mellem exonerne 10 og 14 udelukket udvikling af en allel-specifik PCR assay til bestemmelse af, om disse mutationer var på samme allel. Den lille signal fra R358 * mutationen kan indikere, at det var til stede som kun en mindre sub-klonal begivenhed. Dette viste sig at være tilfældet, da analyse af væv fra en efterfølgende tilbagefald i denne patient viste kun Q579_Y580del.

Forventet Effekt af mutationer på Protein Funktion

Placeringen af ​​missense muterede rester, er repræsenteret i den tilgængelige krystalstruktur er vist i figur 2. To mutationer, R358 * og N377K, blev identificeret i nSH2 domæne. Nye undersøgelser tyder på, at denne region af p85α fungerer som et stillads for p110α – p85α kompleks, med interaktioner med C2, spiralformede og kinase domæner p110α og med p85α iSH2 [32]. R358 * afkorter proteinet på nSH2 phosphopeptid bindingssted (FLVRDAS). Denne samme mutation blev for nylig rapporteret i 5 endometriecancer prøver, hvor det udgjorde mindst 5% af alle mutationer identificeret [20]. Arginin 358 er blevet identificeret som danner en saltbro med E542 i p110α [32] og det manipulerede mutation R358A blev vist at ophæve phosphopeptid binding [9]. Således tab af R358 og trunkering på dette punkt er sandsynligvis resultere i afbrydelse af phosphopeptid binding og interaktion p85α med den spiralformede domæne af p110α og kan efterligne virkningen af ​​p110α spiralformede domæne mutationer. Vi har tidligere vist, at de spiralformede domæne mutationerne E542K og E545K er langt de mest almindelige mutationer findes i

PIK3CA

i blærekræft [4] og er mere potent end H1047R at inducere signalering nedstrøms for AKT og spredning ved sammenløb og under forhold med næringsstoffer udtynding når de udtrykkes i normale urothelial celler [29]. Som R358X trunkering mutanten fjerner både iSH2 og cSH2 områder af proteinet, er interaktion med C2-domænet af p110α tabt og virkninger kan efterligne dem beskrevet for mutationer og trunkeringer påvirker disse domæner [33]. Fra sekventeringsdata, og viden om, at der var minimal kontaminerende normalt væv i prøven, denne mutation syntes at være heterozygot. Det er således forudset, at der ud over det trunkerede protein, ikke-mutantprotein var tilgængelig for p110α bindende og stabilisering i denne tumor.

A. Bånddiagram af strukturen af ​​komplekset af p110α med niSH2 region p85α (PDB-kode 2RD0) viser rester muteret i UC. B. Forholdet p85α nSH2 at p110α C2-domænet viser nærhed af N377 i nSH2 til C2 domænet rest E365. C. Forholdet mellem iSH2 domæne p85α med C2 domænet af p110α viser nærhed R557 til N345 i C2. D. Space-påfyldning model, der viser R481 og R557-rester i iSH2 af p85α i kontakt med C2 af p110α. E. struktur p85 dimer (PDB kode 1PBW), der viser placeringen af ​​PIK3R1 punkt-muterede rester E137, R262 og K288 og regionens slettet (W237-Y242) i UC i forhold til rester, der er involveret i p85 dimerisering (M176, mørk grøn /lys cyan, L161, I177 og V181, lys grøn /cyan). Positionen af ​​rest R274 (magenta), som er impliceret i Rab-GAP-aktivitet er også vist. Desuden er tre glutaminsyrerester (E266, E284 og E291), som interagerer med R262 angivet, med E291 også interagere med K288.

N377, der var muteret til lysin, der støder op til G376, der fandtes tidligere at være muteret til arginin i 3 tilfælde af glioblastoma [16,34]. Begge rester er inden for en region (374-377), der forudsiges at interagere med resterne 364-371 i C2-domænet af p110α [32]. I krystalstrukturen af ​​p110α i kompleks med p85niSH2, både G376 og N377 er inden hydrogenbinding afstand af E365 i p110α C Figur 2B.

Seks missense mutationer og to i-frame sletninger blev identificeret i iSH2 domænet. Dette er den region, hvor størstedelen af ​​mutationer er blevet fundet i andre cancere, om ingen af ​​ændringer findes her er identiske med dem, der tidligere [14,16,17,19,20] rapporteret. Denne region af proteinet er involveret i interaktion med adapter-bindende region af p110α og stabilisering og inhibering af dets katalytiske aktivitet i den basale tilstand via interaktion med C2-domænet. Den forudsagte virkning af nogle mutationer i iSH2 er at afbryde grænsefladen med p110α C2 [16,33]. For eksempel p85α rest, N564, er inden for hydrogenbinding afstand af N345 i p110α C2 (figur 2C), en rest, der er fundet muteret i p110α [35]. D560Y rapporteret i glioblastom [16] er også inden for hydrogenbinding afstand af N345 og begge disse forudsiges derfor at efterligne den onkogene N345 mutation. Her fandt vi en ny mutation, R557P der ligger også tæt på N345 i p110α (Figur 2C). R481, som blev fundet muteret til tryptophan, er også i umiddelbar nærhed af C2-domænet af p110α Figur 2D).

De to i-ramme-deletioner identificeret i iSH2 (I566_D578del og Q579_Y580del) fjerne aminosyrerester, der har vist sig at blive slettet i æggestokkene og tarmkræft [14,17] og glioblastom [16], og forventes at forstyrre den spiralformede sekundære struktur i denne region og forstyrre interaktion med p110α C2. Mutationen Q579_Y580del er blevet rapporteret til at binde og stabilisere p110α men har nedsat evne til at regulere lipid kinase aktivitet af p85α p110α holoenzym [17]. For nylig, ni af de nSH2 og iSH2 mutationer findes i andre cancere blev udtrykt i fibroblaster og alle induceret transformation, målt ved fokus-dannende aktivitet, øget proliferation og øget signalering via PI3K [36]. Specifikke inhibitorer af p110α, men ikke inhibitorer af p110β p110γ, eller p110δ afskaffet de fænotypiske virkninger af to af disse tumorafledte mutantformer (KS459delN, DKRMNS560del), hvilket indikerer, at den onkogene aktivitet af disse mutanter entydigt medieres af p110α.

den mest N-terminale iSH2 mutation identificeret, N441I, er i en linker region mellem nSH2 og iSH2, og ligger tæt på slutningen af ​​den anden alfa-helix af iSH2. Denne region er ikke løst i de offentliggjorte krystalstrukturer og dens potentielle virkning er ikke klart. T654I i cSH2 domæne er tæt på flere rester, der er muteret i tarmkræft [17] og er umiddelbart op til den FLVRES motivet (rester 646-651), der kræves for phosphotyrosin engagement. En serin- eller threoninrest i denne position er fundet i de SH2-domæner af en lang række proteiner. Flere mutationer i dette domæne er blevet rapporteret i tarmkræft [17], men ikke i glioblastom [16,34], øge muligheden at der kan være væv specifikke forskelle.

Interessant, fandt vi fem mutationer i BH domæne af PIK3R1 (28% af mutationer fundet) (figur 1, figur S1). Tidligere mutation skærme har identificeret kun syv mutationer i denne region (K142fs, E160 *, R162 *, I177N, E217K, N285H, E297K) i mere end 1550 prøver af andre tumorer rapporteret til dato [14,16,17,18,19, 20,34] ( 0,5%). Alle missense mutationer i denne region (E137K, R262T og K288Q) er i stærkt konserverede rester (Figur S3). Strukturen af ​​dette område af proteinet (aminosyrer 105-319) som en homodimer er blevet rapporteret [37]. Grænsefladen mellem BH-domæner blev vist at involvere interaktion af M176 fra én monomer med L161, I177 og V181 på den anden. De tre punktmutationer og sletning identificeret her, er fjernt fra denne region af interaktion (Figur 2E).

P85α BH domæne mutanter interagere med og stabilisere p110α

For at bestemme om BH domænenavn mutant proteiner har p110α afhængige virkninger, vi testede deres evne til at interagere med og stabilisere p110α. p85α blev β δ knockout (pan-p85 null) MEF’er transduceret med retrovirale ekspressionsvektorer koder N-terminal HA-mærket p85α cDNA kodende BH domænenavn mutantformerne identificeret i UC (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), andre mutant former som kontroller (R162 *, p85Δ, R274A-kvæg, N564D), vildtype (WT) eller tom vektor. R162 * mutant p85α er en BH domænenavn mutation tidligere identificeret i kræft [17] og ligesom p85Δ mangler p110α bindende region (n-iSH2) [38]. Begge har tidligere vist sig ikke at interagere med p110α [17]. N564D iSH2 mutant p85α blev anvendt som en positiv kontrol, som det tidligere er blevet vist at binde p110α, øge PI3K og AKT-aktivitet, og inducerer celleoverlevelse, forankringsuafhængig vækst og transformation-relaterede fænotyper, der var p110-afhængige [17]. Den blev også brugt her for at vurdere potentielle forskelle mellem BH og iSH2 domænenavn mutante former af p85. R274A er en manipuleret BH-domæne mutantform af bovin p85α, der tidligere er blevet vist at inhibere p85-GAP-aktivitet og var onkogene [21,39].

Ekspression af p85α blev bekræftet ved Western blotting (figur 3A). En trunkeret p85α-protein var synlig i R162 * -MEF (18 kDa), men i E218 * -MEF, blev det trunkerede protein (24 kDa) udtrykt på et meget lavt niveau. Tre uafhængige transduktioner med E218 * virus konsekvent induceret lav proteinekspression hvilket antyder, at dette protein kan være ustabil. Interessant, R162 * -MEF udtrykte også en lille mængde af fuld længde p85α protein.

A. Immunblot viser p85α protein ekspressionsniveauer i transducerede celler. B. Co-immunopræcipitation af HA-mærkede proteiner efterfulgt af immunoblot med p85α og p110α at bestemme p85-p110 bindende. C. Immunblotanalyse af PI3K signalering (niveauer af Pakt (Ser473)) i serum-holdigt medium og søjlediagram viser kvantificering af normaliserede Pakt til den samlede AKT forhold til kontrol. D. Immunblotanalyse af Pakt (Ser473) i serum medium og søjlediagram viser kvantificering af normaliserede Pakt til den samlede AKT forhold til kontrol.

Pan-p85 null MEF’er har lave niveauer af p110α, som kan genoprettes ved ekspression af vildtype p85α [40]. Vi bekræftede dette, og viste, at alle mutantformer undtagen E218 *, R162 * og p85Δ haft samme virkning (data ikke vist). Co-immunopreciptation af HA-tagged p85-proteiner blev anvendt til at vurdere p110α binding (figur 3B). Resultaterne viste, at alle p85 proteiner, undtagen E218 *, R162 * og p85Δ, kunne binde p110α.

BH og iSH2 domæne mutanter af p85α viser forskellige effekter på AKT aktivering og forankringsuafhængig vækst

p85α C-terminale domæne mutant former, der påvirker p110α aktivitet normalt resultere i aktivering af AKT. Dette er blevet påvist i flere p85α mutanter, der kan binde p110α [17,19,20]. I pan-p85 null MEF’er rekonstitueret med vildtype og mutantformer af p85α, fandt vi, at kun N564D mutant inducerede forøgede niveauer af phospho-AKT (Ser473) både i serumholdigt medium (figur 3C), og i tilstanden i serum -deprivation (data ikke vist). Dette blev også set i NIH3T3 udtrykkende vildtype og mutantformer af p85α når det holdes i serum-suppleret betingelser (figur 3D). Dette er i overensstemmelse med den tidligere fund i NIH3T3 at kvæg R274A ikke påvirker phosphorylering af AKT efter stimulering med PDGF [21]. Dette mønster blev afspejlet i proliferationshastigheder af MEF og NIH3T3-celler, når det holdes i serumholdigt medium og ved vurderingen forankringsuafhængig vækst af NIH3T3-celler (data ikke vist). Analyse af forankringsuafhængig vækst af Rat1 celler, der udtrykker vildtype og mutantformer af p85α viste, at selv BH-domæne-mutanter inducerede nogle kolonidannelse i forhold til vild type p85α, N564D havde den største virkning (fig S4).

Forholdet til andre mutationer i PI3K pathway gener

Tidligere vi screenet de analyserede prøver her for

PIK3CA

mutation [[4] og upublicerede data]. Kun to prøver indeholdt både

PIK3R1

og

PIK3CA

(E545K) mutationer og en af ​​disse var tumoren, der havde en BH domænenavn mutation (E137K) i

PIK3R1

. Samlet set 61 af tumorerne screenede indeholder

PIK3CA

mutationer (23%). Således

PIK3CA

mutation blev underrepræsenteret i den delmængde, der havde

PIK3R1

mutation (1 overholdes; 5 forventet). Således

PIK3R1

mutationer ikke i BH domænet synes at være gensidigt udelukkende med

PIK3CA

mutation i UC. Der var ingen signifikant sammenhæng af

PIK3CA

eller

PIK3R1

mutation med tumor lønklasse eller scene. Fire af prøverne indeholder

Akt1

mutationer (E17K), hvoraf ingen co-eksisterede med

PIK3R1

mutation.

TSC1

mutation status er kendt for 148 tumorer i serien, hvoraf 14 indeholder en mutation [4]. En af disse tumorer havde en mutation i BH-domænet i

PIK3R1

(W237_Y242del). Men prøve størrelse og mutation frekvenser er for lille til nogen væsentlig tilfældighed eller gensidig eksklusivitet kan identificeres.

PIK3R1 udtryk reduceres i UC og cellelinjer

Som p85α mutationer kan ændre protein: protein interaktioner af p85α, hvoraf nogle, især dem i BH domæne, kan indikere en tumor suppressor rolle , vi overvejet den mulighed, at nedregulering af proteinet kan bidrage til tumor udvikling.

PIK3R1

er placeret på kromosom 5 (5q13.1). Tab af heterozygositet (LOH) og kopi nummer tab af sekvenser på 5q er blevet rapporteret i blærekræft [41,42]. Ved vifte CGH har vi fundet, at 29% af muskel invasive UC har kopiantals tab i størrelsesordenen

PIK3R1

[43]. Undersøgelse af offentligt tilgængelige udtryk data indikerede, at UC har en signifikant reduktion i PIK3R1 ekspression på RNA-niveau (figur 4A).

A. Analyse af p85α mRNA ekspressionsniveauer i 105 blære tumorprøver og 52 normale blære prøver. Data fra Sanchez-Carbayo et al [30]. B. Kvantitativ analyse af p85α immunoblottedes protein prøver fra blære cancer cellelinjer normaliseret til tubulin og vist i forhold til samlede normale humane urothelial celler (NHU-pool).

Vi vurderede p85α proteinekspression i 44 UC celle linjer ved hjælp western blotting. Dette afslørede stor variation i ekspressionsniveauerne med hovedparten af ​​cellelinier (80%), der viser reduceret p85α proteinekspression sammenlignet med normale urothelial celler (figur 4B).

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi

PIK3R1

mutationer i 4,9% af UC. Den højere frekvens findes her end i den foregående undersøgelse af UC [18] afspejler vores vurdering af hele genet snarere end kun exon 12, 14 og 15. Vores data for disse tre exoner afslørede 5 mutationer (1,8% af tumorer), der er forenelige med denne tidligere undersøgelse. Størstedelen af ​​mutationer blev placeret i den C-terminale region af p85α ligner resultaterne i andre humane cancere [14,16,17,19,20]. Mutationer identificeret i nSH2 og iSH2 domæner kan efterligne effekten af ​​p110α mutationer ved at lindre den hæmmende regulering af p110α ved p85α og onkogene aktivitet af disse mutanter synes at være p110α afhængige [36].

Interessant, fandt vi en højere frekvens af BH-domæne mutationer sammenlignet med tidligere mutation skærme. Om dette er specifik for UC er endnu ikke klart grund af fokuseringen af ​​mange undersøgelser kun på p110α -interacting område af genet. De seneste data tyder på, at BH domæne mutante former af p85α kan ændre stabiliteten af ​​PTEN [20]. p85α binder til ikke-phosphoryleret PTEN inden det højmolekylære PTEN associeret kompleks (PAC) [22]. Denne interaktion involverer N-terminale region af p85 (SH3-BH) og har vist sig at have en positiv regulere lipid kinaseaktiviteten af ​​PTEN i en vækstfaktor-afhængig måde [23]. Angivelse af p85α med sletning af BH-domænet alene væsentligt reduceret interaktion med PTEN og sletning af begge domæner afskaffet den, hvilket fører til øget amplitude og varighed af AKT aktivering efter vækstfaktor stimulation [23]. Således PTEN: vises p85α interaktion til at potensere evnen hos PTEN at reducere PIP3 niveauer og afslutte signalering til AKT. Faktisk mutationen E160 * identificeret i endometrisk carcinom er blevet vist at destabilisere PTEN og resultere i øget AKT phosphorylering [20].

BH-regionen viser også sekvenshomologi til RhoGAP proteiner og har GAP aktivitet mod Rab5, Rab4, Cdc42 og Rac1 [21].