PLoS ONE: Mitose er en kilde til potentielle markører for Screening og overlevelse og terapeutiske mål i livmoderhalskræft

Abstrakte

Effekten af ​​forebyggende humant papillomvirus (HPV) vaccination på reduktion af livmoderhalskræft (CC) byrde vil ikke være kendt i 30 år. Derfor er det stadig nødvendigt at forbedre procedurerne for CC screening og behandling. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og karakterisere cellulære mål, der kunne betragtes potentielle markører for screening eller terapeutiske mål. En pyramideformet strategi blev anvendt. Oprindeligt udtryk for 8,638 gener blev sammenlignet mellem 43 HPV16-positive CCs og 12 raske cervikale epitheliums hjælp microarrays. I alt 997 gener var dereguleret, og 21 gener, der viste den største deregulering valideret ved anvendelse QRT-PCR. De 6 mest opreguleres gener (

CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1

,

CDKN3

) hører til mitose vej. De blev yderligere udforsket i 29 low-grade cervikal intraepithelial neoplasi (CIN1) og 21 high-grade CIN (CIN2 /3) at undersøge, om de kunne differentiere CC og CIN2 /3 (CIN2 +) fra CIN1 og kontroller.

CCNB2

,

PRC1

, og

SYCP2

meste forbundet med CC og

CDC20

,

NUSAP1

, og

CDKN3

blev også forbundet med CIN2 /3. Følsomheden og specificiteten af ​​

CDKN3

og

NUSAP1

at opdage CIN2 + var ca. 90%. Proteinerne kodet af alle 6-gener blev vist opreguleret i CC ved immunhistokemi. Foreningen af ​​disse markører med overlevelse blev undersøgt i 42 CC patienter fulgt i mindst 42 måneder. Kun

CDKN3

var forbundet med dårlig overlevelse og det var uafhængig af klinisk fase (HR = 5,9, 95% CI = 1,4-23,8, p = 0,01).

CDKN3

og

NUSAP1

kan være potentielle mål for udvikling af screeningsmetoder. Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser med større prøver at definere den optimale følsomhed og specificitet. Inhibering af mitose er en velkendt strategi til bekæmpelse cancere. Derfor

CDKN3

kan være ikke blot en screening og overlevelse markør, men en potentiel terapeutisk mål i CC. Men uanset om det er uundværlig for tumorvækst stadig påvises,

Henvisning:. Espinosa AM, Alfaro A, romersk-Basaure E, Guardado-Estrada M, Palma Í, Serralde C, et al. (2013) Mitose er en kilde til potentielle markører for Screening og overlevelse og terapeutiske mål i livmoderhalskræft. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10,1371 /journal.pone.0055975

Redaktør: Michael Scheurer, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: August 13, 2012; Accepteret: 4 Jan 2013; Publiceret: 6 Feb 2013

Copyright: © 2013 Espinosa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af det nationale Råd for Videnskab og Teknologi (CONACYT, www.conacyt.mx), giver numrene 8135 /A1, 24.341 (til JB) og 80680 (til SK), og National University of Mexico (www.unam.mx ) indrømme nummer SDI.PTID.05.2 (til JB). AME, AA og IMM var modtagere af et stipendium fra CONACYT. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det humane papillomavirus (HPV) er det vigtigste kausale faktor for udviklingen af ​​invasiv livmoderhalskræft (CC), og HPV findes i næsten 100% af disse tumorer [1], [2]. CC resultater fra progressionen af ​​preinvasive cervikal intraepitelialneoplasi (CIN), som er histologisk inddeles i mild (CIN 1), moderat (CIN 2) eller svær (CIN 3) dysplasi. CC sker hovedsageligt fra CIN3 og CIN2, men sjældent fra CIN1; de estimerede progression satserne for disse læsioner til CC er 12%, 5% og 1%, henholdsvis [3]. I øjeblikket er der vacciner på markedet, der forhindrer infektion med onkogene HPV-typer 16 og 18, som er forbundet med 65-70% af CCS verdensplan [4]. Disse vacciner har meget høj effektivitet til forebyggelse af infektion og udvikling af high-grade cervikal intraepithelial neoplasi (CIN2 /CIN3) [5], [6]. Dog skal vaccinerede kvinder stadig deltage programmer for tidlig påvisning af CC, eftersom disse vacciner kun beskytter mod visse virustyper, og det vides endnu ikke, hvor længe immun beskyttelse mod target virus forbliver [7], [8]. I mange lande forebyggende vacciner til HPV 16 og 18 er blevet indarbejdet i det nationale vaccinationsprogram, for piger fra 9 til 12 år [9], [10]. Men fordi peak incidens af CC opstår hos kvinder 45-50 år, effekten af ​​disse forebyggende vaccinationsprogrammer på at reducere forekomsten af ​​CC vil ikke være kendt i 30 år. Derfor er det nødvendigt at forbedre procedurerne for CC screening og behandling. Fordi hvert år 530 000 nye tilfælde af CC og 275 000 CC dødsfald er rapporteret på verdensplan, forekomsten til dødelighed forholdet er ca. 50% [11], [12].

For mange år, den Papanicolaou (PAP) test har været den vigtigste procedure screening for tidlig påvisning af CC, og dens massive anvendelse i de udviklede lande er faldet forekomsten af ​​CC med mere end 50% i de sidste 40 år [13]. Kvinder med unormale Paps omtales for colposcopy at bekræfte, kasseres, eller afklare diagnosen med en histopatologisk undersøgelse. Men den gennemsnitlige følsomhed cytologi til påvisning af CIN-læsioner er 50-60%; selv om specificitet er meget høj, ca. 90% [14]. Da HPV er uundværlig for udviklingen af ​​CC, flere procedurer til at påvise HPV genomet er blevet indarbejdet i CC screening. Sammenlignet med konventionel cytologi, HPV DNA-test har højere sensitivitet, men lavere specificitet for påvisning af CIN2 læsioner eller højere (CIN2 +). Den høje følsomhed og høj negativ prædiktiv værdi (NPV) af HPV DNA-tests til påvisning af CIN2 + læsioner tyder på, at det kunne bruges til at udvide screening intervaller. den lave specificitet af HPV DNA-tests, vil imidlertid øge antallet af opfølgende test og colposcopy henvisninger, hvilket ville øge omkostningerne ved screening [15]. Derfor behovet for at udvikle nye metoder til tidlig påvisning af CC med høj følsomhed og specificitet er klar. Flere tumormarkører forbundet med CIN2 + er blevet identificeret, især

CDKN2A

,

TOP2A

, og

MCM2

. Imidlertid har disse markører blevet foreslået ikke til screening, men til diagnose, prognose eller klinisk forvaltning [11], [16].

Invasiv livmoderhalskræft øjeblikket behandles med kirurgi, kemoterapi, strålebehandling eller en kombination af disse behandlinger, afhængig af den kliniske fase af sygdommen. Succesen med disse konventionelle terapier og patient overlevelse mindskes som sygdommen skrider frem til mere avancerede stadier [17]. Faktisk er andelen af ​​kvinder, der overlever 5 år falder fra 93% for fase IA til 15% for trin IVB (www.cancer.org). I modsætning til andre former for kræft, for hvilke der er udviklet flere specifikke molekylære lægemidler [18], er der ingen specifikke molekylære målrettede behandlinger for CC. De fleste lægemidler mod specifikke mål i kræft er rettet mod muterede proteiner, især proteinkinaser [19]; imidlertid nogle lægemidler målrette normale proteiner, som overeksprimeres, såsom HER2 /neu ved brystcancer [20], [21]. Det første skridt i at udvikle et særligt molekylær medicin er at identificere universelle molekylære mål, der er til stede hos patienter med CC og fraværende hos raske kvinder.

Formålet med denne undersøgelse var at identificere og karakterisere cellulære mål til stede i de fleste kandidatlande og fraværende fra normal cervikal væv, der adskiller nok mellem de 2 grupper, der skal overvejes, enten som potentielle markører for screening, med en følsomhed og specificitet tæt på 100%, eller som potentielle terapeutiske mål.

Metoder

Etik Statement

undersøgelsen protokol blev godkendt af de videnskabelige og etiske komitéer i Hospital General de Mexico (godkendelsesnummer DIC /03/311/04/051) og blev udført i overensstemmelse med de etiske principper, der er beskrevet i 1964 Helsinki-erklæringen. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere forud for deres optagelse i undersøgelsen.

Fag, prøver, og Experimental Design

De forsøgspersoner omfattede 69 patienter med invasiv livmoderhalskræft (CC) diagnosticeret i Department of Oncology, 29 patienter med lav-grade CIN (CIN1), 21 patienter med high-grade CIN (CIN2 og CIN3), og 25 kvinder med normal cervikal epitel evalueret på Institut for Obstetrik og Gynækologi på Hospital General de México i Mexico City. CC prøver var en delmængde valgt fra i alt 462 patienter med CC, som blev ansat i rækkefølge fra November 2003 til juli 2007 som udgjorde ca. 80% af patienterne nydiagnosticerede med CC i denne periode på grund af kriterierne af de restriktive inklusion (ingen tidligere behandling, hændelse tilfælde, som er født i Mexico med mexicanske aner til 2 generationer). Udvælgelseskriterierne for CC delmængde var baseret på tilgængeligheden af ​​en ny tumor biopsi til RNA ekstraktion med mere end 70% tumorceller i den morfologiske analyse (se nedenfor), for det meste FIGO iscenesætter I /II, og viral type. Denne undergruppe omfattede 47 prøver var positive for HPV 16 og 22 prøver positive for andre virustyper, herunder HPV18, 31, 33, 45, 51, 58 og 59. Blandt dem, 54 prøver var af skælcellecarcinomer, 14 prøver var af adenocarcinomer, og 1 prøve var af en adenosquamøst carcinom. Gennemsnitsalderen for patienter med kræft var 48 år (interval, 23-78 år; Tabel S1). Alle patienter fik fuldstændig kliniske evalueringer. De tumorer i CC patienter blev iscenesat ifølge den seneste internationale reviderede protokol for gynækologisk kræft [22]. En eller to biopsier, udført under kolposkopi undersøgelse, blev taget fra tumorer. En biopsi blev opdelt i 2 lige store dele, blev 1 del fikseret i pufret formol til morfologisk analyse og den anden side, sammen med den anden biopsi, var lynfrosset på tøris og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Alle CC patienter blev henvist til operation, strålebehandling, kemoterapi eller en kombination af disse behandlinger i henhold til retningslinjerne fra American Cancer Society (se nedenfor). Kontrol livmoderhalsprøver blev opnået fra patienter, der gennemgår hysterektomi på grund af myomatosis på Gynækologi Tjeneste Hospital General de Mexico. De blev tidligere diagnosticeret med en normal cervix ved cytologi og kolposkopi. Umiddelbart efter en livmoderhalsen fragment fra operationsstuen, blev exocervical og endocervikale epitheliums dissekeret under et stereoskopisk mikroskop for at undgå stromacellerne. Vævene blev derefter lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. For HPV påvisning og typebestemmelse, blev et skrab fra endocervix og ectocervix opsamlet med en cytobrush fra patienter og kontroller blev cellerne suspenderet i et hætteglas med ekstraktionsbuffer, og derefter opbevaret ved -20 ° C indtil analyse. Analyse af global genekspression (8,638 gener) blev udført i RNA’er ekstraheret fra 43 friske tumorbiopsier positive for HPV 16 og fra 12 prøver af normal cervikal epitel under anvendelse af HG-Focus microarray. Global genekspression blev valideret i 24 prøver, herunder 19 CCS og 5 livmoderhalskræft epitel kontrol, af en anden high throughput microarray (HG-ST1.0). De 23 gener, der viste den største deregulering blev valideret af real time PCR (QRT-PCR) i 44 HPV16-positive CC og 25 kontrolprøver. De 6 mest differentielt udtrykte gener (

CCNB2

,

CDC20

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

, og

CDKN3

) blev yderligere udforsket i 29 low-grade cervikal intraepithelial neoplasi (CIN1) og 21 high-grade CIN (CIN2 /3) at undersøge, om de kunne differentiere CC og CIN2 /3 (CIN2 +) fra CIN1 og kontroller. Immunhistokemi (IH) blev udført i 10 udvalgte proteiner i 26 CC prøver og 10 kontrolprøver. Foreningen af ​​9 markører med overlevelse blev undersøgt ved overlevelse analyse af 42 patienter med HPV16-positive CC, der blev fulgt op i mindst 42 måneder.

DNA og RNA Isolation

DNA blev oprenset fra cervikale skrammer og nogle biopsiprøver under anvendelse af PureLink Genomisk DNA Kit (Invitrogen, Grand Island NY) og holdt ved -20 ° C indtil analyse. Totalt RNA blev isoleret fra den ene halvdel af den opdelte biopsi under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kvaliteten af ​​RNA blev bekræftet ved agarosegelelektroforese, som demonstreret ved tilstedeværelsen af ​​intakt ribosomalt RNA, med 28S band to gange så intenst som den 18s band.

Detection og HPV Typing

HPV detektion blev udført ved PCR ved hjælp af universelle primere placeret i HPV

L1

gen

MY09

/

MY11

,

GP5

+ /

6 +

, og

L1C1

som tidligere beskrevet [23] – [25].

HBB

genet blev anvendt som en intern kontrol for at vurdere kvaliteten af ​​DNA. HPV-typerne blev identificeret ved sekventering af de amplificerede bånd i positive prøver under anvendelse af et fluorescerende cyklus-sekventering metode (BigDye Terminator Ready Reaction Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvensanalyse blev udført under anvendelse af en ABI PRISM 3130xl genetisk analysator (Applied Biosystems). Hver sekvens fra HPV-positive prøver blev analyseret med FASTA sekvenslighed værktøjet [26]. Den gennemsnitlige procentvise identitet af disse sekvenser til HPV-typer var 98,7% (interval, 91-100%).

Gene Expression Profilering og dataanalyse

genekspressionsprofilen af ​​43 CCs positive for HPV 16 og 12 raske kontrolpersoner cervikale epitheliums blev undersøgt ved hjælp af human Gene Focus (HG Focus) oligonukleotid Microarray (MA) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Denne matrix indeholder 8.794 probe sæt svarende til 8,638 karakteriseret menneskelige gener i Gene reference database. Total RNA fremstilling (10 ug), mærket cRNA syntese, hybridisering, scanning og billedanalyse blev udført ifølge fabrikantens protokoller (Affymetrix GeneChip Expression Assay manuel). At vurdere kvaliteten af ​​forsøgene blev de følgende parametre: forøget ekspression af exogene poly-A-kontroller (Lys Phe Thr Dap), tilstedeværelsen af ​​oligo B2 bruges til at lave grid alignments, baggrund med et acceptabelt område af 20 til 100, svarende støj på tværs af alle prøver, procentdel af foreliggende opkald større end 50%, en 3 ‘/5’ forholdet for et konstitutivt gen (GAPDH eller β-actin) på mindre end 3, og forøget ekspression af de hybridiseringsbetingelser kontroller (BioB BioC biod CRE). Kun de Marketingaftalerne med optimale kvalitetskontroller blev analyseret. Endvidere blev nogle prøver udført i dobbeltbestemmelse at vurdere reproducerbarheden af ​​forsøget, der var højere end 99%.

MA intensitetsværdier blev normaliseret ved anvendelse af Robust multichip Gennemsnit (RMA) algoritme, der anvender FlexArray software [27]. De normaliserede værdier intensitet blev omtalt som enheder af intensitet (UI). Gener udtrykt anderledes mellem tumorer og kontroller blev identificeret ved hjælp af algoritmen Betydning Analyse af microarrays (SAM version 3.0, https://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) ved hjælp af cut-off værdier af en fold ændring ( FC) af ≥1.5, en generel falsk opdagelse sats (FDR) på 1%, og en lokal FDR af 10% [28]. Unsupervised hierarkisk klyngedannelse og principal komponent analyse (PCA) blev udført ved dChip software (version 1.6, www.dCHIP.org) og R sprog i Java platform, hhv.

Validering af Global genekspression ved en anden High throughput microarray (HG-ST1.0)

genekspressionsprofilen af ​​24 prøver udforskes med HG-Focus microarray, herunder 19 CCS og 5 livmoderhalskræft epitel kontrol, blev også undersøgt ved hjælp af human Gene 1.0 ST oligonukleotid microarray ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Denne matrix indeholder 33,297 probe sæt, der svarer til ca. 20.741 gener i det menneskelige gen referencedatabase henhold til UCSC Genome Browser Assembly marts 2006 NCBI 36 /hg18, findes på https://genome.ucsc.edu/. Total RNA fremstilling (300 ng), mærket DNA-syntese, hybridisering, scanning og billedanalyse blev udført ifølge fabrikantens protokoller (Affymetrix GeneChip Expression Assay manuel). At vurdere kvaliteten af ​​forsøgene blev de følgende parametre: ekspression af de exogene poly-A-kontroller, tilstedeværelsen af ​​oligo B2 bruges til at lave grid alignments, og arealet under kurven (AUC) værdier over 0,8. Kun de microarrays med optimale kvalitetskontroller blev analyseret. Mikroarrays blev normaliseret under anvendelse af RMA algoritme i Affymetrix ekspression konsollen. De normaliserede værdier intensitet blev omtalt som enheder af intensitet (UI). De normaliserede intensiteter (log

2 værdier) af de 8,370 gener, der blev undersøgt på begge microarrays (HG ST1 og HG Focus) blev sammenlignet, og niveauet af korrelationen blev vurderet med Pearsons korrelationskoefficient.

Validering Global Gene Expression af Real-time kvantitativ retrotransskription PCR (QRT-PCR)

Omvendt transskription af totalt RNA blev udført ved hjælp af High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystems) i et samlet volumen på 20 uL. Blandingen omfattede 2 ug RNA, 2 pi 10 x RT-puffer, 0,8 pi 100 mM dNTP’er, 2 pi 10 x RT vilkårlige primere, 1 pi MultiScribe ™ omvendt transkriptase (5 U /pl), og 1 pi RNase inhibitor (2 U /pi). Reaktioner blev inkuberet ved 37 ° C i 120 min, og derefter opbevaret ved -20 ° C. Et sæt af 23 gener blev anvendt til at validere genekspression i 44 HPV16-positive CC og 25 raske cervikale prøver epitel kontrol med QRT-PCR’er under anvendelse TaqMan prober. Generne inkluderet er

CCNB2 cdc2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, RFC4, RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, Tyms, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2

og

WISP2

.

GAPDH

blev anvendt som intern kontrol. TaqMan genekspression assays blev anvendt (tabel S2, Applied Biosystems). Syv gener blev også undersøgt i 22 CC positiv for andre HPV’er (

CCNB2

,

CDC20

,

CDKN3

,

PRC1

,

SYCP2

,

NUSAP1

,

Tyms

), og den første 6 af dem, sammen med

CDKN2A

,

PCNA

,

MKI67

gener, blev yderligere undersøgt i 29 lav kvalitet CIN’er og 21 high-grade CIN’er. Forsøgene blev kørt in duplo i et endeligt volumen på 20 pi, hvoraf 200 ng cDNA skabelon, 10 pi 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 1 pi 20 × TaqMan Gene Expression Assay, og 7 pi RNase-frit vand. Cyklusprogrammet blev kørt i en Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australien), der blev fastsat som følger: en indledende PCR aktiveringstrin ved 50 ° C i 2 minutter efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter, derefter 40 cykler der smeltede ved 95 ° C i 15 s og annealing /forlængelse ved 60 ° C i 1 min. Medianen af ​​Ct standardafvigelser i dubletter varierede fra 0,09 til 0,24 (middelværdi = 0,16) blandt de 23 gener, hvilket tyder på, at forskellene mellem de dubletter var meget lille [29]. Måling af genekspression var baseret på relative standardkurver konstrueret ud fra et 10-fold seriefortyndet pulje af CC eller normale cervikale epitelium cDNA’er fra 500 til 0,05 ng. Den første kurve blev anvendt til at beregne værdierne af opreguleres gener og den anden kurve værdierne af nedreguleret gener. Kurver for hvert gen blev testet i tre forskellige eksperimenter løb i to eksemplarer og gennemsnittene af korrelationsfaktorerne coeficients (r) var højere end 0,98. Ekspressionen af ​​målgener blev normaliseret i hver tumor og kontrolprøve til intensiteten af ​​den interne reference (

GADPH

) under anvendelse af en tidligere beskrevet metode [30]. De normaliserede værdier intensitet blev målt i ng /pl. En normalitet test (Shapiro-Wilk) blev udført for at prøve for en normal fordeling af genekspression data. Fold-change-ekspression blev beregnet ved at dividere den gennemsnitlige normaliserede intensitet tumorprøver ved medianen normaliserede intensitet af kontrolprøverne. Den statistiske signifikans mellem medianerne i tumorer og kontroller blev beregnet med Mann-Whitney (MW) ikke-parametrisk test. De sammenhænge mellem MA resultater og de QRT-PCR-data blev udført ved hjælp af log

2 værdier og målt med Pearsons korrelationskoefficient.

Immunhistokemi

Protein udtryk for 10 gener blev bestemt i 26 CC og 10 kontrolprøver med IH. To hjemmelavede væv microarrays (TMA) blev bygget, en indeholdende 14 HPV16-positive CCs og 5 kontroller og de andre 12 CC positiv for andre HPV’er og 5 kontroller. NUSAP1 blev udforsket kun i prøver fra første TMA. Cylindriske prøver fra repræsentative regioner af paraffinindlejrede vævsblokke, tidligere er valgt af H p16 for CDKN2A (sc-71.804); SCP-2 for SYCP2 (sc-20048), PRC1 (sc-56345); cyclin B2 for CCNB2 (sc-81241); CDKN3 (sc-475); og CDC2 for p34 (sc-70.822), blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistofferne mod CDC20 (kat. 34-1900), blev Ki-67 for MKI67 (kat. M7187) og NUSAP1 (kat. H00051203-B01) opnået fra Invitrogen, Dako (Glostrup, Danmark), og Nova Biological (Littleton, CO ), henholdsvis. Fortyndingen anvendes til alle antistoffer var 1:100, bortset CDC2, (1:50) og NUSAP1 (1:250), og antistoffet anvendte fortyndingsmiddel var fra Dako. Et samlet volumen på 300 pi sattes til hver sektion, og objektglassene blev inkuberet natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Antigen-antistof-komplekser blev detekteret ved avidin-biotin peroxidase metode med 3,3′-diaminobenzidin-tetrahydrocloride som et kromogent substrat (Cat KO679 LSAB + Sys /HRP;. Dako-Cytomation Carpinteria, CA), og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Analyser blev udført tre gange. Antistofferne for SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3 cdc2, og CDC20 blev testet i væv kendt for at udtrykke disse antigener. SYCP2 blev testet i nyfødte testis; PRC1 cdc2, og CCNB2 blev testet i tyktarmskræft; og CDKN3 blev testet i lungekræft biopsier. Alle væv blev opnået fra arkiverne i Patologisk afdeling. Procentdelen af ​​farvede celler blev beregnet ud fra en analyse af 10 på hinanden high-power felter af neoplastiske celler. Den cellulære lokalisering af immunreaktionen blev identificeret, og intensiteten af ​​immunreaktionen blev scoret fra 0 til 4, hvor 0 er angivet nogen farvning. Immunreaktion signaler blev fundet sjældent i stroma med alle antistoffer og blev ikke bedømt for analysen. Immunofarvede slides blev analyseret og scoret af 2 patologer, som var blindet af resultaterne. Sjældne tilfælde med disharmoniske scoringer blev revurderet og scoret baseret på konsensus.

Survival Analyse af Kræftpatienter

Ifølge Figo mellemstationer patienter med livmoderhalskræft modtog individualiseret behandling baseret på retningslinjerne for livmoderhalskræft behandling af American Cancer Society (se tabel 1). Efter behandlingen var afsluttet, blev hver patient klinisk vurderet hver 3 eller 6 måneder af en erfaren onkolog. Kliniske data for opfølgende undersøgelse blev opnået fra patienterne medicinsk rekord. Også en socialrådgiver udførte telefonopkald og hjemmebesøg til patienterne hver 6. måned i løbet af undersøgelsen. Patienter registreret som live i studiet lykkedes fulgt op i mindst 42 måneder efter behandlingen. Censureret og afdøde patienter blev fulgt i det antal måneder, der er angivet i tabel 1. De udpegede som censureret henvist til de patienter, der blev tabt til undersøgelse i opfølgningsperioden eller afdøde fra andre end livmoderhalskræft årsager sager. Patienterne blev anset tabt, når deltog ikke til medicinske aftaler for sygdomsbekæmpelse, ikke blev fundet ved hjemmebesøg eller svarede ikke telefonopkald. I denne kohorte, indspillet patienter som afdøde var kun de kvinder, der døde af livmoderhalskræft primær tumor som en hovedårsag. Dødsårsagen af ​​alle, men en patient, der døde under opfølgning blev bekræftet af journal og dødsattest. Kun 42 af 44 patienter med HPV16-positive CC udforsket med QRT-PCR blev inkluderet i fulgt op undersøgelsen. Fire tilfælde blev anset højre censureret og otte dødsfald blev registreret. Den gennemsnitlige følgende tid af de 42 patienter var 50,5 måneder. Foreningen af ​​FIGO og genekspression (

PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67

) med overlevelse blev undersøgt ved overlevelse analyse. Med hele prøvesæt blev 500 uddannelse sæt 21 prøver tilfældigt oprettet for hvert gen udforsket. At kategorisere genekspression data kvantificeret ved QRT-PCR, blev ROC analyse udført i hvert træningssæt. Denne analyse blev udført for at fastsætte en afskæringsværdi til genekspression, der repræsenterede disse værdier med den højeste sensitivitet og specificitet at skelne mellem døde og overlevende patienter. Hele prøvesæt blev derefter analyseret med den gennemsnitlige afskæringsværdi, beregnet ud fra værdierne af de 500 træningssæt. Prøver med genekspression værdier over afskæringen blev sat til 1 og dem med værdier under cut-off blev sat til 0. Den kumulative samlede overlevelsestid blev beregnet ved Kaplan-Meier-metoden og analyseret ved log-rank test. FIGO iscenesættelse og genekspression blev inkluderet som kovariater i en Cox proportional hazard model.

Gene ontologi Classification Analysis

Database til anmærkning, Visualisering, og integreret Discovery (DAVID) funktionelle annotation værktøj (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] og opfindsomhed Pathway Analysis (IPA, Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) blev anvendt til at klassificere de deregulerede gener. Gener blev klassificeret ved hjælp af funktionel annotation clustering overvejer gen ontologi biologiske processer. Klassifikation stringens blev fastsat til medium og maksimale niveau.

Gene Annotation og dataanalyse

Den fysiske placering af gener blev kortlagt i henhold til UCSC Genome Browser Assembly marts 2006 NCBI 36 /hg18, tilgængelig på https://genome.ucsc.edu/. Dataanalyse blev udført ved hjælp af Access 2010 (Microsoft Inc.). Den rå MA data MIAME kompatibel og er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (GEO, https://www.ncbi.nih.gov/geo/) under accessionsnummer GSE39001. Modtager operatør karakteristik (ROC) kurve analyse blev udført og Youden indeks blev anvendt [33] for at vælge den bedste cut-off point for at skelne tumorer fra kontrol og CIN2 + fra CIN1- hjælp udtrykket værdier af udvalgte gener opnået ved QRT-PCR. For hver markør, følsomhed, specificitet, positiv prædiktiv værdi (PPV), og negativ prædiktiv værdi (NPV) blev beregnet efter tidligere beskrevne formler [34]. Alle tests var to-sidet, og p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataanalyse blev udført under anvendelse Sigma Stat og SPSS ver. 17 software.

Resultater

Expression Analyse af 8,638 Gener i livmoderhalskræft

Den mængde mRNA transskriberet fra 8,638 gener blev sammenlignet mellem 43 CC prøver positive for HPV 16 og 12 normal cervikale epitel prøver under anvendelse af HG-Focus microarray. I alt 997 gener blev differentielt udtrykt mellem cancer og kontrolgrupperne; 600 blev opreguleret og 397 blev nedreguleret (tabel S3). Næsten halvdelen af ​​de opregulerede og nedreguleret gener havde FC’er i intervallet 1,5-2,0, og antallet af gener i begge grupper faldt lineært (R = -0.8, p = 0,002) som FC værdien steget (figur 1). Den principalkomponentanalyse (PCA; data ikke vist) og det ikke-overvåget hierarkisk klyngedannelse (panel A i figur 2) udføres med alle 997 genekspression værdier klart adskilt kræft prøver fra kontrolgruppen. Imidlertid er ekspressionen af ​​mange gener var ikke helt ensartet blandt cancer prøver, især i gruppen af ​​opregulerede gener (signaler vist med rødt i figur 2A). Mange af disse gener blev opreguleret i nogle tumorer og nedreguleret i andre tumorer. Dette var i modsætning til ensartetheden af ​​de ekspressionssignaler i kontrolgruppen prøver. Gener, der skal testes som markører for screening eller som potentielle terapeutiske mål blev udvalgt efter Δ-score rang (en modificeret t-test, der anvendes i SAM), FC eller om de tidligere blev anvendt som markører for livmoderhalskræft. Fra de 997 gener, der er forbundet med kræft prøver, har 163 tidligere blevet rapporteret som markører for forskellige former for kræft (IPA, Ingenuity Systems), herunder

MCM2

,

TOP2A

, og

CDKN2A

, som er blevet anvendt som markører til diagnose af livmoderhalskræft [35]. De 997 gener blev opført i faldende bestilt af Δ-score (tabel S3). I alt 23 gener (18 opreguleres og fem nedreguleret) blev udvalgt til validering af QRT-PCR (markeret med fed i tabel S3 og tabel 2 kredse farvet i blå og orange i figur 1). Alle nedreguleret gener (

CFD

,

NDN

,

WISP2

,

end3

, og

SLC18A2

) og 10 af de 18 opreguleres gener (

PRC1

,

CKS2

,

Tyms

,

RFC4

,

RRM2

,

NUSAP1

,

MCM2

,

CCNB2

,

SMC4

, og

CDC2

) blev udvalgt efter Δ-score rang. Syv af de resterende opregulerede gener er på listen over de 50 bedste klassificeret gener, 2 af dem er gener, der tidligere er blevet foreslået som markører i CC (

CDKN2A

TOP2A

), 4 (

CDC20

,

CDKN3

,

ZWINT

, og

SYCP2

) blev udvalgt på grundlag af FC værdi, og

PCNA

(tabel S3), sammen med

MKI67

, der rangeret i 139. plads, blev medtaget, fordi disse markører er almindeligt anvendt til at måle celleproliferation. en. en. b. c. b.