PLoS ONE: Hæmning af AKT med oralt aktivt Allosterisk AKT Inhibitor, MK-2206, sensibiliserer endometriecancer Celler til gestagen

Abstrakt

gestagen modstand er en væsentlig hindring for at behandle tidligt stadie, veldifferentieret endometriecancer samt tilbagevendende endometriecancer. Mekanismen bag suboptimalt respons progestin er ikke godt forstået.

PTEN

tumorsuppressorgen ofte muteret i type I livmoderkræft og denne mutation resulterer i hyperaktivering af PI3K /AKT-vejen. Vi antager, at øget aktivering af AKT fremmer et utilstrækkeligt respons på progestiner i endometrie kræftceller. Ishikawa-celler stabilt transficeret med progesteronreceptor B (PRB23 celler) blev behandlet med AKT-inhibitor, MK-2206, som effektivt reducerede niveauer af p (Ser473) -Akt på en dosis-afhængig (10 nM til 1 uM) og tidsafhængig måde (0,5 h til 24 h). MK-2206 hæmmede niveauer af p (Thr308) -Akt og en nedstrøms mål, p (Thr246) -PRAS40, men ikke ændrede niveauer af p (Thr202 /Tyr204) ERK eller p (Thr13 /Tyr185) SAPK /JNK, viser specificitet af MK-2206 for AKT. Derudover MK-2206 behandling af PRB23 celler resulterede i en signifikant stigning i niveauet af progesteronreceptor B (PRB) protein. Microarray analyse af PRB23 celler identificerede PDK4 som den mest stærkt opreguleret gen blandt 70 opregulerede gener som reaktion på R5020. Hæmning af AKT yderligere opreguleret progestin-medieret udtryk for PDK4 men påvirkede ikke andet progestin-responsive gen, SGK1. Behandling af PRB23 celler med R5020 og MK-2206 uafhængigt nedsat levedygtighed af celler, mens kombinationen af ​​R5020 og MK-2206 forårsagede den største formindskelse i cellelevedygtighed. Endvidere mus med xenotransplanterede tumorer behandlet med MK-2206 alene eller med progesteron alene udviste beskedne reduktioner i deres tumorvolumen. Det største fald i tumorstørrelse blev observeret i mus behandlet med både MK-2206 og progesteron; disse tumorer udviste den mindste proliferation (Ki67) og mest apoptose (spaltet caspase-3) af alle behandlingsgrupper. Sammenfattende hæmning af AKT stabiliserer progesteron receptor B og forstærker progesteron reaktion i endometriecancer celler, som har hyperaktiveret AKT

Henvisning:. Pant A, Lee II, Lu Z, Rueda BR, Schink J, Kim JJ ( 2012) Hæmning af AKT med oralt aktivt Allosterisk AKT Inhibitor, MK-2206, sensibiliserer endometriecancer Cells til gestagen. PLoS ONE 7 (7): e41593. doi: 10,1371 /journal.pone.0041593

Redaktør: John P. Lydon, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 13, 2012; Accepteret: 22 Juni 2012; Udgivet: 24 juli 2012

Copyright: © 2012 Pant et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Institutes Sundhedsstyrelsen R21 CA127674 (JJK), National Institutes of Health /National Cancer Institute træning tilskud T32CA09560, og fra Malkin Scholars Program fra Robert H. Lurie Comprehensive Cancer center of Northwestern University (IIL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer er den mest almindelige gynækologiske malignitet i USA. I 2010 blev 43,470 nye tilfælde forventes resulterede i 7950 dødsfald [1]. Langt størstedelen af ​​endometriske kræfttilfælde er relateret til opponeret østrogen handling benævnes type I livmoderkræft. Den mest almindelige genetisk mutation, der forekommer hos ca. 50-80% af alle tilfælde i type I endometriecancer er i tumorsuppressorgen

PTEN

[2], [3]. En mutation i

PTEN

gen resulterer i nedstrøms konstitutiv aktivering af phosphatidylinositol 3′-kinase (PI3K) /AKT-vejen [4]. AKT er en serin /threonin-kinase, der aktiverer forskellige veje fremmer cellulær overlevelse og inhiberer apoptose [4], [5]. Det er tidligere blevet påvist, at der er forhøjede niveauer af aktiverede AKT i endometriecancer og at dette kan varsle en dårlig prognose hos disse patienter [6]. Derudover er det blevet vist, at inhibering af AKT-vejen i endometriecancer-celler resulterer i forøget apoptose, hvilket viser, at modulering af dette forløb kan spille en vigtig terapeutisk rolle [7], [8].

Endometriecancer er normalt behandles med kirurgisk fjernelse af livmoderen og adjuverende behandling som angivet ved den specifikke patologi. For tidligt stadium sygdom denne behandling resulterer i fremragende 5-års overlevelsesrater på over 90% [9]. Men denne endelige kirurgi udelukker enhver yderligere frugtbarhed. Som fedme øges i befolkningen, resulterer dette i et stigende antal yngre kvinder med endometriecancer og frugtbarhed-besparende terapi vil blive mere uvurderlig. I øjeblikket er gestagener bruges som primær terapi i avanceret eller recidiverende sygdom hos patienter, der ikke er operative kandidater på grund af sygelighed, og hos patienter i håb om at bevare deres fremtidige fertilitet. Flere tilfælde serie af patienter behandlet med gestagener er blevet offentliggjort med opmuntrende, men ikke absolut, resultater. Svarprocenten for endometriehyperplasi med atypi har varieret fra 67-82% og responsrater for lav kvalitet endometriecancer spænder fra 50-70% (revideret i [10]). For de patienter, som ikke responderer på progestinterapi, anbefales hysterektomi. Denne kliniske situation er almindelig som procentdelen af ​​patienter under 45 diagnosticeret med endometriecancer nu varierer fra 5 til 29% [10],.

Progesteron medierer sine hæmmende effekt på endometriet og endometriecancer via progesteron receptor (PR), en intracellulær steroid receptor med A- og B-isoformer. En stigning i de svarprocenter til progestin terapi og forbedrede overlevelse udgang er rapporteret i tumorer med en højere procentdel af PR [12]. PRA mangler 164 aminosyrer fra N-terminus og begge isoformer er oversat fra individuelle mRNA-arter af et enkelt gen under kontrol af forskellige promotorer og anses funktionelt forskellige [13]. Mens de specifikke roller for PRA og PRB fortsat uklare i endometriecancer, undersøgelser antyder, at PRB kan være den primære isoform ansvarlig for vækstinhiberende og tumor undertrykkende virkninger af progesteron in vitro. I PRB-stabilt transfekterede Ishikawa celler, MPA behandling resulterede i hæmning af proliferation, migration og invasion, mens PRA-stabilt transfekterede Ishikawa celler undladt at hæmme disse processer [14], [15]. Derudover PRB-transficerede Hec50co celler behandlet med progesteron påviste betydelige reduktioner i celleproliferation og invasion, mens Hec50co celler, der udtrykker PRA havde kun beskedne inhiberende virkninger [16].

MK-2206 er en oralt aktiv, allosterisk inhibitor af AKT. Talrige prækliniske studier har vist virkning ved inhibering AKT og fremme celledød som et enkelt middel og i kombination med andre kemoterapeutiske midler [17], [18], [19], [20]. Kliniske forsøg er i gang ved hjælp af denne hidtil ukendte forbindelse til cancerterapi til forskellige faste tumorer. MK-2206 viste sig at være generelt veltolereret i doser op til 60 mg via munden QOD og resulterede i plasmakoncentrationer inden for det accepterede terapeutiske område [21]. I øjeblikket er der en åben fase II forsøg sponsoreret af NCI for patienter med fremskreden eller tilbagevendende endometriecancer. De primære resultater er progressionsfri overlevelse og objektiv tumor respons.

I denne undersøgelse vi rapportere, at hæmning af AKT-vejen ved MK-2206 resulterer i nedsat levedygtighed og øget apoptose af endometriecancer celler. Desuden inhibering af AKT forøger PRB proteinniveauer, modificerer ekspressionen af ​​progestin-regulerede gener, og synergizes med progestin at formindske tumor volumen af ​​xenotransplantater. Kombinatorisk behandling med progestiner og AKT-hæmmere kunne anses for at bevidstgøre endometrie adenocarcinom til progestin terapi.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev godkendt af Northwestern University Animal Omsorgsudvalget.

endometriecancer Cells

PRB23 Ishikawa celler blev opnået fra L. Blok (Erasmus University, Holland). Ishikawa-celler stammede fra en veldifferentieret endometrial adenokarcinom med en kendt PTEN mutation [14]. De PRB23 celler blev dannet ved stabil transfektion af pcDNA3.1 PRB ekspressionsvektoren i Ishikawa-celler blottet for endogen PR [14]. De PRB23 celler blev holdt i DMEM /F12 med 10% FBS, natriumpyruvat, penicillin /streptomycin, hygromycin og G418. På cirka 60-80% sammenløb, blev cellerne serum sultet natten over i DMEM /F12. Cellerne blev derefter behandlet næste dag med bærer, 100 nM MK-2206 (2 timer forbehandling), 10 nM R5020, eller en kombination af MK-2206 og R5020. MK-2206 (Merck) blev opnået gennem Cancer Therapy Evaluation Program.

Western Blot

Hele cellelysater blev opnået på is ved hjælp af M-PER pattedyr lysis løsning (Thermo Scientific) suppleret med protease og phosphataseinhibitorer (Sigma). Koncentrationen af ​​protein i lysaterne blev målt under anvendelse af Micro BCA kit (Thermo Scientific). Isolerede proteinprøver blev kørt på 8% acrylamidgeler og overføres derefter til polyvinylidendifluorid-membraner (Whatman). Membraner blev blokeret i 5% bovint serumalbumin (BSA, Sigma) i TBS-T ved stuetemperatur i en time. Membraner blev derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer mod phosphoryleret (Ser473) -Akt, phosphoryleret (Thr 308) -Akt, phosphoryleret PRAS40, PRAS40, phosphorylerede (Thr202 /Tyr 204) ERK, ERK, (pThr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK, spaltet PARP, kløvet caspase 3 (Cell Signaling), og PR (Dako). Blottene blev vasket fire gange i TBS-T ved stuetemperatur og derefter inkuberet med sekundært peroxidase-konjugeret gede-anti-kanin eller gede-anti-muse-antistof i en time ved stuetemperatur. Membranerne blev udviklet med ECL Super Signal West Femto afsløring kit (Thermo Scientific). Membranerne blev strippet hjælp Restore Western Blot Stripping Buffer (Pierce) og probes med et antistof til beta-actin (Sigma) til en belastning kontrol.

Cell Levedygtighed

For at vurdere for celle levedygtighed, den alamarBlue cellelevedygtighed Reagent (Invitrogen) anvendt. PRB23 celler blev podet i en 96-brønds klar bund sort plade på ca. 1.500 celler per brønd i en 37 ° C inkubator. Cellerne lodes binde natten over, og næste dag blev vasket med PBS og derefter serum sultet natten over i serumfrit DMEM /F12. Den næste dag blev cellerne forbehandlet med 1 pM MK-2206 i en time og derefter behandlet med 100 nM R5020 i 120 timer. Ved slutningen af ​​behandlingstiden blev 10 pi alamarBlue reagens tilsat til hver brønd i to timer og derefter fluorescenssignalet blev målt på Synergy HT pladelæser fra Bio-Tek med KC4 3.4 software ved 530/590 nm for at bestemme cellelevedygtighed.

microarray analyse og statistisk analyse

Tre separate PRB-Ishikawa cellekulturer blev anvendt til microarray analyse. De eksperimentelle betingelser var vehikel eller behandling med 10 nM R5020 i 2 timer. Alle RNA-prøver blev behandlet på Genomics Core Facility i Center for Genetic Medicine ved Northwestern University (Chicago, IL). Kvaliteten af ​​total RNA blev vurderet ved anvendelse af Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). 1,5 ug af hver RNA-prøve, med 260/280 og 28S /18S-forhold på mere end 1,8, blev anvendt til fremstilling dobbeltstrenget cDNA. Kvalitet kontrol og sonde niveau behandling af Illumina microarray data blev yderligere foretaget med R BioConductor pakken, lumi (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/lumi.html). Databehandling også inkluderet en normalisering procedure udnytte den fraktil normaliseringsmetode [22] for at reducere tilsløring variation mellem microarrays, der måtte blive indført under de processer af prøveforberedelse, produktion, fluorescens mærkning, hybridisering og /eller scanning. Hierarkisk klyngedannelse og Principal Component Analysis blev udført på de normaliserede signal data til at vurdere prøven forholdet og variabilitet. Sonder fraværende i alle prøver blev filtreret i henhold til Illumina s afsløring p-værdier i den nedstrøms analyse. Differentiel genekspression mellem de forskellige betingelser blev bedømt ved en statistisk lineær model analyse under anvendelse af biologisk leder pakke limma, hvori en empirisk Bayes metode blev anvendt til at moderere faste fejl af de estimerede log-fold ændringer i genekspression, og resulterede i en mere stabil inferens og forbedret effekt, især for forsøg med lille antal mikroarrays ([23] https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html). De modereret t-statistik p-værdier afledt af limma analysen ovenfor, blev yderligere justeret for multipel testning af Benjamini og Hochberg metode til at styre falsk opdagelse sats (FDR). Listerne over differentielt udtrykte gener blev opnået af FDR kriterier 5% og fold ændring cutoff af . 1.5, og visualiseres ved vulkan plots

Real Time PCR

RNA blev isoleret fra celler under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Koncentration og renhed af ekstraheret RNA blev bestemt under anvendelse af ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop). Total RNA-prøver var DNase I (Zymo Research) behandles for at fjerne eventuelle kontaminerende DNA. Totalt RNA blev revers-transkriberet med Smart MMLV revers transkriptase (Invitrogen) til syntesen af ​​cDNA under anvendelse af fabrikantens protokol. Real-time PCR blev udført under anvendelse af specifikke primere (Applied Biosystems) til PDK4 og SGK1 og husholdning genet TBP. Den fold ændring i udtrykket blev beregnet ved hjælp af den ΔΔCt metoden [24], med TBP som en intern kontrol. Alle PCR-reaktioner blev udført på en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) i 40 cykler (95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min) efter 10 minutters inkubering ved 95 ° C.

tumorxenografter

Seks uger gamle CD-1 nøgne, ovariektomerede hunmus blev erhvervet fra Charles River Laboratories. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af Northwestern University Animal Care udvalget. En million PRB23 celler blev suspenderet i 01:02 PBS /Matrigel (BD Biosciences) i et totalt volumen på 100 pi og injiceret subkutant i den højre og venstre dorsum af hver mus. I alt 32 mus blev injiceret for at have 8 mus pr behandlingsgruppe. Tumorerne fik lov at vokse i 8 uger. Ud af 32 mus, tumorer voksede i 28 mus. Desuden 2 mus døde af ukendte årsager. De resterende 26 mus blev opdelt i 4 grupper, vehikel (6), progesteron (7), MK-2206 (7), og MK-2206 + progesteron (6). Progesteron pellets (50 mg, 21-dages frigivelse til 2,4 mg /dag) blev implanteret subkutant. Musene blev givet 120 mg /kg af MK-2206, 3 gange om ugen i 9 dage i et volumen på 0,3 ml 30% Captisol. Alle toksicitetsundersøgelser er udført i gnavere ved Merck og 120 mg /kg er den dosis anbefales at studere virkninger på tumorer uden at forårsage toksicitet [25]. Bærerkontrolgruppen mus blev givet 0,3 ml 30% Captisol. Mus blev vejet før og efter behandlingerne. Tumorstørrelser blev målt med passere gennem løbet af 8 uger samt efter behandlinger. Tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af formlen:

Tumor volumen

= 1/2 (

længde

×

bredde

)

2 [25] . Tumorer blev udskåret og bearbejdet til immunohistokemi.

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin, og 4 um vævssnit blev anbragt på objektglas. Tumor snit blev de-paraffinized. Heat epitopgenfinding blev derefter udført i en 10 nM natriumcitratbuffer med 0,05% Tween (Sigma) ved pH 6,0. Den citratbuffer blev forvarmet i et vandbad ved 99 ° C, og derefter blev glassene anbragt i bufferen i 45 minutter. Objektglassene fik lov at afkøle i 30 minutter ved stuetemperatur og blev vasket i TBS-T i 5 minutter. Dako EnVision HRP IHC kit blev anvendt. 3% brintoverilte blev påført vævssnit i 10 minutter efterfulgt af 2 vaske i 10 minutter i TBS-T. Protein blok blev anvendt i 30 minutter ved stuetemperatur. Vævssnittene blev derefter inkuberet med primære antistoffer mod PR (Dako) eller spaltes Caspase 3 (Cell Signaling) natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Anti-kanin eller anti-mus sekundært antistof blev derefter påført vævssnit i 1 time ved stuetemperatur og derefter vasket i TBS-T to gange i 5 minutter. DAB-opløsning blev påført på hvert væv sektion i 5 minutter og derefter skylles. Mayers hematoxylin blev anvendt til at modfarve og objektglassene blev skyllet. Snittene blev derefter anbragt i en opløsning af 28% ammoniumhydroxid og derefter skylles. Sektionerne blev dehydreret via 2 skift af 95% ethanol, 2 ændringer af 100% ethanol, og 2 hold xylen. Sektionerne blev derefter monteret på dækglas under anvendelse af Cytoseal XYL monterings medier (Richard-Allan Scientific). Glassene blev derefter visualiseret ved hjælp af Axiovert 200 (Zeiss) mikroskop og billeder taget med Zeiss Axiocam kameraet.

Resultater

MK-2206 Hæmmer AKT

Det har tidligere været rapporterede, at Ishikawa celler bærer en PTEN mutation og dette resulterer i konstitutiv aktivering af nedstrøms AKT [7], [8]. For at afgøre, hvorvidt MK-2206 inhiberede AKT i PRB23 celler blev celler behandlet med stigende koncentrationer af MK-2206 (0-1 uM) og inkuberet i forskellige tidsrum (0-24 timer) (fig. 1A, 1B). Phosphorylerede (Ser473) -Akt blev detekteret i celler behandlet med vehikel og niveauer gradvist faldt med stigende koncentrationer af MK-2206 (fig. 1A). Total AKT niveauer blev ikke påvirket af behandling med MK-2206. Niveauer af p (Ser473) -Akt faldt, så tidligt som 1 time og forblev lavere end vehikelbehandlede celler efter 24 timer (fig. 1b). Niveauer af p (Thr308) -Akt også faldet med 100 nM MK-2206 behandling på både 4 timer og 24 timer (Fig. 1C). PRAS40 er en direkte substrat for AKT og niveauer af p (Thr246) -PRAS40 faldt på MK-2206 behandling ved 4 timer og 24 timer, hvilket indikerer, at AKT aktivitet er faldet (fig. 1C). Dernæst for at påvise, at MK-2206 var specifik for AKT pathway i PRB23 celler, niveauer af andre phosphorylerede kinaser, som ikke er direkte mål for AKT blev målt. Niveauer af p (Thr202 /Tyr204) -ERK samt p (Thr183 /Tyr185) -JNK ændrede ikke på MK-2206 behandling enten på 4 timer eller 24 timer (Fig. 1C).

pRb- specifikke Ishikawa (PRB23) -celler blev behandlet med A) stigende koncentrationer (0-1 uM) af MK-2206 i 24 timer og B) 100 nM MK-2206 i forskellige tidsrum (0-24 h). Proteinniveauer af p (Ser473) -Akt, AKT og actin blev målt ved Western blot. C) PRB23 celler blev behandlet med 100 nM MK-2206 i 4 timer eller 24 timer og niveauer af p (Thr308) -Akt, AKT, s (Thr246) PRAS40, PRAS40, s (Thr202 /Tyr204) ERK, ERK, s ( Thr183 /Tyr185) SAPK /JNK, JNK og actin blev målt ved western blot.

Hæmning af AKT Øger PRB Protein Niveauer

Interessant, behandling med MK-2206 resulterede også i en signifikant stigning i PRB niveauer i PRB23 celler, hvilket indikerer, at AKT påvirker niveauer PR-protein i disse celler (fig. 2A). I betragtning af den antagonistiske funktion af progesteron i endometriet, konsekvenserne af modulerende PR niveauer er betydelige. Først blev et mikroarray udføres for at identificere PRB-regulerede gener i PRB23 celler. Specifikt blev PRB23 celler behandlet med 10 nM R5020 i 2 timer og således kun de tidlige respons gener til progestiner ville blive identificeret. I alt 70 gener blev signifikant opreguleret med mere end 1,5 gange og 16 gener blev nedreguleret signifikant (fig. 2B). De mest opreguleres gener var PDK4 (9,92 gange), TIPARP (7,79 gange), og SGK1 (4,41 gange). Gener blev yderligere analyseret med “funktionel anmærkning clustering” værktøj af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID) [26]. Gener blev kategoriseret efter SP-PIR Nøgleord database. Den kategori, der omfattede det højeste antal gener, som blev reguleret af R5020 var “phosphoproteiner” og den næsthøjeste var gener, dets produkter var forbundet med kernen (Fig. 2C).

A) PRB-specifikke Ishikawa (PRB23) -celler blev behandlet med vehikel, 100 nM MK-2206, 10 nM R5020, eller en kombination af MK-2206 + R5020 (M + R) i 4 timer og proteinniveauer af p (Ser473) -Akt, AKT, PRB og actin blev målt ved Western blot. B) Microarray analyse af PRB23 celler behandlet med vehikel eller 10 nM R5020 blev udført, og gener væsentligt reguleret af 1,5 gange eller mere, blev identificeret. C) Gene ontologi kategorier analyse blev udført ved hjælp af DAVID for gener reguleres af mere end 1,5 gange ved R5020.

Dernæst indflydelse AKT på PRB målgener blev undersøgt. PRB23 celler blev behandlet med 10 nM R5020 i nærvær eller fravær af 100 nM MK-2206. Angivelse af PDK4 og SGK1 blev derefter målt ved real time PCR. PDK4 og SGK1 blev kategoriseret som phosphoproteiner. Som afbildet i figur 3, blev begge PDK4 og SGK1 signifikant opreguleret af R5020, bekræfter microarray data. MK-2206-behandling alene havde ikke indflydelse ekspression af nogen af ​​de testede sammenlignet med vehikelbehandlede celler gener. Når celler blev behandlet i kombination med R5020 og MK-2206, udtryk for PDK4 steget markant, men SGK1 udtryk ændrede sig ikke med kombinationsbehandlingen i forhold til R5020 alene. Denne differentielle regulering af PRB målgener i PRB23 celler, når AKT inhiberes kraftigt antyder en mere komplekst system til regulering gener end blot stigende niveauer af PRB protein.

PRB23-celler blev behandlet med vehikel, 10 nM R5020, 100 nM MK-2206, eller en kombination af MK-2206 + R5020 (M + R) og genekspression af PDK4 og SGK1 blev målt ved anvendelse real-time PCR. Data er præsenteret som fold ændringer fra bærerbehandlede prøver og repræsenterer middelværdien ± SEM for 6 uafhængige eksperimenter. “*” Betegner statistisk signifikans sammenlignet med vehikelkontrol. P ≤ 0,05.

MK-2206 og gestagen Reducerer Cell Levedygtighed og tumorstørrelse

For at måle effekten af ​​AKT og progestin om kræft celle levedygtighed, PRB23 celler blev behandlet med R5020 i nærvær eller fravær af MK-2206 og cellelevedygtighed blev målt. Mens R5020 og MK-2206 uafhængigt nedsat levedygtighed af celler i løbet af 5 dage Kombinationen af ​​R5020 og MK-2206 forårsagede den største nedgang i levedygtighed (Fig. 4).

PRB23-celler blev behandlet med vehikel, 100 nM R5020, 1 uM MK-2206, eller en kombination af MK-2206 + R5020 (M + R) i 5 dage og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse af Alamar Blå assayet. Data er præsenteret som% levedygtighed fra bærerbehandlede prøver og repræsenterer middelværdien ± SEM for 4 uafhængige eksperimenter.

Dernæst virkningerne af progesteron og MK-2206 blev testet i xenotransplanterede tumorer, der er udviklet fra subkutan injektion de PRB23 celler i nøgne mus. Tumorerne blev dyrket i 8 uger og efterfølgende behandlet i 9 dage med vehikel, progesteron, MK-2206, eller progesteron + MK-2206 (fig. 5A). Vægt af mus ændrede sig ikke væsentligt med behandlingerne (fig. 5B). Sammenlignet med mus behandlet med vehikel, musene behandlet med MK-2206 alene eller progesteron alene udviste beskedne reduktioner i deres tumorvolumen baseret på fold ændring fra tumorstørrelsen før behandling. Det største fald i tumorstørrelse blev observeret i mus behandlet med både MK-2206 og progesteron (fig. 5C). Salg

A) PRB23 celler var xenotransplanteret subkutant i CD1 nøgne mus. Efter 8 uger blev mus behandlet med vehikel, 120 mg /kg MK-2206 oralt, 3 gange om ugen i 9 dage, progesteron eller en kombination af MK-2206 og progesteron. B) vægt af mus blev målt før og efter behandlinger og C) tumorer blev målt før og efter behandlingerne og volumen blev beregnet. “*” Betegner statistisk signifikans sammenlignet med vehikelkontrol. P ≤ 0,05.

Immunhistokemisk analyse blev udført på tumorsnit anvendelse af antistoffer til progesteronreceptoren, Ki67 og spaltes caspase-3 (fig. 6). Farvning for PR var tydelig i tumorer, selv om ikke alle celler var positive for PR. Progesteron behandling nedsatte niveauer af PR både i nærvær og fravær af MK-2206. I modsætning hertil MK-2206 behandling fremmet en stigning i PR-proteinniveauer i tumorerne, svarende til hvad der blev observeret i endometriecancer-celler (fig. 2A). Proliferation af cellerne blev målt ved Ki67 proteinniveauer, som faldt med progesteron, MK-2206, såvel som kombinationen progesteron + MK-2206 behandling. De laveste niveauer af Ki67-farvning blev observeret med den kombinerede behandling, hvilket antyder, at den kombinerede behandling mere effektivt reducerer proliferation af cancerceller. Niveauer af spaltet caspase-3, en indikator for apoptose, var ubetydelig i tumorer i vehikelbehandlede mus, mens farvning var tydelig i tumorerne af progesteron eller MK-2206-behandlede mus. Den kombinerede behandling resulterede i det højeste udtryk for kløvet caspase-3, tegn på øget apoptose.

xenotransplanteret tumorer blev fikseret, indlejret og sektioneret. Immunhistokemisk farvning af tumorer til PR, Ki67 og kløvet casapse-3 (CC3) blev udført.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi påvist, at MK-2206 effektivt nedsatte niveauer af p (Ser473) -Akt og p (Thr308) -Akt i PTEN-muterede Ishikawa celler. Som et resultat, niveauer af p (Thr246) -PRAS40, en nedstrøms mål for AKT, faldt også, hvilket angiver, at aktiviteten af ​​AKT blev inhiberet af MK-2206. Denne inhibitor påvirkede ikke niveauerne af andre kinaser, såsom pERK og pJNK demonstrerer specificitet for denne forbindelse til AKT pathway. Inhibering af AKT steg også niveauet af PRB. Tidligere påviste vi, at en anden AKT-inhibitor, API-59CJ-OMe (EMD4Biosciences), også signifikant forøget PR niveauer i PRB23 Ishikawa-celler [8]. Gu et al., [27], viste for nylig, at inhibering af PI3K hjælp LY294002 forøgede PR niveauer i Ishikawa-celler. Indflydelsen fra AKT-vejen på PR-ekspression og funktion er ikke undersøgt i detaljer, og de mekanismer, hvormed denne stigning i PR protein opstår øjeblikket udforskes i vores laboratorium. Vores nuværende arbejdshypotese centre rollen som AKT i aftagende følsomhed over for progesteron i endometriecancer. Faldende PR niveauer var det første bevis støtter vores hypotese. Det blev antaget, at øget PR niveauer bør forbedre PR transkriptionelle funktion, men data viser, at PR-handling er mere kompleks, da ikke alle progesteron-regulerede gener var påvirket af AKT hæmning. Det er velkendt, at, ligesom andre steroidhormonreceptorer, regulering af gener ved PR involverer mange interaktioner med andre transkriptionsfaktorer, DNA, coregulators og kromatin remodeling komplekser. PR handling er gen specifik i at forskellige mekanismer er ansat på forskellige steder i kromatin. Vores microarray analyse identificeret PDK4 at være den mest opreguleres gen (mere end 50 gange stigning) med kortvarig progestin behandling. Dette var også et gen, der blev yderligere forøget med progestin når AKT blev inhiberet, hvilket indikerer, at overaktiv AKT i Ishikawa-celler dæmper progesteron handling på dette særlige gen. Det er blevet vist, at PDK4 også opreguleres af glucocorticoider, gennem GR, i HepG2-celler [28]. De påviste, at overekspression af PKBa ophævede dexamethason stimulering af PDK4 promotor, der understøtter vores resultater. Desuden viste de, at FOXO1, som er direkte phosphoryleres med AKT og eksporteres til cytoplasmaet, var nødvendig for GR-medierede opregulering af PDK4. Vi har vist en samarbejde PR og FOXO1 i regulerer gener i endometrie stromale celler [29], [30], [31], og det er derfor sandsynligt, at PDK4 opregulering af progestiner kræver både PR og FOXO1 i endometrie kræftceller. Således, når AKT er aktiv, utilstrækkelige niveauer af FOXO1 er tilgængelige til at handle i kernen og ekspressionen af ​​PDK4 dæmpes. Det ville være interessant at bestemme betydningen af ​​PR og FOXO1 samarbejde i de andre progesteron-responsive gener, der var påvirket af AKT hæmning i endometriecancer.

PDK4 er en kinase, der inaktiverer pyruvat dehydrogenase komplekset (PDC) . PDC genererer acetyl-CoA, som er forløber for fedtsyresyntese og energiproduktion ved Krebs cyklus. PDC-aktivitet er reguleret af PDKs og PDC fosfataser at phosphorylere eller dephosphorylere E1a komponent af komplekset. Denne regulering er vigtigt at kontrollere dit blodsukker og lipid metabolisme. Opregulering af PDK4 af gestagener og en yderligere forbedring af denne stigning på MK-2206 behandling tyder på, at gestagener kan handle for at inaktivere PDC og hæmmer omdannelsen af ​​pyruvat til acetyl-CoA. Denne inhibering af acetyl-CoA-produktion kan derfor føre til udnyttelse af alternative metaboliske veje såsom glycolyse. I betragtning af den centrale rolle, som PDK4 spiller i regulering valget mellem glycolyse og oxidativ phosphorylering, er PDK4 blevet impliceret i en række forskellige cancere. Det er tidligere blevet vist, at inhibering af PDK aktivitet er tilstrækkelig til at inhibere proliferation og inducere apoptose i lungecancerceller, hvilket antyder, at PDKs kan drive tumorigenese [32]. nylige undersøgelser har imidlertid også vist, at overekspression af PDK4 er tilstrækkelig til at inhibere proliferation af brystcancerceller og at PDK4 ekspression nedreguleres i en række forskellige cancer væv [33]. Den særlige rolle, PDK4 spiller i endometriecancer endnu ikke tydes.

Prækliniske studier har vist MK-2206 til effektivt at inhibere AKT pathway samt nedgang proliferation og tumorvækst af forskellige cancercellelinier [25]. Det har også vist sig, at kombinationen af ​​MK-2206 og kemoterapeutiske midler er mere effektive til at hæmme tumorvækst [25]. MK-2206 sammen med en MEK-inhibitor blev demonstreret at have en synergistisk virkning på tumorvækst og førte til forøgede overlevelsesrater i mus bærende meget aggressive humane lungetumorer [34]. MK-2206 var i stand til at genskabe følsomhed af resistente celler til sorafenib, en tyrosinkinaseinhibitor, at inducere apoptose i hepatocellulære carcinomceller [35]. I kombination med Gefitinib, et lille molekyle inhibitor for EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren, MK-2206 fremmes effektivt apoptose i malignt gliom [17].