PLoS ONE: Lang-kodende RNA-EBIC Fremmer Tumor Cell Invasion ved binding til EZH2 og undertrykker E-Cadherin i cervikal Cancer

Abstrakt

I de senere år lange kodende RNA (lncRNAs) har vist sig at spille nøgle roller i tumorgenese. Men bidragene fra lncRNAs til livmoderhalskræft (CC) er stadig stort set ukendt. I denne undersøgelse differentielt udtrykt lncRNAs og mRNA’er i livmoderhalskræft og parrede peritumorale væv blev detekteret ved transkriptom microarray analyse. Vi fandt 708 probesæt af lncRNAs steg og 836 probesæt faldt i CC væv, mens 1288 mRNA differential probesæt steg og 901 mRNA probesæt faldet. Resultaterne blev valideret ved kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (qPCR). Derefter fandt vi en specifik differentielt udtrykt lncRNA fysisk kan binde til forstærker af Zeste homolog2 (EZH2) ved anvendelse af RNA immunfældning. Vi kaldte det som EZH2-bindende lncRNA i livmoderhalskræft [lncRNA-EBIC]. Sårheling assays og Matrigel invasion assays blev anvendt til at bestemme funktionen af ​​dette lncRNA ved silencing den. Vi observerede, at migration og invasion af livmoderhalskræft celler

in vitro

blev hæmmet ved undertrykkelse af lncRNA-EBIC af siRNA. Vi fandt også, at sammenhængen mellem lncRNA-EBIC og EZH2 var påkrævet for undertrykkelsen af ​​E-cadherin, som var en vigtig molekylær i metastaser af livmoderhalskræft.

Konklusion

Disse resultater viste at lncRNA-EBIC var et onkogent lncRNA, som kunne fremme tumor celle invasion i CC ved binding til EZH2 og hæmmende E-cadherinekspression

Henvisning:. Sun Nx, Ye C, Zhao Q, Zhang Q, Xu C Wang Sb, et al. (2014) Lang-kodende RNA-EBIC Fremmer Tumor Cell Invasion ved binding til EZH2 og undertrykker E-Cadherin i livmoderhalskræft. PLoS ONE 9 (7): e100340. doi: 10,1371 /journal.pone.0100340

Redaktør: Vinod Scaria, CSIR Institute of Genomics og Integrativ Biologi, Indien

Modtaget: Januar 30, 2014, Accepteret: 26 maj 2014; Udgivet: 9 jul 2014

Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Nature Science Foundation of China (nr 81.272.213), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm, og Natural Science Foundation of Shanghai (13ZR1414300), http: //www. stcsm.gov.cn. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft (CC) er den anden mest almindeligt diagnosticeret kræft, og den tredje hyppigste årsag til kræft død hos kvinder [1]. Ca. 49.000 nye tilfælde af CC blev diagnosticeret og 275.000 kvinder blev dræbt i 2011, hvilket mest skete i udviklingslande [2], [3]. Ud over patogenesen af ​​persistente, højrisikogruppen humant papillomvirus (HPV) infektioner, behøver bidrag fra andre faktorer for udvikling og progression af denne malignitet at blive belyst.

For nylig nye beviser har vist, at epigenetiske mekanismer kan være nøglen til at indlede tumorigenese. Afbrydelse af epigenetisk kontrol af DNA methylering, RNA regulering, og histon modifikation, etc, hvilket resulterer i arvelige variation af gener uden en ændring i deres kodende sekvens, er udbredt i malignitet [4], [5]. Selvom undersøgelser af små ikke-kodende RNA har domineret området for RNA regulering i de seneste år [6], [7], en bred vifte af cellulære funktioner har også været forbundet med nogle nyligt beskrevne klasser af ikke-kodende RNA. En sådan klasse, lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs), er udskrift af mere end 200 nukleotider uden proteinkodende potentiale. Talrige rapporter har vist, at dets fejlagtig regulering har en funktionel rolle i forskellige typer af kræft [8]. For eksempel lncRNA-HEIH spiller en central rolle i cellecyklusregulering af hepatocellulære carcinomceller, og høj lncRNA-HEIH ekspression korrelerer med en forøget risiko for tilbagefald og reduceret samlet postoperativ overlevelsesraten [9]. Som lncRNAs dukker op som kritiske komponenter i kræft transkriptomet, er det rimeligt at forvente, at lncRNAs bidrager til udviklingen og progressionen af ​​livmoderhalskræft. Men undersøgelser af rolle lncRNAs i CC er meget foreløbige. Indtil nu kun én forskning har påvist forhøjede niveauer af afvigende lncRNA udtryk i cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) prøver, der repræsenterer mild, moderat og svær histopatologiske kvaliteter henholdsvis tyder på, at lncRNAs kan spille vigtige roller i udviklingen og progressionen af ​​forstadier til kræft eller karcinomer [10]. Men de overordnede patofysiologiske bidrag lncRNAs i CC stort set ukendt,.

En nylig undersøgelse har rapporteret, at en femtedel af alle menneskelige lncRNAs identificeret til dato er fysisk forbundet med Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2, bestående af histon H3 lysin 27 methylase EZH2, SUZ12 og EED), hvilket tyder på, at de kan have en generel rolle i rekruttering Polycomb koncerninterne proteiner til deres målgener og fører til transkriptionelle repression [11]. EZH2 (Enhancer af Zeste Homolog 2) er en vigtig komponent i PRC2, som er involveret i flere vigtige regulatoriske mekanismer som stamcelle differentiering, celledeling, cellecyklus, og onkogenese [12], [13]. Der er stadig flere beviser, EZH2 ofte overudtrykkes i mange former for cancertyper hos mennesket og kunne fremme celleproliferation, invasion, og tumor angiogenese [14] – [16]. Desuden har flere lncRNAs, såsom lncRNA-HEIH, H19 og hotair, er blevet vist at binde til fysisk EZH2 og spiller vigtige roller i modulering af cancer epigenome [9], [17], [18]. Baseret på disse resultater, vi hypotese, at nogle lncRNAs også kan spille en aktiv rolle i de maligne biologiske adfærd af CC ved at mediere og samarbejde med EZH2.

Så det bliver interessant at bestemme de biologiske funktioner lncRNAs i CC og om de fungerer til at rekruttere PCG-proteiner til at målrette gener. I denne undersøgelse gennem transkriptom microarray analyse, fandt vi en række lncRNAs op- eller nedreguleret i CC sammenlignet med parrede peritumorale væv. Vi yderligere identificeret en ny lncRNA som var opreguleret i CC og kunne fysisk binder til EZH2 og deltage i reguleringen af ​​migration og invasion af CC-cellelinjer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af specielle Udvalg om Etik for biomedicin Research af Anden Military Medical University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter til brug for deres vævsprøver i dette forskningsprojekt.

Patient karakteristika og vævsprøver

Tyve-otte par snap-frosne CC og parrede peritumorale væv var fås fra Shanghai Changzheng Hospital med informeret samtykke og godkendelse af institutionelle etiske komité. Kliniske vævsprøver blev verificeret som tumor eller ikke-tumor ved histopatologisk undersøgelse og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Patienternes egenskaber er anført i tabel S1.

Microarray og beregningsanalyse

Kort fortalt blev fem CC væv og fem parrede peritumorale væv (tabel S1) anvendes til at syntetisere dobbeltstrenget komplementær DNA ( cDNA) ved revers-transkription polymerasekædereaktion. Dobbeltstrenget cDNA blev hybridiseret til Lim Grant Humant transkriptom arrays (Affymetrix, USA) i overensstemmelse med producentens protokol, og Affymetrix® Expression Console Software (version 1.3.1) blev anvendt til microarray analyse. Rådata (CEL filer) blev normaliseret på udskrift niveau ved hjælp af robuste multi-gennemsnitsmetoden (RMA workflow). Median sammendrag af udskrift udtryk blev beregnet. Gene-niveau data repræsenteret gener fundet i Rfamdb, fRNAdb, Ensembl, Noncodedb, og RefSeq databaser. Under anvendelse af samme metode, repræsenteret exon-niveau data i fuld længde transkripter. Den tilfældige variansanalysemodel (RVM) t-test blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte gener mellem CC og peritumorale grupper, uden at øge antallet af falske positiver [19]. Vi valgte differentielt udtrykte gener ifølge RVM og falsk opdagelse sats (FDR) analyser, med en foruddefineret P-værdi tærskel på 0,05 [20]. Hierarkisk klyngedannelse (Cluster3.0) og TreeView analyse (Stanford University, USA) blev udført på grundlag af resultaterne af differentielt udtrykte gener. De microarray data omtales i denne artikel er blevet forelagt for National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgængelige gennem (GEO) Serie tiltrædelse nummer GSE55940 (https://www.ncbi.nim.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE55940).

data filtrering og etablering af et gen co-ekspression netværk

en forespørgsel udformning af Microsoft Office Access 2013 blev brugt til at overlappe forskelligt udtrykte gener med Livmoderhalskræft Gene Database (CCDB) ved gen-symbol. Co-udtryk netværksanalyse blev gennemført mellem generne af overlappende og differentierede lncRNAs at identificere gen interaktioner [21]. Co-ekspression netværk blev bygget efter det normaliserede signal intensitet af specifikke udtrykte gener. Først konstruerede vi netværket nabomatricen som tidligere beskrevet [22]. For det andet vi beregnet Pearson korrelation for hvert par af gener og valgte de fremtrædende parvise korrelationer til at konstruere netværket. For at gøre en visuel repræsentation, blev kun de gener med den stærkeste interaktion (0,865 eller højere) valgt. I netværket analyse, en grad er den vigtigste parameter for den centrale placering af et gen i et netværk, som bestemmer den relative vigtighed. Degree centrale er defineret som antallet af links én node har til en anden. At udforske graden forskel på visse hub gener og naboer mellem kræft og peritumorale grupper | diffK | blev introduceret til analysen. Den | diffK | er lig med forskellen i de standardiserede grader af hub gener i 2 grupper og foreslår, at navet genet kan have en stærkere evne til regulering i kræft eller peritumoral region.

Cell kultur

Menneskelig livmoderhalskræft cellelinjer (HeLa, SiHa, CaSki) blev købt fra Shanghai Institute of Life Sciences Cell Resource center, Shanghai, Kina. Alle cellelinier blev dyrket i DMEM-medium (Gibco, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin (Biowest, Frankrig). Normale cervikale væv blev opnået fra præmenopausale kvinder, som gennemgik hysterektomi på grund af myom eller adenomyoma ved Institut for Obstetrik og Gynækologi ved Shanghai Changzheng Hospital. Primære cervikale epitelceller blev spaltet fra væv ved DispaseII (Roche, Schweiz) og trypsin-EDTA-opløsning (Biowest, Frankrig) og blev opretholdt i keratinocyt-SFM (Gibco, USA). Alle cellekulturer blev opretholde ved 37 ° C i en CO 5%

2, fugtig inkubator.

Kvantitativ realtids-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra frosne tumorprøver og celle linjer ved hjælp Trizol-reagens (Invitrogen, USA) og revers-transkriberet under anvendelse af tilfældige primere og en M-MLV revers transkriptase (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Ekspressionen af ​​filtrerede lncRNAs og associerede kodende gener blev målt ved TaqMan probe kvantitativ realtids-PCR (qPCR) under anvendelse Premix Ex Taq (TakaraBio, Japan) på et Applied Biosystems StepOne Real Time PCR-system (Applied Biosystems, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner . H18S blev anvendt som en indre standard, og hver prøve blev analyseret tredobbelt. Relativ genekspression (fold ændring) blev beregnet ved anvendelse af 2

– △△ Ct metode. Proberne og tilsvarende primere i denne undersøgelse blev designet og syntetiseret ved GenePharma (Shanghai, Kina). Sekvenserne af primere og prober i qPCR er anført i tabel S2. Primerne af U6 designet og syntetiseret af RiboBio (Guangzhou, Kina) .De sekvenser af primere leveres ikke af selskabet.

RNA immunoprecipitation

Nuklear og Cytoplasmisk Protein Extraction Kit (Beyotime, Kina) kombineret med RNA-bindende protein Immunopræcipitation Kit (Millipore, USA) blev anvendt ved udførelse af RIP eksperiment ifølge producentens anvisninger. Den EZH2 antistof, der anvendes til RIP er D2C9 (Cell Signaling Technology, USA). Co-præcipiterede RNA’er blev detekteret ved revers-transkription-PCR (RT-PCR), agarosegelelektroforese (AGE) og qPCR. Total RNA (input kontrol) og kontroller blev også analyseret for at vise, at de påviste signaler var fra RNA’er specifikt binder til EZH2. De genspecifikke primere anvendt i RIP forsøg er vist i tabel S2.

siRNA transfektion

HeLa og SiHa-celler blev udpladet i en 6-brønds plade i antibiotikum-frit vækstmedium suppleret med 10 % FBS og dyrket indtil 50-70% sammenflydende. SiRNA’er blev blandet med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) i reduceret serummedium (Opti-MEM, Gibco, USA) ifølge producentens anvisninger. Transfektion blev udført i 48 timer, efterfulgt af høst af behandlede celler for yderligere undersøgelser. siRNA’er designet og syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina). De siRNA sekvenser af lncRNA-EBIC, EZH2 og negativ kontrol anvendt i denne undersøgelse er anført i tabel S2.

Sårheling assay

For at udføre sårheling assay, celler blev podet på 6- godt plader og transficeret i 48 h med enten lncRNA-EBIC siRNA eller negativ kontrol siRNA, efterfulgt af skabelsen af ​​en kunstig, homogen ridse sår på en sammenflydende monolag kultur af HeLa og CaSki celler med et 200-pi pipettespids. Serumfrit medium blev tilsat i yderligere 24 timers inkubation, og cellerne blev afbildet ved 3 forskellige tidspunkter (0, 12, og 36 h) under anvendelse af et omvendt mikroskop. Procent af sårlukning blev beregnet med Image J 1.47 software. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

Matrigel invasion assay

Matrigel invasion assays blev udført tre gange ved anvendelse af Transwell

® permeable understøtninger (Corning, USA) i overensstemmelse med producentens protokol. Kort beskrevet blev celler transficeret med enten lncRNA-EBIC siRNA eller negativ kontrol siRNA i 48 timer som beskrevet ovenfor, efterfulgt af udpladning på en Matrigel-coatede membran i det øvre kammer af en 24-brønds indsætte (8 um porestørrelse) indeholdende serumfrit medier. Bundkammeret indeholdt DMEM medier med 10% FBS. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2 i 48 timer efter udpladning, hvorefter bunden af ​​kammeret insertet blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Celler, der forblev i det øverste kammer blev fjernet med en vatpind. Antallet af celler, der invaderede gennem membranen blev bestemt ud fra digitale billeder taget på et omvendt mikroskop og beregnet med Image J 1.47 software.

Western blot-analyse

Celler blev høstet i RIPA-lysepuffer ( Beyotime, Kina). Lige store mængder protein blev separeret ved SDS-PAGE og overført til polyvinyliden fluorid membraner (Millipore, USA). Membranerne blev blokeret i phosphatbufret saltvand /Tween-20 indeholdende 5% fedtfri mælk og inkuberet med antistof for EZH2 (Cell Signaling Technology, USA) eller β-actin (Santa Cruz bioteknologi). Derefter blev membranerne inkuberet med HRP-mærket IgG (KPL, USA) og detekteres under anvendelse af en Epson Perfection V300 Photo Scanner (Epson, Japan). Kvantitativ analyse blev udført ved anvendelse AlphaEase FC software (Alpha Innotech, USA). Protein niveauer blev normaliseret til p-actin.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 18.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL) og GraphPad Prism 5.0-software. Numeriske data blev præsenteret som midler og standardfejl. Forskelle mellem andele blev evalueret af parrede eller uparrede t-test. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

lncRNA og mRNA udtryk profiler i CC

Fem CC og parrede peritumorale væv blev analyseret for potentielle transkriptom ændringer i CC. under anvendelse af en Affymetrix Lim Grant Humant Transkriptomet array. Hierarkisk klyngedannelse viste systematiske variationer i ekspressionen af ​​lncRNAs og mRNA mellem CC og parret peritumorale væv. Sammenlignet med parrede peritumorale væv, 708 probesæt af lncRNAs steg og 836 probesæt faldt i CC væv (figur 1A), mens 1288 mRNA differential probesæt øget og 901 mRNA probesæt faldt (figur 1B).

Brug zonekort hierarkisk clustering analyse identificerede vi 1544 lncRNAs (A) og 2189 mRNA (B), der var differentielt udtrykte i CC væv, men ikke i de parrede peritumorale væv (c, kræftvæv; p, peritumorale væv; P 0,05). Opregulering eller nedregulering er repræsenteret som rød eller grøn, henholdsvis.

Gene co-ekspression netværk og kandidatlande lncRNAs

En RVM t-test blev anvendt til at identificere nummeret af differentielt udtrykt lncRNAs og mRNA fra microarray analyse af CC og parrede peritumorale væv. For at filtrere data, vi først overlappede differentiale udtryk mRNA med Livmoderhalskræft Gene Database (CCDB.) Vi bestemt 12 nedreguleret og 48 opreguleret mRNA (Tabel S3), herunder APOD, ESR1, MMP1, PCNA, og EZH2, etc. Co-ekspression netværk analyse blev udført mellem de 60 filtrerede mRNA og 1545 differentielt udtrykte lncRNAs. Netværket struktur CC (figur 2A) og peritumorale (figur 2B) vævsprøver var markant anderledes, implyapp: addword: antyde, at co-ekspression mønstre af mRNA og lncRNAs mellem CC og parrede peritumorale væv er forskellige. Nylige undersøgelser har vist, at oncoproteiner E7 af højrisiko-HPV 16 kunne aktiv udtryk for EZH2 på transkriptionel niveau, der bidrog til spredning og apoptotiske modstand CC celler [23]. Desuden EZH2 er overudtrykt i CC væv og den høje ekspression korrelerer signifikant med aggressivitet [24]. For nylig har undersøgelser antydet, at deregulerede lncRNAs kan have en generel rolle ved fremkaldelse af genom-dækkende re-targeting af PRC2 som vil resultere i afvigende ekspression af gener, i sidste ende føre til cancer eller andre sygdomme [11], [18]. Således valgte vi EZH2, en kerne underenhed af PRC2, til påvisning af potentielle lncRNAs involveret i CC, fordi det præsenteres som en hub node med høj grad centralitet. Elleve mRNA og ni lncRNAs (TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485, og ASK00420 (tabel S4), at tæt interageret med EZH2 (interaktion ≥0.865) blev valgt fra EZH2 undernet co-ekspression netværk af peritumoral gruppe.

En visning af lncRNA-mRNA netværk til 60 filtrerede mRNA og 1545 differentielt udtrykte lncRNAs i CC (A) og parrede peritumorale væv (B) er vist. opreguleret RNA er vist i rød, og ned-regulerede RNA er vist i blåt. noder med en grøn ring repræsenterer lncRNAs. Nodes uden en grøn ring repræsentere mRNA. Node størrelse repræsenterer graden centrale.

Validering af kandidaten lncRNAs i CC væv og cellelinjer

for at validere microarray data, vi først analyseret TI17313, TI13831, TI10124, TI18382, TI21327, TI18318, TI22687, TI09485, og ASK00420 udtryk i 23 parrede CC og peritumorale prøver ved hjælp QRT -PCR. resultaterne viste, at ekspressionen af ​​disse lncRNAs enten blev forøget eller formindsket i CC væv sammenlignet med parrede peritumorale væv (figur 3A) og var i overensstemmelse med de microarray resultater. LncRNA ekspression blev derefter analyseret i CC-celler og normale, primære cervikale epitelceller på samme måde. Niveauerne af TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 blev forøget i 3 cancer cellelinier (HeLa, SiHa og CaSki) sammenlignet med normale, primære cervikale epitelceller (figur 3B). Ekspression af de 5 andre lncRNAs var under niveauet for påvisning i dyrkede celler (data ikke vist). Under hensyn til udtryk og forskellen på kandidat lncRNAs i væv og celler, valgte vi TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 til yderligere undersøgelse.

Ni kandidat lncRNAs blev valideret i 23 parrede CC og peritumorale vævsprøver hjælp QRT -PCR (A). Ekspressionsniveauer af TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 i CC-cellelinjer i forhold til niveauerne i normale, primære cervikale epitelceller (B) er vist. * P 0,05, ** P. 0,01

lncRNA-TI17313 var forbundet med EZH2

For at undersøge om der er en fysisk interaktion mellem de fire kandidatlande lncRNAs og EZH2, RIP blev udført ved anvendelse af en EZH2 antistof og nukleare ekstrakter af HeLa og SiHa-celler. Vi observerede, at kun TI17313 beriget signifikant med EZH2 antistof sammenlignet med IgG (kontrol-antistof) (figur 4A, 4B), og der var ingen berigelse ofβ-actin og TI13831 (kontrol-RNA) (figur 4C). Endvidere at bestemme den intracellulære lokalisering af TI17313, vi adskilt cytoplasmatisk og nuklear RNA fra HeLa-celler ved cytoplasmatisk Nuclear RNA Purification Kit (Norgen Biotek, Canada) effektivt. Så RT-PCR og AGE viste, at udskrift af TI17313 primært var placeret i kernen af ​​CC-celler (Figur S1). Disse data foreslået en sammenhæng mellem TI17313 og EZH2; vi derfor betegnes TI17313 som EZH2-bindende lncRNA i livmoderhalskræft (lncRNA-EBIC).

(A, B) RIP forsøg blev udført i SiHa og HeLa-celler under anvendelse af EZH2 antistof (Ab) til at immunpræcipitere og specifik primere til at opdage TI17313, TI13831, TI10124, og TI18318 henholdsvis og relative berigelser vises. * P 0,05. (C) RIP blev udført eksperimenter ved hjælp af EZH2 antistof (Ab) til at immunpræcipitere en primer til at opdage β-actin og TI13831.

lncRNA-EBIC lyddæmpning forringet CC celle migration og invasion in vitro

for at vurdere virkningerne af lncRNA-EBIC på cellulær adfærd blev CC cellelinjer behandlet med siRNA til tavshed lncRNA-EBIC signalering. lncRNA-EBIC niveauer blev signifikant reduceret i HeLa og SiHa celler behandlet med siRNA (figur 5A). Cell-Counting Kit-8 assays og Annexin V-FITC flowcytometri analyse blev udført, og celledeling og apoptose blev ikke åbenbart påvirket af nedregulering af lncRNA-EBIC (data ikke vist). En sårhelende migration assay bestemmes, at siRNA-medieret lncRNA-EBIC lyddæmpning forringet CC cellemigration

in vitro

(figur 5B). En Matrigel invasion assay viste nedsat invasion gennem matrigel i lncRNA-EBIC tavshed celler i forhold til kontrol (figur 5C). Disse data antyder, at lncRNA-EBIC positivt regulerer migration og invasion af CC-celler.

LncRNA-EBIC niveauer signifikant reduceret i HeLa og SiHa celler behandlet med lncRNA-EBIC siRNA (A). Sårheling (B) og Matrigel invasion assays (C) viste, at motilitet og invasion af HeLa og SiHa-celler blev svækket ved behandling med lncRNA-EBIC siRNA sammenlignet med mock og negativ kontrol. Cellulære profiler er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. Statistiske analyser er vist som højre paneler henholdsvis. * P. 0,05

lncRNA-EBIC forbundet med EZH2 undertrykt ekspression af E-cadherin

Afbrydelse af celle-celle vedhæftning og ned-reguleret E-cadherin er de indledende faser af tumorinvasion. Stigende bevis har vist, at E-cadherin ekspression undertrykkes i cancer og reduceret ekspression er blevet forbundet med metastase. Desuden har undersøgelser vist, at EZH2 kunne mediere transkriptionel lyddæmpning af E-cadherin ved trimethylation af H3 lysin 27 [18], [25]. Således har vi spekuleret på, at sammenhængen mellem lncRNA-EBIC og EZH2 efterfølgende kan resultere i et fald i E-cadherin udtryk for at fremme CC celle invasion. For at teste det, vi undersøgte ændringerne i E-cadherin-mRNA og protein ekspressionsniveauer i lncRNA-EBIC siRNA transficerede HeLa og SiHa-celler. Vi fandt, at lncRNA-EBIC siRNA behandling kan øge ekspressionsniveauerne af E-cadherin i mRNA og protein, der forlader EZH2 ekspression uændret (figur 6A, 6B). Dernæst blev EZH2 siRNA kombineret med lncRNA-EBIC eller NC siRNA anvendes til transfektion CC celler henholdsvis og vi yderligere observeret, at E-cadherin ekspressionsniveauerne også blev forøget i begge grupper (Figur 6C). Effektiviteten af ​​EZH2 siRNA er vist i figur S2. Disse data antydede, at lncRNA-EBIC kunne hæmme E-cadherin ved at associere med EZH2, og lncRNA-EBIC kunne fungere som formidler rekruttere EZH2 til promotorområdet af E-cadherin. lncRNA-EBIC og EZH2 kan være to indbyrdes afhængige komponenter i H3K27me3 processen.

I mellemtiden blev western blot analyse af EZH2 og E-cadherin udført i CC celler behandlet med siRNA (A, B, højre panel). Analyse af E-cadherin-mRNA og protein niveauer blev udført i CC celler behandlet med EZH2 siRNA + lncRNA-EBIC siRNA eller EZH2 siRNA + negativ kontrol. * P. 0,05

Discussion

hele genomet transkriptom undersøgelser viste, at næsten 10 til 20 gange mere genomiske sekvens transkriberes til lncRNA end til protein-kodende RNA. Finde nye molekyler og mekanismer kunne belyse kompleksiteten i forskellige biologiske processer, herunder cellulære udvikling og menneskelige sygdomme [26], [27].

Stigende beviser i de seneste år har vist, at afvigende lncRNA udtryk fremstår som en vigtig del af kræft transkriptomet. Men den samlede patofysiologiske bidrag lncRNAs til initiering og progression af CC er stadig stort set ukendt. For nylig, en bølge af undersøgelser afslører, at lncRNAs er vigtige cis- /trans-regulatorer af gen-aktivitet, hvilket betyder, de fleste lncRNAs kan inddrage i reguleringen af ​​genekspression [28]. Således co-ekspression netværk mellem lncRNAs og mRNA’er er en væsentlig tilgang til at studere de potentielle funktioner lncRNAs. At udforske rolle lncRNAs i livmoderhalskræft, vi først brugt en transkriptom microarray at evaluere lncRNA og mRNA udtryk profiler i CC og parret peritumorale væv. Microarray kombineret med gen-co-ekspression analyse afslørede et sæt differentielt udtrykte lncRNAs og mRNA.

EZH2, et centralt element i PCR2, er en afgørende enzym i histon modifikation, der spiller en central rolle i katalyse H3K27me3, hvilket resulterer i transkriptionel silencing af målgener [29]. For eksempel har undersøgelser antydet, at EZH2 kan inhibere E-cadherin ekspression gennem denne methylering, hvilket øger cancer invasionsevne og metastase [4], [14]. Men relativt lidt om hvordan EZH2 rekrutteres til at målrette gener [30]. For nylig har nogle undersøgelser vist, at lncRNAs har evnen til at rekruttere PRC2 at målrette loci i pattedyr via EZH2. For eksempel kan hotair inducere PRC2 at lokalisere med beslægtede promotorer, hvilket fører til epigenetisk inaktivering af metastase suppressor gener i brystcancer [18]. For et andet eksempel kan lncRNA H19 inhibere E-cadherin ekspression ved transkriptionel repression af promotoren ved berigelse af EZH2 [17].

Med hensyn til CC, nogle tidligere undersøgelser viste også, at overekspression af EZH2 er forbundet med aggressivitet og ondartet progression af CC [23], [24]. Som vores mikroarray viste, ekspressionsniveauet af EZH2 blev opreguleret i tumorvæv og præsenteret som en hub node med høj grad centralitet. Således valgte vi EZH2 til påvisning af potentielle lncRNAs involveret i CC. Ifølge gen co-ekspression analyse, vi bestemt 9 kandidatlande lncRNAs der tæt interageret med EZH2.

I disse kandidat lncRNAs, fandt vi, at lncRNA-TI17313 ekspressionsniveauerne blev forøget betydeligt i CC væv og cellelinier. TI17313 er en 1201bp i længden ikke-kodende RNA transskriberet fra et forarbejdet pseudogen ligger i kromosom 16q og kodet RP11-144N1.1 (Ensembl udgave ENSG00000262904). Ligesom med de fleste lncRNAs, TI17313 viser også lavere bevaring mellem arterne. Dens sekvens sparer kun blandt primater (https://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Location/Compara_Alignments?align = 654 db = vega g = OTTHUMG00000177355 r = 16% 3A74701404-74702604 t = OTTHUMT00000436401). Endvidere undersøgte vi funktion og mekanismer af denne kandidat lncRNA. RIP viste en fysisk interaktion mellem lncRNA-TI17313 med EZH2; derfor, vi hedder lncRNA-TI17313 som lncRNA-EBIC. Efterfølgende viste tab-af-fuction assays at nedsat ekspression af lncRNA-EBIC inhiberede CC cellemigration og invasion in vitro. Disse undersøgelser antydet, at lncRNA-EBIC kan virke som en onkogen gennem samarbejde med EZH2. I mellemtiden, sammenslutningen af ​​lncRNA-EBIC med EZH2 også et tip til den komplicerede mekanisme EZH2 regulering.

Tumor migration og invasion er de vigtigste katalysatorer for sygelighed og dødelighed hos kræftpatienter. E-cadherin er et tumorsuppressorgen, der spiller en kritisk rolle i ondartet udvikling af epiteliale tumorer og hæmmer epitelial til mesenkymale overgang [31]. CC ofte præsenterer med reduceret ekspression af E-cadherin og er associeret med HPV-oncoproteiner E6 og E7 [32]. Over-ekspression af EZH2 er blevet rapporteret at formindske niveauet af E-cadherin genekspression gennem H3K27me3 i E-cadherin promotoren [4], [14]. I vores undersøgelse fandt vi, at nedregulering af lncRNA-EBIC kunne øge ekspressionsniveauerne af E-cadherin. I mellemtiden, faldende EZH2 udtryk niveau, men forlader lncRNA-EBIC uændret også kunne fremme E-cadherin udtryk.

Fordi der er ingen eksplicitte oplysninger om transskription start /terminal steder og fuld-længde sekvens af lncRNA-EBIC, vi er i øjeblikket ikke til rådighed til at udføre gain-of-funktion lncRNA-EBIC og undersøge mulighederne mekanisme nærmere. Men sammenslutningen af ​​lncRNA-EBIC med EZH2 foreslog en rolle lncRNA-EBIC i epigenetiske kontrol af genekspression. Mere vigtigt, i denne forskning, vi først afslørede differencially udtrykte lncRNAs i CC. Blandt disse kandidat lncRNAs, viste vi, at en opreguleret lncRNA i CC væv og celler var forbundet med EZH2, betegnes lncRNA-EBIC. lncRNA-EBIC kunne fremme invasion CC celler ved at associere med EZH2 og efterfølgende undertrykke E-cadherin udtryk, hvilket tyder på, at lncRNA-EBIC kunne fungere som formidler rekruttere EZH2 at målrette gener. Således er vores resultater tyder en vigtig rolle for epigenetiske mekanismer i livmoderhalsen CC patogenese. En bedre forståelse af den rolle, lncRNAs i modulere epigenetiske aktivitet vil give flere mål for anticancer-terapi, og derfor er lovende for individualiseret behandling af livmoderhalskræft kræftpatienter.

Støtte oplysninger

figur S1.

For at bestemme den intracellulære lokalisering af lncRNA-EBIC, cytoplasmatisk