PLoS ONE: Microenvironmental Modulation af decorin og Lumican i Temozolomid-Resistant glioblastom og neuroblastom Cancer Stem-lignende celler

Abstrakt

Tilstedeværelsen af ​​cancer stamceller (CSCS) eller tumor-initierende celler kan føre til kræft tilbagefald i en eftergivende celle-mikromiljø samspil, fremme invasion i glioblastom (GBM) og neuroblastom (NB). Ekstracellulære matrix (ECM) små leucin-rige proteoglycaner (SLRP) spille flere roller i vævshomeostase ved remodeling den ekstracellulære matrix (ECM) komponenter og modulerende intracellulære signalveje. På grund af deres pan-hæmmende egenskaber mod receptor (RTK’er), er SLRP rapporteret at udøve anticancer effekter

in vitro

in vivo

. Men deres roller synes at være vævsspecifik, og de er også involveret i kræftcellen migration og resistens, hvilket banede vejen til komplekse forskellige scenarier. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om SLRP decorin (DCN) og lumican (LUM) rekrutteres i celle plasticitet og microenvironmental tilpasning af differentierede cancerceller induceret dybt stamme-lignende fænotype. Flydende neurosfærer blev genereret ved tilførsel af CSC berigelse medium (neural stamcelle serum-frit medium, NSC SFM) til den etablerede SF-268 og SK-N-SH-cancercellelinier, cellulære modeller af GBM og NB hhv. I begge modeller, blev observeret tidsafhængig synergistisk aktivering af DCN og LUM. Den højeste DCN og LUM mRNA /protein-ekspression blev påvist efter celle udsættelse for NSC SFM for 8/12 dage, overvejer disse celler som SLRP-udtrykkende (SLRP

+) CSC-lignende. Ultrastrukturel imaging viste den cellulære heterogenitet af både GBM og NB neurosfærer og identificeret de indre levende celler. Forældrekontrol cellelinier af både GBM og NB voksede kun i blød agar + NSC SFM, mens de sekundære neurosfærer (stammer fra SLRP

+ t

8 CSC-lignende) viste lavere spredning satser end primære neurosfærer. Interessant, SLRP

+ CSC-lignende fra GBM og NB neurosfærer var resistente over for temozolomid (TMZ) ved koncentrationer 750 uM. Vores resultater antyder, at GBM og NB CSC-lignende fremme aktiveringen af ​​enorme mængder af SLRP som reaktion på CSC berigelse, samtidig erhverve TMZ modstand, cellulær heterogenitet, og en hvilende fænotype, hvilket tyder på en hidtil ukendt central rolle for SLRP i lægemiddelresistens og celle plasticitet CSC-lignende, så celle overlevelse og ECM /niche graduering potentiale

Henvisning:. Farace C, Oliver JA, Melguizo C, Alvarez P, Bandiera P, Rama AR, et al. (2015) Microenvironmental Modulation af decorin og Lumican i Temozolomid-Resistant glioblastoma og neuroblastom Cancer Stem-lignende celler. PLoS ONE 10 (7): e0134111. doi: 10,1371 /journal.pone.0134111

Redaktør: Dragana Nikitovic-Tzanakaki, Kretas universitet, GRÆKENLAND

Modtaget: April 28, 2015; Accepteret: 6 jul 2015; Udgivet: 31 Juli 2015

Copyright: © 2015 Farace et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Fundació la Marato TV3, Projekt nr 111431.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

glioblastoma (GBM) og neuroblastom (NB) er de mest almindelige og dødelige nervesystem maligne kræftformer hos voksne og pædiatriske patienter. WHO anser GBM den mest aggressive astrocytoma, og det kan udvikle sig til sekundære GBM fra lav kvalitet gliomer, eller

de novo

med hurtig progression til døden [1]. I modsætning hertil NB skyldes hovedsagelig crista neuralis-celler som en neuroendokrin cancer i det sympatiske nervesystem, og 60% af pædiatriske patienter viser metastatisk sygdom på diagnosetidspunktet [2]. Selvom temozolomid (TMZ) -en alkylerende middel, der inducerer celledød ved hele DNA alkylering /methylering i guaninrester-i kombination med andre lægemidler eller strålebehandling repræsenterer en første-linie behandling øge den samlede overlevelse (OS) af patienter med GBM eller NB [ ,,,0],3, 4], lægemiddelresistens og kræft progression er almindelige. Fordi GBM er yderst invasive i hjernen og NB tendens til at invadere andre organer, forbliver patient OS dårlig ( 1,5 år i GBM patienter og 4 år i NB patienter). [5, 6]

Behandlingssvigt i kræftpatienter har tidligere været forbundet med kræft stamceller (CSC) subpopulationer, der sikrer opretholdelse af kræft heterogenitet, og disse CSC delpopulationer er mere modstandsdygtige over for selektive stoffer gennem flere samordnede trin for selv-fornyelse og differentiering [7-9]. Metastase og kræft tilbagefald er også knyttet til adfærd CSCS, herunder deres fredfyldte fænotype, vandrende evne, og unddragelse af immunsystemet [10]. Rigelige forskning tyder på, at cellerne stamceller-lignende celler er udstyret med medfødte maskiner, der beskytter dem mod radio /kemoterapi [11, 12]. Dette omfatter stamceller-relaterede mekanismer, såsom beskyttende celle nicher og ændringer i ekspressionen af ​​gener involveret i reguleringen af ​​cellecyklus, DNA-reparation, lægemiddelmetabolisme og narkotika efflux [13]. Det stof modstand og cellulære invasion potentiale CSCS også stige på den reversible epitel-til-mesenkymale fænotypisk overgang (EMT) [14, 15], der rekapitulerer EMT i normal organogenese og udvikling [16, 17].

Flere microenvironmental signaler, herunder reorganisering af den ekstracellulære matrix (ECM), hypoxi, og autocrine /parakrine faktorer kan afgøre stamceller og kræft celle skæbner [18-25], og trigger eller hæmmer EMT processer [26, 27]. Derfor ECM glycoproteiner og proteoglycaner, der er i stand til at modificere både ECM miljø og intracellulære signalveje er af allerstørste betydning i kræft mikromiljø [28-30]. De små leucin-rige proteoglycaner (SLRP), deling strategisk konserverede domæner, udgør et klart eksempel på ovennævnte koncept. Leucin-rige protein kerne (40-50 kDa) binder til en række vækstfaktorer (GF) og membranreceptorer, hvorimod forgrening af glycosaminoglycanic sidekæder er involveret i ECM-collagen montering og også i membranen receptorbinding. Interessant nok til trods for deres pan-inhiberende egenskaber mod receptor (RTK’er) og cancervækst veje, den “vogter fra matricen” decorin (DCN) og lumican (LUM) SLRP kunne udøve anticancer effekter

in vivo

og

in vitro

[31-33]. Men de seneste undersøgelser kaste lys over nyligt identificerede vævsspecifikke egenskaber både DCN og LUM i normale væv og i ondartet kræft mikromiljø. Som rapporteret af andre forfattere, den delvise gliom hæmning af DCN i genterapi eksperimenter i rotter medfører en markant reduktion af mikrogliaceller infiltration [34], som kunne påvirker kræft hæmning

in vivo

. DCN øger også unddragelse af immunsystemet og muskel invasion i prostatakræft

in vivo

[35], og udøver uventede beskyttende og antiapoptotiske effekter i gliomcellelinier under hypoxiske betingelser [36]. I orale maligne pladecellekarcinom celler, den nukleare lokalisering af DCN synes at fremme cellulær invasion

via

den nukleare epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) pathway [37, 38], mens det i osteosarcomceller, DCN-medieret vækst anholdelse undgås

via

den langvarige aktivering af membran EGFR [39]. Klinisk har DCN blevet foreslået som regulator af kemoterapi mekanisme i oral cancer [40], og i relation til resistens over for lægemidler og nedsat overlevelse i GBM patienter [41]. I lighed med DCN, er LUM rapporteret at mediere tumor suppression. Imidlertid er LUM udtrykt i high-grade pancreascancer med en lav grad af differentiering [42] og i GBM patienter, samt. LUM hæmmer også celleadhæsion og fremmer migrationen af ​​osteosarcomceller ved at regulere den transformerende vækstfaktor β2 (TGF-β2) /SMAD2 pathway [43], og en 70-kDa LUM proteoglycan synes at forbedre cancercelleproliferation og inhiberer migreringen af ​​pancreas cancerceller. Desuden sammen til DCN blev LUM opreguleret i cisplatin-resistente hoved og hals kræft celler [44].

Det er bemærkelsesværdigt, at SLRP udtrykkes i stamceller nicher i chick embryo [45], i cerebral endotel celler [46], i progenitorer af forskellige celletyper [47], og i en NB cellesubpopulation reagerer på nerve-vækst-faktor-medierede neurit vækst [48]. DCN afledt fra astrocytter hæmmer også neural stamcelle /progenitorcelle differentiering mod en neuron-lignende cellestruktur [49]. Ændring af de mekaniske egenskaber ved tre-dimensionelle (3D) kollagen matricer, er SLRP rekrutteret under ontogenic (udviklingsmæssige) EMT [50], celle forløber migration og differentiering [51], og sårheling /væv reparation som reaktion på centralnervesystemet skade og inflammation [52]. I den forbindelse er det tænkeligt, at de små DCN og LUM proteoglycaner spille en rolle i biologi CSCS i nervesystemet oprindelse. Til dette formål har vi undersøgt inddragelse af DCN og LUM i GBM og NB CSC-lignende modeller, der simulerer fænomenerne forankring tab og udstationering af differentierede tumorceller, der ligger til grund for EMT-processen, og deres forhold til CSC-lignende adfærd og celle respons på TMZ. I denne undersøgelse, vi rapporterer for første gang den massive synergistiske udtryk for DCN og LUM SLRP i GBM og NB cellelinjer udsat for flydende 3D neurosfære-baserede CSC-lignende berigelse. Neurosfære mikrografer fremhæve stænglen-lignende heterogenitet og celle polarisering af 3D NB og GBM-modeller. Desuden SLRP

+ NB og GBM CSC-lignende isoleret fra neurosfærer viste lavere spredning priser, mindre apoptose, og større modstand stof end forældrenes cellelinjer, hvilket tyder på afgørende og synergistiske roller til DCN og LUM i TMZ modstand, overlevelse og vedligeholdelse af hvilende, langsom-cykling, CSC-lignende subpopulationer.

Metoder

cellelinjer og CSC berigelse

i denne undersøgelse to etablerede GBM og NB-cellelinjer blev indskrevet. SK-N-SH-cellelinien er en kommerciel epitelcellelinie oprindeligt stammer fra knoglemarv metastase af en 4-år gammel hvid kvinde, der lider med NB, og det er tidligere blevet beriget i CSC-lignende. I modsætning hertil SF-268 er en nonepithelial cellelinie afledt af en høj kvalitet anaplastisk astrocytoma, som aldrig er blevet anvendt til CSC-lignende berigelse. Den etablerede SK-N-SH (fra American Type Culture Collection) og SF-268 cancercellelinier (venligt tilvejebragt af Instrumentation Scientific Center, Granada University) blev rutinemæssigt opretholdt som adhærente kulturer (monolag) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM ) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, i en fugtig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO

2. Sammenflydende celler blev frigjort i 5 ml phosphatpufret saltvand (PBS) -ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ved 37 ° C i 10 minutter, vasket to gange i PBS, og subkultiveret som monolag. CSC berigelse af cancercellelinier blev udført ved at generere neurosfærer i neural stamcelle serum-frit medium (NSC SFM) [53, 54], indeholdende KnockOut DMEM /F12 plus 20 ug /ml basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), 20 ug /ml epidermal vækstfaktor, 1 × StemPro Neural Supplement (Invitrogen, Paisley, UK), 1% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin. NSC SFM blev erstattet hver 2 dage efter mild centrifugering af neurosfærer.

RNA ekstraktion og kvantitativ revers transkription (QRT) -PCR

udtryk for DCN og LUM mRNA blev vurderet i t

0 celler og neurosfærer efter 4 (t

4), 8 (t

8), og 12 dage (t

12) af CSC berigelse. De parentale cellelinier i DMEM blev anvendt som kontrol (t

0). RNA blev ekstraheret med RNeasy Mini Kit (Qiagen, MD, USA) og kvantificeres med en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, DE, USA). RNA (1 ug) fra hver prøve blev revers transkriberet med M-MLV revers transkriptase (Sigma, Italien) ifølge producentens instruktioner, og SYBR Green-baseret amplifikation (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev udført med CFX96 Fast -Time PCR Detection System (Bio-Rad, Italien), som tidligere rapporteret [55]. PCR cycling program var: 50 ° C (2 min), 95 ° C (2 min), 42 cykler af: denaturering ved 95 ° C (30 s), annealing ved 56 ° C (30 s) og forlængelse ved 72 ° C (40 s), efterfulgt af en smeltekurveanalyse (interval 56-95 ° C) med intervaller på 0,5 ° C /5 s at vurdere primerspecificitet. Primersekvenserne var: forward 5′-GGA CCG TTT CAA CAG AGA GG-3 ‘, revers 5′-GAC CAC TCG AAG ATG GCA TT-3′ (DCN); fremadrettet 5’-TGG AGG TCA ATC AAC TTG AGA A-3 ‘, revers 5′-CAA ACG CAA ATG CTT GAT CTT-3′ (LUM); fremadrettet 5’-CAA GGA GTA AGA CCC CTG GAC-3 ‘, revers 5′-TCT ACA TGG CAA CTG TGA GGA G-3′ (glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase, GAPDH); fremadrettet 5’-GGC ATC CTC ACC CTG AAT GA-3 ‘, revers 5′-AGG TGT GGT GCC AGA TTT TC-3’ (β-actin, ACTB). De tilsigtede transkripter var uafhængigt normaliseret til GAPDH og ACTB (housekeeping-gener), og RNA’et af t

0-celler blev anvendt som afprøvningssystemet. Resultaterne blev udtrykt på en logaritmisk skala som fold ændringer (FCS), med 2

-ΔΔCt metode.

Western blotting

Hele proteinekstrakter blev opnået med den pulserede lydbehandling af cellulær pellets i 200 pi ekstraktionsbuffer indeholdende 50 mM Trizma-base, 0,25 mM saccharose, 5 mM EDTA (pH 7,4), 0,5% Triton-X 100 og 1% protease inhibitor cocktail. Protein- koncentrationer blev bestemt med Bradford-metoden. Proteinerne (50 ug) blev blandet 1: 1 med 2 x Laemmli-puffer, opvarmet til 95 ° C i 5 min, og sat på en 12% denaturerende SDS-PAGE-gel med Kalejdoskop prestained standarder. Proteinerne blev separeret elektroforetisk på en konstant spænding (90 V) i 90 minutter og blottet på en 0,45 um nitrocellulosemembran under halvtørre betingelser med Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, Spanien) i 25 min ved 200 mA. Membranerne blev blokeret med 5% skummetmælk i PBS, inkuberet ved 4 ° C natten over med kanin polyklonalt anti-LUM antistof (fortyndet 1: 100; sc-33785, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller muse-monoklonalt anti-DCN antistof (1:50; sc-73.896, Santa Cruz Biotechnology) i blokerende buffer, vasket 4 gange i vaskeopløsning (0,1% Tween i PBS), inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med det passende monoklonale peberrod-peroxidase-konjugeret sekundært antistof (1: 5000; Sigma-Aldrich), og vasket igen i vaskeopløsningen. Blottene blev detekteret med ECL Western blotting-påvisningsreagenser (Amersham; UK). The Molecular Imager VersaDoc MP 4000 systemet (Bio-Rad, Hercules, CA) blev anvendt til kemiluminescens visualisering. Blottene blev strippet og inkuberet med monoklonalt muse-anti-β-actin-antistof. (1: 30000; Sigma-Aldrich) som ladningskontrol

blød agar cultures Salg

cellelinier blev dyrket i blød agar for at vurdere deres koloni eller neurosfære formation under forankringsuafhængige betingelser i DMEM eller NSC SFM. At udforske udbredelsen af ​​SLRP

+ CSC-lignende efter CSC berigelse i 8 dage (t CSC-lignende

8), sekundære neurosfærer blev genereret fra t

8 CSC-lignende. Kort fortalt blev StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent (Invitrogen), der anvendes til at dissociere de t

8 neurosfærer. En Trypan blå eksklusion test blev udført, og 5 × 10

3 /ml celler blev opsamlet i 2 × DMEM eller NSC SFM. Cellerne blev blandet 1: 1 med en forvarmet opløsning indeholdende 0,6% ultrarent agarose i PBS (0,3% endelig agar koncentration), podet i tre eksemplarer i seks-brønds plader på 2 ml størknet 0,6% bund agar og inkuberet i en fugtig atmosfære ved 37 ° C med 5% CO

2. De bløde agar kulturer blev fotograferet dagligt under et omvendt fase-kontrast mikroskop (Nikon Eclipse TE 2000-S).

Transmission og scanning elektron mikroskopisk billeddannelse

Otte-dag (t

8 ) neurosfærer blev opsamlet, vasket i PBS og fikseret i 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M PBS (pH 7,4) i 2 timer ved 4 ° C. De faste neurosfærer blev omhyggeligt vasket fire gange i PBS, efterfikseret i 1% osmiumtetroxid (OSO

4) i 0,1 M PBS i 1 time ved 4 ° C, og opbevares i PBS ved 4 ° C indtil indstøbning. Prøverne, der anvendes til transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev dehydreret i serie af stigende acetone koncentrationer og indlejret i epoxyharpiks til ultratynde sektionering ved 60 ° C natten over. De ultratynde skiver skåret med en 8800 Ultratome (LKB, Bromma, Sverige) blev farvet med 4% uranylacetat og blycitrat og ses på et Zeiss EM 109-902 transmission elektron mikroskop (Zeiss, Oberchochen Tyskland). Til scanning elektronmikroskopi (SEM), blev postfikseret neurosfærer inkuberes i ren hexamethyldisilazan i 1 time ved 4 ° C, tørres i et kritisk punkt tørretumbler (polaron, Watford, UK), og metalliseret i en S150A Sputter Coater (Edwards, Crawley, UK) til scanning i Quanta 200 (FEI, Eindhoven, Holland) eller DSM 962 SEM instrumenter (Zeiss, Oberchochen, Tyskland).

TMZ behandling og MTT assay

Enkelte celler fra monolag og t

8 neurosfærer af begge cellelinier blev opsamlet som beskrevet ovenfor. Cellelevedygtighed blev testet med trypanblå eksklusion og 5 × 10

3 celler /brønd blev podet i 96-brønds mikrotiterplader, i DMEM eller NSC SFM. Den næste dag blev mediet erstattet med frisk medium uden eller med forskellige koncentrationer af TMZ (25-1500 pg /ml; Sigma, Madrid, Spanien). DMSO blev inkluderet som kontrol køretøjet. Hver tilstand blev testet i seks brønde. Tre dage senere blev mediet erstattet med frisk medium for at bevare TMZ aktivitet. Endepunktet af TMZ behandling blev fastsat på dag 6. Endelig en 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) kolorimetrisk assay blev udført (Sigma). Kort beskrevet blev 20 pi MTT /brønd tilsat, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C. Efter 4 timer blev mediet forsigtigt fjernet og DMSO blev tilsat for at opløse formazan salte. Reaktionerne blev målt med en Multiskan EX mikroplade fotometer (Thermo Scientific, Madrid, Spanien) ved 570 nm. TMZ dosis-respons blev udtrykt som procent (%) inhibering af cellen metabolisk aktivitet i forhold til den for ubehandlede celler og indstilles til vehikelkontrollen. Inhiberingen af ​​cellevækst med TMZ blev evalueret i firdobbelte forsøg.

Statistisk analyse

Students tohalet

t

test blev anvendt til bestemmelse af den statistiske signifikans af forskellene i TMZ behandlingsresultater for SLRP

+ CSC-lignende og forældrenes cellelinjer. Forskellene i qPCR genekspression blev evalueret med envejs variansanalyse (ANOVA). Statistisk signifikans blev sat til p. 0,05

Resultater

DCN og LUM udtryk under neurosfære-baserede CSC berigelse

Neurosfærer af både SF-268 og SK-N-SH cellelinjer erhvervet regelmæssige 3D konformationer som følge af vedvarende radiale spredning af de fleste celler, nåede 50 um efter 4 dage (fig 1A). En QRT-PCR-analyse viste, at DCN og LUM mRNA-ekspression, med undtagelse af LUM i SF-268 t

12, steg under CSC berigelse forhold i begge cellelinier, der viser de højeste DCN og LUM mRNA-ekspression værdier efter 8 dage (t

8). Sammenlignet med forældrenes cellelinier (t

0), og i betragtning af ACTB som husholdning gen, GBM CSC-lignende var mere beriget i LUM mRNA (FC

Lum

= t

0: 1; t

4: 11,00; t

8: 21,70; t

12: 9.51) end i DCN mRNA (FC

DCN

= t

0: 1 ; t

4: 6,32; t

8: 17,87; t

12: 11.08) (p 0,01). Tilsvarende NB CSC-lignende viste højere LUM mRNA-niveauer (FC

Lum

= t

0: 1; t

4: 29.04; t

8: 105,78; t

12: 60,12) end DCN mRNA-niveauer (FC

DCN

= t

0: 1; t

4: 23.02; t

8: 80,44; t

12: 40,22) (p 0,01, fig 1B)

(A) neurosphære generation fra SF-268 og SK-N-SH-cellelinjer.. Bar, 50 um. (B) Ekspression af DCN og LUM mRNA i CSC berigelse kulturer. QRT-PCR-resultater blev normaliseret til ACTB og plottes som relative fold ændringer (FCS) mellem neurosfærer på forskellige tidspunkter (t4, T8, og T12) og vedhængende t

0-celler med 2

-ΔΔCt metode. Alle DCN og LUM FC værdier for neurosfærerne var statistisk signifikant (* p 0,01). (C) Western blotting-analyse af DCN og LUM. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Total DCN og LUM niveauer var højere i neurosfærer end i de adhærente celler af begge cellelinier. En 70-kDa LUM isoform blev opreguleret i neurosfærerne fra begge cellelinier, med den højeste ekspression i T8 neurosfærer. Adhærente SF-268 celler viste basal udtryk for 37-kDa LUM core protein.

protein analyse viste en klar stigning i LUM protein (70 kDa) under CSC berigelse. Den højeste LUM ekspression blev detekteret i både SF-268 og SK-N-SH t

8 neurosfærer (Fig 1C). Til gengæld blev 40-kDa LUM protein påvist med meget mindre ekspression at 70-kDa LUM i både SF-268 og SK-N-SH, og især i t

12 (fig 1C). På den anden side har vi bemærket en signifikant stigning i DCN ( 150 kDa) protein ekspression i både SF-268 og SK-N-SH t

12 neurosfærer mens 40-kDa DCN-protein blev påvist meget svagt, med en vanskelig udtryk evaluering. Ifølge mRNA resultater, 8-dages SLRP

+ CSC-lignende (T8 CSC-lignende) afledt af både GBM og NB cellelinjer blev indskrevet i yderligere analyse.

blød agar kulturer af SLRP

+ CSC-lignende og forældrenes cellelinjer

for at vurdere forskellene i cellevækst mellem CSC-lignende og forældrenes cellelinjer, de sekundære neurosfærer fra SLRP

+ t

8 CSC-lignende blev genereret i blød agar og sammenlignet med de parentale-celle-afledte primære neurosfærer. De forankringsuafhængige blød agar kulturer viste neurosfære kolonier i NSC SFM, mens der ikke eller lave kolonier af forældrenes celler var vokset i DMEM-baserede blød agar assay efter 22 dage (Fig 2A). De primære SK-N-SH-neurosfærer var større end SF-268 neurosfærer og nåede 200 um efter 3 uger, og havde vist en klart synlig mørk kerne i 3D struktur. De bløde agar kulturer af t

8 GBM og NB CSC-lignende (SLRP

+) voksede som små sekundære neurosfærer i NSC SFM, og nysgerrigt også som små kolonier i DMEM efter 30 dage (Fig 2B). De sekundære neurosfærer var mindre end de primære neurosfærer og intrasphere stressede celler (mørke kerner) var kun påvises i sekundære SF-268 neurosfærer efter 2 uger, mens de sekundære SK-N-SH neurosfærer opretholdt et gennemsigtigt udseende.

(A) Primær blød agar neurosfærer fra forældrenes cellelinjer. Fravær af kolonier dannelse i halvfast DMEM (22 dage) og neurosfære-dannelse i halvfast NSC SFM (14 og 22 dage). (B) Sekundære blød agar neurosfærer fra SLRP

+ CSC-lignende isoleret fra t

8 neurosfærer. Neurosphærer blev genereret i både halvfast DMEM og halvfast NSC SFM (14 og 22 dage), hvilket tyder på den langsomme cykling adfærd CSC-lignende og resterende død unddragelse aktivitet i DMEM-dyrkede sekundære neurosfærer. Bar, 50 um.

Heterogeneic ultrastructures af GBM og NB neurosfærer

Ultrastrukturel billeddannelse med TEM og SEM viste bred cellulær heterogenitet i de t

8 neurosfærer af begge cellelinier. SEM billeddannelse af neurosfære overflader viste mere pakkede celler i NB neurosfærer end i GBM neurosfærer, hvorimod de perifere celler af GBM neurosfærer havde mere fin hinde extroflections end SK-N-SH-neurosfærer (fig 3A, 3B, 4A og 4B ). Tilstødende elektron-tætte og elektron-Lucent celler og sporadiske apoptotiske celler blev observeret ved de GBM neurosfære periferier (Fig 3C-3E). De perifere celler af NB neurosfærer blev polariseret, med mere OSO

4-farvning i cytoplasmaet end de indre celler og indeholdt tætte granuler, endocytiske vesikler og få membran extroflections (Fig 4C-4E). Store områder af celledød, karakteriseret ved membranblæredannelse, celle rynker, apoptotiske legemer, og bred nukleare komprimeret heterochromatin, blev observeret i midten af ​​neurosfærer i begge cellelinier (figur 3G, 3H, 4g og 4h). Imidlertid blev aktiv mitose og levende celler tæt på de indre stressede sites også observeret, både i GBM og NB neurosfærer (fig 3G, 3i, 3J, 4F og 4J). Interessant, disse microenvironment-resistente celler i hypoxiske neurosfære kerne viste indrykkede kerner, store mængder af euchromatin og klart synlige mitokondrie apparat.

(A) SEM billede af en hel SF-268 neurosfære (1000 ×). (B) SEM billede af neurosfæren overflade (2200 ×). (C-J), TEM billeder af indre og perifere neurosfærer. Nærmere oplysninger om tynd membran extroflection (C-D), interaktioner mellem elektron-tætte og elektron-Lucent celler (E), oplysninger om celle-celle-adhæsion (F), der lider steder i de indre områder, med nekrotisk (G) og apoptotiske ( H) celler, levende celler, og nærmere oplysninger om den mitokondrie apparat i de indre områder (i, J). Bemærk de apoptotiske celler i periferien af ​​en neurosfære (D) og de levende celler, tæt på de lidende sites (I). Bar: (C-E) og (G-I), 5 um; (F og J), 1 um.

(A) SEM billede af hele SK-N-SH neurosfære (950 ×). (B) SEM billeddannelse af neurosfære overflade (3000 ×). (C-J) TEM billeder af indre og perifere neurosfære. Nærmere oplysninger om celle vesikler, celle polarisering, og udstationeringsprocedurer (C-E), levende celler i de indre neurosfærer og detaljer af mitokondrie apparat (F), der lider steder i de indre områder, med nekrotisk (G) og apoptotiske celler (H og jeg), og en intrasphere mitotisk begivenhed (J). Bar: (C-J), 5 um

TMZ behandling og MTT assay af SRLP

+ CSC-lignende og forældrenes cellelinjer

Low-range TMZ koncentrationer (. 0-500 uM) inducerede ikke signifikante forskelle i de metaboliske aktiviteter af SF-268 forældre celler og SRLP

+ t

8 CSC-lignende. Som vist i fig 5A, den metaboliske aktivitet af de parentale celler varierede fra 76,14% til 100% (94,63% ± 7,10%), mens metaboliske aktivitet af SRLP

+ t

8 CSC-lignende varierede fra 80,71% til 100% (88,22% ± 5,43%). Højere koncentrationer af TMZ (750-1500 uM) inducerede signifikante forskelle mellem SLRP

+ t

8 CSC-lignende og den parentale cellelinje. Ved disse koncentrationer, den metaboliske aktivitet af SF-268 parental cellelinje varierede fra 38,99% til 58,86% (51,80% ± 7,59%), mens den for SF-268 SRLP

+ t

8 CSC-lignende varierede fra 79.09% til 79.64% (78,94% ± 0,45%) (p 0,05). SF-268 forældrenes IC

50 var omkring 1250 uM, og nåede ikke IC

50 i SF-268 SRLP

+ t

8 CSC-lignende.

(A) SF-268 klæbende celler

versus

SF-268 SLRP

+ t

8 CSC-lignende. (B) Adhærerende SK-N-SH celler

versus

SK-N-SH SLRP

+ t

8 CSC-lignende. Cellevækstinhibering ved lave doser af TMZ (0-500 uM) var større i t

8 CSCS-lignende end i de parentale cellelinier, med signifikans i SK-N-SH-celler (* p 0,05, Fig 5B). I modsætning hertil cellevækstinhiberingen af ​​høje doser af TMZ ved, svarende til farmakologiske doser ( 750 uM), var større i de parentale celler end i t

8 CSCS-lignende celler i CSC berigelser for begge cellelinier (* p 0,05, figur 5A og 5B). DMSO baggrund blev trukket fra prøver og kontrol værdier og data vist som gennemsnit (SD) af [(A

prøver-A

DMSO) /(A

kontrol-A

DMSO)] * 100 af fire uafhængige forsøg.

ved lave og høje koncentrationer, TMZ inducerede signifikante forskelle i de metaboliske aktiviteter af SK-N-SH-stamcellerne og SRLP

+ t

8 CSC -synes om. Som vist i fig 5B, den metaboliske aktivitet af celler behandlet med 0-500 pM TMZ varierede fra 75,08% til 100% (88,41% ± 6,70%) for parentale celler og fra 66,86% til 100% (74.70% ± 10,84%) for SRLP

+ t

8 CSC-lignende (p 0,05). Men i celler behandlet med 750-1500 uM TMZ, den metaboliske aktivitet skiftede og varierede fra 42,91% til 68,56% (54,96% ± 9,61%) for stamcellerne, og fra 63,92% til 70,61% (66,64% ± 2,50%) for SRLP

+ t

8 CSC-lignende (p 0,05). IC

50 i SK-N-SH-parentale celler var omkring 1250 uM, og nåede ikke IC

50 i SK-N-SH t

8 SRLP

+ CSC-lignende.

diskussion

stamcelle teori om kræft er en ny forståelse af udvikling af kræft, der mener onkogenese at være afvigende organogenese [56]. Fordi CSC-lignende er til stede i kræft som tumor-initierende celler og cirkulerende tumorceller, kan de interagere med og reagere på CSC niche, som kan modulere celle skæbner, der bidrager til kræft væv heterogenitet og resistens [57]. Denne plasticitet letter forankring tab og celle motilitet, generere cirkulerende tumorceller

via

EMT i en lærerig mikromiljø. Forskellige CSC subpopulationer er fundet inden for samme tumor [58], bortvejre enhver tvivl om roller CSCS i kræft heterogenitet og mikromiljø modulation, og dermed i resistens [59, 60]. Adskillige tidligere undersøgelser rapporteret SLRP proteiner i bryst [61], pancreas [62], kolorektal [63], uterin livmoderhalsen [64], prostata [30], og lungekræft [65], blandt andre, der fremhæver de kontroversielle roller DCN og LUM i cancer biologi. Vores resultater giver det første bevis på relevansen af ​​DCN og LUM til CSC biologi, viser markant øgede mRNA og protein niveauer af begge SLRP i GBM og NB CSC-lignende. Men mens LUM mRNA og protein forøget i t

8 neurosfærer, DCN-mRNA forøget ved t

8 og DCN-protein ved t

12. Dette faktum kan forklares med forskelle mellem DCN og LUM i intrasphere fældefangst og måske af CSC specifikke reguleringsmekanismer post-transkriptionelle som stadig er ukendte. Desuden har indflydelse af vækstfaktorer og deres receptorer, såsom dem af EGF og TGF-β1, i DCN modulation og handel blevet vist i voksne celler [66, 67], hvilket tyder formodet krydstale af DCN og vækstfaktorer veje i CSC, som fortjener yderligere mekanistiske undersøgelser.

3D tumorsphere kulturer i betingede serum-frie medier, som udgør en metodisk udvikling af neurosfære kulturer, der anvendes i neurale stamceller og stamcelle forskning [68-70], betragtes repræsentative

In vitro

kræftmodeller nyttige i CSC-lignende berigelse af primær [71-75] og etablerede cancer cellelinjer [76, 77]. Her, blev denne model anvendes til at opnå neurosfære-baserede serumfrie CSC berigelse af human GBM og NB cancercellelinjer, øge celle plasticitet gennem celle dedifferentiation retning af en stilk-lignende fænotype.