PLoS ONE: Necdin, en negativ vækst regulator, er en roman STAT3 Target Gene nedreguleret i Human Cancer

Abstrakt

Cytokine og vækstfaktor signalveje involverer STAT3 ofte konstitutivt aktiveret i mange humane primære tumorer, og er kendt for den transskriptionelle rolle, de spiller i kontrollen af ​​cellevækst og cellecyklusprogression. Men omfanget af STAT3 rækkevidde på transkriptionel kontrol af genomet som helhed stadig, et vigtigt spørgsmål. Vi forudså, at denne vedvarende STAT3 signalering påvirker en lang række cellulære funktioner, hvoraf mange stadig mangler at blive karakteriseret. Vi tog en bred tilgang til at identificere hidtil ukendte STAT3 regulerede gener ved at undersøge ændringer i hele genomet genekspression profil ved mikroarray, anvendelse af celler, der udtrykker konstitutivt aktiveret STAT3. Under anvendelse beregningsanalyse, var vi i stand til at definere genekspressionsprofilerne af celler indeholdende aktiveret STAT3 og identificere kandidat målgener med en lang række biologiske funktioner. Blandt disse gener identificeret vi Necdin, en negativ vækstregulator, som et hidtil ukendt STAT3 målgen, hvis ekspression er nedreguleret i mRNA og protein niveauer, når STAT3 er konstitutivt aktiv. Denne undertrykkelse er STAT3 afhængig, da hæmning af STAT3 hjælp siRNA genskaber Necdin ekspression. En STAT3 DNA-bindingssted blev identificeret i Necdin promotoren og både EMSA og kromatin immunofældning bekræfte binding af STAT3 til denne region. Necdin ekspression er tidligere blevet vist at være nedreguleret i et melanom og en lægemiddelresistent ovariecancer cellelinie. Yderligere analyse af Necdin ekspression påvist undertrykkelse i en STAT3-afhængig måde i humant melanom, prostata og brystcancercellelinier. Disse resultater antyder, at STAT3 koordinerer ekspression af gener involveret i flere metaboliske og biosyntetiske veje, der integrerer signaler, fører til globale transkriptionelle ændringer og onkogenese. STAT3 kan udøve dets onkogene virkning ved opregulering af transkription af gener involveret i fremme af vækst og proliferation, men også ved nedregulering ekspression af negative regulatorer af samme cellulære processer, såsom Necdin

Henvisning:. Haviland R , Eschrich S, Bloom G, Ma Y, Minton S, Jove R, et al. (2011) Necdin, en negativ vækst regulator, er en roman STAT3 Target Gene nedreguleret i Human Cancer. PLoS ONE 6 (10): e24923. doi: 10,1371 /journal.pone.0024923

Redaktør: Toshi Shioda, Massachusetts General Hospital, USA

Modtaget: August 21, 2010; Accepteret: August 24, 2011; Udgivet: 27 okt 2011

Copyright: © 2011 Haviland et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Angela Musette Russo Foundation (https://www.russofoundation.com/), H. Lee Moffitt Cancer center og Research Institute (https://www.moffitt.org) og National Cancer Institute (NCI) Grant R01-CA115674 (https://www.cancer.gov/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

STAT3 er en latent cytoplasmatisk transskriptionsfaktor, induceret af en række opstrøms signaler, herunder vækstfaktorer, cytokiner og ikke-receptortyrosinkinaser [1] – [7]. Ved aktivering af tyrosinphosphorylering, STAT3 danner dimerer, der translokerer til kernen og regulere transkription af målgener. Under normale fysiologiske betingelser STAT3 aktivitet tæt kontrolleret; imidlertid intracellulære signalveje involverer STAT3 ofte konstitutivt aktiveret i mange forskellige humane primære tumorer [8] – [15]. Vi og andre har vist, at konstitutiv aktivering af STAT3 giver cancerceller med vækst og overlevelse fordele [16] og forbedrer tumorangiogenese [17] og metastase [18]. Nylige undersøgelser har også vist, at STAT3-aktivering bidrager til tumor immun unddragelse [19], [20]. Disse resultater viser, at afvigende STAT3 signalering påvirker en lang række grundlæggende cellulære funktioner gennem flere mekanismer.

Til dato opreguleret udtryk for talrige STAT3 målgener er blevet identificeret, herunder VEGF [17], Bcl-2 , Bd-xL [21], p21, cyklin D1 [22] og survivin [23]. Disse STAT3 målgener er generelt blevet identificeret på individuelt grundlag, mens få undersøgelser har forsøgt at identificere et stort antal STAT3 regulerede gener [24] – [28]. Vi tog en bred tilgang til at identificere hidtil ukendte STAT3 regulerede gener involveret i onkogenese ved at undersøge ændringer i hele genomet genekspression profil ved mikroarray, anvendelse af celler, der udtrykker konstitutivt aktive STAT3. Kombinere denne tilgang med beregningsmæssige analyse af microarray resultater, var vi i stand til at definere genekspressionsprofilen af ​​celler, der udtrykker aktiveret STAT3 og undersøge, hvilken rolle STAT3 i både positiv og negativ regulering af genekspression.

Pathway og funktionel analyse viser, at STAT3 har en vigtig rolle i regulering, både positivt og negativt, en bred vifte af cellulære processer foruden transkription. STAT3 koordinerer ekspressionen af ​​gener involveret i flere metaboliske og biosynteseveje, integrerer signaler, der fører til de globale transkriptionelle ændringer og onkogenese. Disse indbefatter gener involveret i celleadhæsion, cytoskelet remodeling, nukleotid, lipid og protein metabolisme samt signaltransduktion.

Gennem beregningsanalyse af vores data, identificerede vi Necdin, en negativ vækstregulator, som et hidtil ukendt potentiale STAT3 målgen. Necdin er en potent vækst suppressor der overvejende udtrykkes i post-mitotiske neuroner [29] – [32]. Necdin ekspression er blevet vist at være nedreguleret i begge carcinomcellelinjer og primære tumorer [33], hvilket antyder, at undertrykkelse af Necdin ekspression kan spille en rolle i onkogenese. Vi har kontrolleret, Necdin mRNA-ekspression omvendt korrelerer med STAT3-aktivitet i celler, der udtrykker konstitutivt aktive STAT3 og at STAT3 direkte regulerer ekspressionen af ​​Necdin på promotoren niveau. Desuden er Necdin ekspression i humane tumorcellelinier omvendt korreleret med aktivering af endogent STAT3. Vores resultater giver yderligere bevis for en rolle Necdin som en fysiologisk mål for STAT3, viser, at beregningsmæssige analyse af microarray data kan bruges til at identificere potentielle STAT3 målgener til yderligere undersøgelse.

Resultater

Identifikation af potentielle STAT3 Target gener Brug Oligonucleotid Microarrays

for at identificere potentielle nye STAT3-regulerede gener, vi undersøgte globale genekspression mønstre i cellelinjer huser vedvarende aktiv STAT3. Genekspressionsprofiler i sådanne celler er tilbøjelige til at være repræsentativ for genetiske profil en cancercelle med afvigende STAT3 ekspression, sammenlignet med induktion STAT3 aktivitet transient hjælp exogen stimulering, såsom IL-6 eller transient transfektion [25].

RNA blev høstet fra normale Balb /c-3T3-celler med lave niveauer af endogen STAT3-aktivitet, for at tjene som kontrol. RNA blev også ekstraheret fra Balb /c-3T3-celler stabilt transficeret med enten v-Src, der vides at inducere vedvarende aktivering af STAT3 [34], [35], eller den konstitutivt aktive mutant, STAT3-C [36]. Tredobbelte prøver blev opsamlet, en fra tre på hinanden følgende passager, og hver RNA-prøve blev hybridiseret til en enkelt Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip. Betydning Analyse af microarrays (SAM) [37] blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte gener mellem parentale Balb /c-3T3-celler og celler stabilt transficeret med enten v-Src eller STAT3-C. Vi accepterede alle gener identificeret af SAM som forskelligt reguleret af mindst 1,5 gange [38].

Overlapning af to Microarray Datasæt

microarray analyse og efterfølgende SAM genereret to lister med differentielt udtrykt gener: én liste identificerede gener differentielt udtrykt mellem kontrol Balb /c-3T3-celler og celler transficeret med v-Src, og den anden liste indeholder gener udtrykkes differentielt mellem kontrol Balb /c-3T3-celler og celler transficeret med STAT3-C. Gener der er fælles for begge lister er mest sandsynligt at blive reguleret direkte af STAT3. Disse gener blev identificeret ved krydsreferencer data i de to lister ved hjælp af Microsoft Excel LOPSLAG funktion

Mens v-Src transformerede celler har konstitutivt aktiv STAT3, Src stimulerer også andre STAT3-uafhængige veje [39]. – [42]. I modsætning hertil er målgener aktiveres af STAT3-C begrænses til direkte binding af det aktiverede protein til STAT3 konsensus sites i DNA. Derfor anvendelse af celler stabilt transficeret med enten v-Src eller STAT3-C tilladt os at kontrollere for klonale varianter, samt forskelle i signalveje afhængigt af mekanismen for STAT3-aktivering. Brugen af ​​flere microarray replikerer i vores tilgang yderligere stigninger tillid til resultaterne. Dette tillod os at identificere et sæt fælles gener som mål for STAT3. Dataene blev yderligere valideret af identifikationen af ​​flere tidligere karakteriserede STAT3-regulerede gener, herunder CCND1, p21 [22], VEGFA [17], og Mcl-1 [43]. Den mest markant overudtrykkes (induceret) og under-udtrykt (undertrykte) gener er anført i tabel 1 og tabel 2. En mere omfattende liste, herunder top 50 betydeligt over-udtrykt og under-udtrykte gener indgår i tabellerne S1 og S2.

Til dato har de fleste undersøgelser undersøgte formodede STAT3 målgener der opreguleret eller overudtrykt når STAT3 er aktiv. STAT3 er blevet vist at aktivere transkription af mange gener er involveret i onkogenese [8], celleoverlevelse [16], tumorprogression [23] og metastase [18]. STAT3 har også tidligere vist sig at undertrykke transskription af en håndfuld gener, herunder p53 [44] og nitrogenoxidsyntase [45] Imidlertid vore resultater viser, at STAT3 er i stand til at undertrykke ekspressionen af ​​et meget større antal gener. Denne hidtil ukendte opdagelse har potentiale til dybt påvirke biologi celler, der huser konstitutivt aktiv STAT3.

Et sådant gen, der synes at være undertrykt af STAT3 er den negative vækstregulator Necdin. Fem Affymetrix probesets svarende til NDN er rangeret på listen over de top 12 mest markant fortrængte probesets (tabel 2), hvilket tyder på, at Necdin væsentligt undertrykt når STAT3 er konstitutivt aktiv. Dette viser, at beregningsmæssige analyse af microarray data kan bruges til at identificere potentielle STAT3 målgener til yderligere undersøgelse.

Pathway Analyse afslører Kendte og Novel funktioner STAT3

Mikroarrays vurdere samtidige ændringer i transkriptniveauer på individuel basis, hvilket resulterer i en lang liste af gener, der i væsentlig grad har ændret transkriptniveauer sammenlignet med kontrolceller. Men disse ændringer i genekspression ikke forekomme som uafhængige hændelser i cellen, men styres på en koordineret måde og er ofte forbundet med hinanden. Pathway Analysis er en objektiv metode til at bestemme, om differentielt udtrykte gener, og proteinerne, de koder, er beriget med bestemte veje, der giver indsigt i den biologiske betydning af de observerede ændringer.

Vi udsatte listen over differentielt udtrykte gener fælles mellem v-Src og STAT3-C udtrykker celler til MetaCore ™ Analysis Suite (GeneGO) og sammenlignede dem med kendte biologiske veje i metabasen ™ databasen. Ved hjælp af denne analyse var vi i stand til at identificere kendte STAT3 veje, herunder JAK /STAT vej og angiotensin /STAT vej. Det giver støtte til anvendelse af sådanne analyser til at identificere nye veje, der også kan reguleres af STAT3.

Cell vedhæftning og cytoskeletal remodeling var blandt de mest betydeligt beriget veje identificeret fra differentielt udtrykte gener (Tabel 3). Rolle STAT3 i cytoskeletal remodeling er tidligere blevet beskrevet [46]. Funktionel analyse af generne vi identificeret i cytoskelet remodeling processer, indikerer, at STAT3 regulerer gener involveret i protein-phosphorylering, signalering (MAPKK og Ras veje) samt respons på hypoxi og cellevandring.

Vi også undersøgt generne reguleres af STAT3 i celleadhæsion og påvist, at proteiner involveret i celle-matrix adhæsion og celle-celle-adhæsion, særlig fokal adhæsionsdannelse, især blev beriget når STAT3 er konstitutivt aktiv, samt adskillige gener i integrin celleadhæsion pathway. Som sådan, viser vi, at beregningsmæssige analyse af microarray data kan identificere både kendte og nye veje reguleret af STAT3.

Funktioner af inducerede gener

For at bestemme den funktionelle klassificering af differentielt udtrykte gener identificeret af SAM, udførte vi Funktionel Annotation hjælp af i DAVID Bioinformatik Database (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) [47], [48]. En bred vifte af målgener blev ændret af STAT3 aktivering, herunder gener involveret i flere veje, der regulerer biologiske og cellulære processer, protein lokalisering og transport, samt orgel og systemudvikling (tabel 4). Gener inden for disse kategorier (Tabel S3. «Affymetrix Probeset id’er ‘kolonne udvider til at liste alle probeset ID’er) omfatter mange involveret i cellevækst og vedligeholdelse, såsom lipid, nukleotid og proteinsyntese, metabolisme og /eller lokalisering (herunder VLDLR, APOL6, AK5, MTAP, UPP1, POP5, NUPL1, SEC61B, VDP) samt signaltransduktion, som alle er forpligtet til at fremme cellevækst og proliferation.

STAT3 har en velkarakteriseret rolle i reguleringen af ​​gen transkription, imidlertid viser vi også gennem Funktionel analyse, at STAT3 kontrollerer ekspressionen af ​​gener involveret i cellulære processer, der kræves for at transportere proteiner og regulere deres subcellulære lokalisering. Dette understøtter vores hypotese, at STAT3 koordinerer flere veje i cellen, og afslører, at STAT3 har vidtrækkende konsekvenser, kontrollerende flere cellulære veje er involveret i fundamentale biologiske processer. Vores resultater tyder på, at STAT3 orkestrerer transkription, translation, transport og lokalisering fører til bred nå effekter på cellevækst, proliferation og overlevelse.

I modsætning til tidligere undersøgelser af STAT3 målgener, vi viste, at STAT3 regulerer en mangfoldig vifte af gener i både en positiv og negativ måde. De fleste gener reguleres af STAT3 der er blevet identificeret til dato demonstrere forøget ekspression i celler, hvor STAT3 er aktiveret. Men vores resultater viser også, at STAT3 signalering forårsager undertrykkelse af mange gener, herunder Necdin, som dybt kan påvirke biologi celler huser konstitutivt aktiv STAT3.

konstitutivt aktiveret STAT3 Blocks Necdin mRNA ekspression

Vi derefter satte sig for at kontrollere den beregningsmæssige analyse og bekræfte, om Necdin er i virkeligheden en STAT3 target gen. NDN, genet kodende Necdin, en negativ vækstregulator [31] og medlem af MAGE-familien af ​​melanom-associeret tumorantigener, blev identificeret som en kandidat STAT3-reguleret gen. Fem Affymetrix probesets svarende til NDN er rangeret på listen over de top 12 mest markant fortrængte probesets (tabel 2). Sammenlignet med normale kontrolceller, analyse af microarray data viste, at NDN ekspression konsekvent blev undertrykt i de cellelinjer, der udtrykker v-Src eller STAT3-C, hvilket indikerer, at NDN er kandidat STAT3-reguleret gen i begge disse cellelinjer (Fig . 1A). Figur 1B. bekræfter, at NDN mRNA-ekspression er dramatisk nedreguleret i v-Src og STAT3-C udtrykkende celler som målt ved kvantitativ realtids-PCR.

A. Microarray Analyse af Necdin mRNA ekspressionsniveauer. RNA fra Balb /c-3T3-celler stabilt udtrykker enten pMvSrc eller pRc-STAT3-C blev isoleret, behandlet og hybridiseret til Affymetrix Mouse Genome 430 2,0 GeneChips. For at styre både biologisk og eksperimentel variation for hver cellelinie, celler blev høstet fra tre på hinanden følgende passager. Ved hver passage blev fem 10 cm plader af eksponentielt voksende celler samlet til RNA-ekstraktion og RNA hybridiseret til en enkelt Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 GeneChip. De arrays blev scannet og fluorescens blev målt med en Affymetrix GeneArray 3000 GeneChip scanner og billedet behandles ved hjælp af GeneChip Operating Software (GCOS) version 1.1 til at producere CEL filer, der indeholder sonde-niveau data for hver GeneChip. Alle microarray eksperimenter blev udført i tredobbelte uafhængige eksperimenter, og resultaterne er præsenteret for hver probe indstillet som gennemsnit fold ændring i RNA-ekspression. Data for to forskellige probesets præsenteres. Signalintensiteten af ​​de parentale Balb /c-3T3-celler blev sat til 100%. B. Real-time PCR-analyse. RNA-prøver, der anvendes til microarray analyse blev målt for Necdin mRNA-ekspression under anvendelse af realtids-PCR med genspecifikke primere og fluorescensmærket probe (TaqMan®-genekspression Assays, Applied Biosystems). RNA-ekspression blev normaliseret til 18S rRNA. n = 3 uafhængige eksperimenter. C. Western. NIH3T3-celler, der stabilt udtrykker v-Src blev podet (2,5 x 10

5) i 6 cm vævsdyrkningsplader i komplet medium 24 timer før transfektion. Celler blev derefter transficeret med enten 125 nM kontrol siRNA eller 100 nM eller 125 nM STAT3 siRNA. Ved 48 timer efter transfektion blev totalt protein høstet og lige mængder af totalt protein (100 ug) blev fyldt på en 10% SDS-polyacrylamidgel, elektroforese og immunoblottedes for Necdin (polyklonale, Abcam ab18554), phosphoryleret STAT3 (p-STAT3, cellesignalering 9131), samlet STAT3 (Santa Cruz, sc-482) og anti-actin (monoklonalt, Sigma A-4551) proteiner.

Undertrykkelse af Necdin mRNA ekspression er STAT3 Afhængig

NIH-3T3-celler, der stabilt udtrykker v-Src udtrykker høje niveauer af aktiv STAT3. Disse v-Src 3T3-celler blev behandlet med enten kontrol siRNA eller to forskellige doser af STAT3-specifikke siRNA. Celler behandlet med kontrol siRNA opretholde høje niveauer af STAT3 og har lave niveauer af Necdin udtryk (fig. 1C, bane 1). Som forventet, STAT3 siRNA effektivt inhiberede ekspression af total STAT3 (fig. 1C, bane 2 og 3). I disse celler ekspressionen af ​​STAT3-protein blev inhiberet på en dosis-afhængig måde, og Necdin ekspression blev gendannet i overensstemmelse med STAT3 knockdown i denne cellelinie. Disse resultater tyder på, at undertrykkelse af Necdin er afhængig aktiveret STAT3.

Aktiveret STAT3 bindes til Necdin arrangøren

in vitro

For at afgøre, om STAT3 direkte regulerer Necdin transskription, vi analyseret sekvensen for muse NDN promotoren [32] for potentielle STAT3-bindingssteder. STAT3 konsensus sites er blevet defineret som palindrome sekvenser med den fælles sekvens 5′-TT (N

4-6) AA-3 ‘[49]. Vores analyse identificeret adskillige kandidat STAT3-bindingssteder i hele 1500 basepar opstrøms for det transkriptionelle startsted. Dobbeltstrenget oligonukleotidprober blev genereret for alle potentielle bindingssites og testet i en konkurrence EMSA (Fig. 2A) for deres evne til at konkurrere om bindingen af ​​STAT3 mod en høj affinitet variant af STAT3-bindingsstedet i c-

fos

promotor (hSIE) [50]. Oligonukleotidet indeholdende det formodede bindingssted ved position -558 i forhold til transkriptionsinitieringsstedet blev identificeret som værende i stand til at konkurrere mest effektivt med hSIE probe (fig. 2A, bane 9). Desuden testede vi evnen af ​​stigende mængder ikke-radioaktiv NDN /-558 oligonukleotid til at konkurrere med den radiomærkede hSIE probe for binding af aktiveret STAT3. Som vist i figur 2B, en høj molært overskud af umærket NDN /-558 er i stand til at konkurrere med

32P-hSIE for STAT3 binding.

A. Konkurrence EMSA. Oligonukleotider til sense- og antisense-strenge af alle formodede STAT3-bindingssteder i Necdin promotoren blev annealet og anvendt til at konkurrere om STAT3 binding med

32P-mærket hSIE oligonucleotid under anvendelse af 5 ug af kerneekstrakt fra Balb /c-3T3-celler stabilt transficeret med v-Src som en kilde til aktiveret STAT3. En kandidat STAT3 DNA-bindingssted i muse Necdin promotoren blev identificeret (position -558 i forhold til translationsinitieringsstedet). Den høje affinitet STAT3 bindende oligonukleotid blev hSIE anvendt som positiv kontrol. *, “Supershifting” blev opnået ved anvendelse af anti-STAT3 antistoffer tilsat til reaktionsblandingen for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​STAT3 i komplekset. B. Competition EMSA. 3T3 v-Src kerneekstrakt blev inkuberet med enten

32P-mærket dobbeltstrenget hSIE oligonucleotid (bane 1 og 2) eller med umærket vildtype-NDN /-558 oligonukleotid i en 10- til 10

3-fold moloverskud (bane 3-5) før tilføje

32P-mærket hSIE oligonukleotid, at konkurrere med hSIE for STAT3 binding. SS, supershift med anti-STAT3 antistoffer. C. EMSA. 3T3 v-Src kerneekstrakt blev inkuberet med de følgende

32P-mærkede dobbeltstrengede oligonukleotider: hSIE (bane 1 og 2), NDN /-558 (bane 3 og 4), med og uden anti-STAT3 antistoffer. D. chromatin immunoprecipitation assay (chip). Balb /3T3 v-Src-celler udtrykker konstitutivt aktiv STAT3 blev anvendt til chip. Kort fortalt, efter tværbinding histoner til DNA ved formaldehyd i 10 minutter blev cellerne opsamlet og sonikeret at klippe DNA til en gennemsnitlig længde på 200-1000 bp. En portion af dette materiale blev anvendt som en positiv kontrol for PCR (indgang). Den resterende prøve blev inkuberet med enten anti-IgG eller anti-STAT3 antistoffer natten over og derefter immunopræcipiteret anvendelse af protein A-agarose. Histon-DNA-komplekset blev revers tværbundet efter flere vasketrin, og prøver blev underkastet PCR under anvendelse af specifikke primere omgiver kandidat STAT3-bindingssted ved position -558 i NDN promotoren.

A dobbeltstrenget

32P-radiomærket DNA-oligonukleotid svarende til NDN /-558 sekvens identificeret i NDN promotoren blev derefter anvendt i en EMSA til påvisning STAT3 DNA-binding. The NDN probe, samt den positive kontrol sonde, hSIE, blev inkuberet med 5 ug kerneekstrakt fra v-Src 3T3-celler og underkastet nativ gelelektroforese. Som vist i figur 2C, aktiveret STAT3 binder til højaffinitets-sekvensen i hSIE oligonukleotid (bane 1), samt til sekvensen afledt af NDN promotoren (bane 3). For at bekræfte at STAT3 er indeholdt i proteinkompleks binding til oligonukleotiderne, kerneekstrakten blev præ-inkuberet med anti-STAT3 antistoffer før tilsætning af radioaktivt mærkede probe ( “supershift” bands, bane 2 og 4). NDN /-558 viser en svagere STAT3 DNA-bindingsaktivitet sammenlignet med den kunstige høj affinitet STAT3 bindende element hSIE og tilsætning af anti-STAT3 antistof- delvist blokerer binding af den radioaktive probe. Dette kan resultere hvis antistoffet genkendelsesstedet og DNA-bindende domæne i STAT3 var i tæt nærhed, hvilket bevirker at antistoffet delvist hindrer binding af STAT3 til proben.

Binding af STAT3 til NDN Promoter

in vivo

for at afgøre, om STAT3 kunne binde Necdin promotor i intakte celler, blev kromatin immunopræcipitationsanalyser (chip) udført i 3T3 v-Src celler anvendelse af et antistof specifikt for STAT3. Som vist i figur 2D, PCR gav Necdin promotor-DNA immunpræcipiteret med et anti-STAT3 antistof i området ved -558 formodede STAT3-bindingssted, men ikke på en kontrol sted på NDN promotoren. Det særlige ved dette bindingsinteraktionen demonstreres ved manglen på signal, der genereres, når en kontrol antistof anvendes (anti-kanin IgG). Disse data giver belæg for, at STAT3 direkte kan binde Necdin promotor i intakte 3T3 v-Src celler.

Da både de EMSA og chip assays tyder på, at STAT3 har evnen til at binde til NDN promotor både

i vitro

in vivo

dette tilvejebringer yderligere bevis for, at kontrollen med NDN ekspression af STAT3 sker via en direkte binding hændelse på promotoren og at genregulering forekommer primært på niveauet for transkription.

Necdin Expression undertrykkes i human melanomaceller

Vi næste undersøgt, om nedregulering af Necdin forekom i humane tumorceller med aktiveret STAT3. Ekspression af Necdin har tidligere vist sig at være undertrykt i melanomceller [51], så vi undersøgt, om dette havde en korrelation med STAT3 aktivitet.

STAT3 phosphorylering, STAT3 DNA-bindende aktivitet og total STAT3 niveauer har vist sig at stigning i A375 melanomceller i en densitet-afhængig måde i fravær af ligand [52]. A375-celler blev udpladet ved stigende tæthed og lodes vokse i 72 timer. Nukleare ekstrakter blev fremstillet og analyseret ved EMSA. Figur 3A viser, at DNA-binding af STAT3 stiger med celledensitet som forventet. Vi analyserede derefter totalt protein ved Western blot for Necdin ekspression. Figur 3B viser, at ekspression af total STAT3 og STAT3 phosphorylering opreguleres i en densitet-afhængig måde. Omvendt som STAT3-aktivering stiger, Necdin ekspression nedreguleres på proteinniveauet

A375-celler blev udpladet ved forskellige tætheder (Fig 3A og 3B:.. 1, 2,5, 5 eller 7,5 × 10

5-celler, fig 3C:. 10

5 og 10

6 celler) i 10 cm plader og dyrket i 72 timer. Nukleare ekstrakter og totalt protein blev opsamlet. A. EMSA. Kerneekstrakter fra A375-celler blev inkuberet med STAT3-specifik hSIE

32P-mærket dobbeltstrenget oligonukleotid. B. Western blot. Totale proteinekstrakter blev høstet fra A375-celler udpladet ved forskellige tætheder og lige mængder af totalt protein (100 ug) blev fyldt på en 10% SDS-polyacrylamidgel, elektroforese og immunoblottedes for Necdin, phosphoryleret STAT3 (p-STAT3) og totale STAT3 proteiner . C. Western-blot. A375-celler blev udpladet med to forskellige tætheder (10

5 og 10

6 celler) og fik lov at adhærere natten over. Plader podet ved 10

6-celler blev derefter behandlet med enten DMSO eller CPA-7 (20 pmol /l) og alle celler blev dyrket i yderligere 48 timer. Totalt protein blev høstet og analyseret ved Western-blot. For densitometri blev billeder digitalt scannet og optisk tæthed af båndene blev kvantificeret ved hjælp af Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) og normaliseret til at styre. Forholdet mellem pSTAT3 til total STAT3 blev beregnet for de enkelte baner.

For at bekræfte, at undertrykkelsen af ​​Necdin udtryk er STAT3-afhængig, blev A375-celler udpladet med høj tæthed, og fik lov til at holde sig natten over, før de behandlet med enten DMSO eller STAT3-inhibitor CPA-7 (20 pmol /l) i 24 timer [53]. Western blot analyse viser, at når A375-celler udplades ved lav densitet (10

5 celler), Necdin ekspression er høj, hvorimod aktiverede STAT3 er lave (fig. 3C, spor 1). Celler udpladet ved høj densitet (10

6 celler), (fig. 3C, bane 3) viser højere niveauer af p-STAT3 og nedsat ekspression af Necdin. Behandling af høj densitet A375-celler med CPA-7 til 24 timer inhiberede STAT3-aktivering (fig. 3C, bane 2), og Necdin niveauer i disse celler gendannes til høje niveauer, der kan sammenlignes med celler udpladet ved lav densitet.

IL-6 undertrykker Necdin ekspression i humane prostatacancerceller

handlinger IL-6 som en autokrin vækstfaktor i prostatacancer [54] og er blevet forbundet med progression af tumorer [55]. IL-6 signaler transmitteres via JAK-STAT pathway fra receptorer på celleoverfladen til målgener i kernen, der involverer phosphorylering og aktivering af STAT3 [56]. Vi undersøgte derfor, om aktivering af STAT3 via IL-6 stimulering førte til undertrykkelse af Necdin udtryk i prostata cancer cellelinjer DU145 og PC3. Disse cellelinier harbor lave niveauer af konstitutivt aktive STAT3 [57], [58], som yderligere kan induceres ved stimulering med IL-6. Celler blev serum sultet i 3 timer før behandling med IL-6 (10 nmol /l) i 12 eller 24 timer. Totalt protein blev fremstillet og analyseret ved Western-blot. Figur 4A viser, at IL-6-stimulering resulterede i øget STAT3-aktivitet i cellerne og demonstrerede tilsvarende nedregulering af Necdin ekspression ved IL-6-stimulering, i begge cellelinier. Dette bekræfter, at IL-6 er i stand til at undertrykke Necdin udtryk via STAT3 i prostata kræftceller.

A. Western-blot. Totalt protein fra DU145 og PC3-celler behandlet med IL-6 (10 nmol /l) i 12 eller 24 timer blev analyseret ved Western blot. B. Total protein blev høstet fra MDA-MB-468, MDA-MB-231 og MCF-7-celler og underkastet Western blot analyse. C. MCF-7-celler blev podet og tilladt at adhærere natten over før transient transficeret med kontrol (GFP), pMvSrc eller pRc /CMV-STAT3-C plasmider under anvendelse af lipofectamin PLUS. Totalt protein blev opsamlet ved 48 timer efter transfektion og underkastet Western blot analyse. For densitometri blev billeder digitalt scannet og optisk tæthed af båndene blev kvantificeret ved hjælp af Scion Image (Scion Corporation, Frederick, MD) og normaliseret til at styre.

Necdin Expression korrelerer med STAT3 aktivitet i Human Breast Cancer Celler

Da EGFR og Src signalveje bidrager til STAT3 aktivering i brystkræft [15], [34], vi evaluerede Necdin ekspressionsniveauer i humane brystcancer cellelinjer med forskellige niveauer af endogen STAT3 aktivitet. Figur 4B viser, at p-STAT3 proteinniveauer var høj i MDA-MB-468 celler, lidt lavere i MDA-MB-231 og meget lavt i MCF-7-celler. Necdin proteinekspression omvendt korreleret med p-STAT3 niveauer, udtrykt på et lavt niveau i MDA-MB-468 og MDA-MB-231 celler, men udviste meget højere udtryk i MCF-7 celler.

For at teste den hypotese, at konstitutivt aktiveret STAT3 har en kausal rolle i at undertrykke Necdin ekspression i tumorceller, undersøgte vi, om forbigående aktivering af STAT3 signalering kunne nedregulere Necdin ekspression. MCF7-celler udtrykker høje niveauer af Necdin (Fig 4C, bane 1 . 4), men når transient transficeret med v-Src eller STAT3-C i 48 timer, er Necdin proteinekspression inhiberes. Dette viser, at selv en transient 2 gange stigning i STAT3-aktivering i disse celler er tilstrækkelig til effektivt at undertrykke ekspressionen af ​​Necdin. (Fig 4C, bane 3 . 6)

Discussion

den transkriptionelle profil af en celle, der udtrykker konstitutivt aktive STAT3 forudsiges at være meget anderledes i forhold til en celle, hvor STAT3 er under tæt regulering. Vores indledende hypotese var, at STAT3 fremmer omfattende ændringer i de globale genekspressionsmønstre, herunder både direkte og indirekte mål. Vi tog en bred tilgang ved at studere globale genekspression ændringer ved hjælp microarray analyse i celler, der udtrykker konstitutivt aktiveret STAT3.