PLoS ONE: Nestin er en uafhængig Predictor of Cancer-specifikke Overlevelse efter Radikal Cystectomy i patienter med urothelial karcinom i blæren

Abstrakt

Mål

For at undersøge sammenhængen mellem udtryk for nestin, en klasse VI mellemliggende filament protein, og patologiske træk eller overlevelse hos patienter med urothelial karcinom i blæren (UCB) .

Metoder

Nestin udtryk i tumorceller blev immunhistokemisk undersøgt i 93 patienter med UCB, som gennemgik radikal cystektomi med bækken lymphadenectomy. De foreninger med clinicopathologic parametre blev evalueret. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Cox proportional hazards modeller blev anvendt til at estimere effekten af ​​nestin udtryk på overlevelse.

Resultater

Nestin udtryk i cystektomi prøver blev observeret i 13 ud af 93 patienter (14,0% ). Nestin ekspression blev associeret med patologisk tumor fase (p = 0,006). Nestin-negative patienter havde bedre samlet overlevelse sammenlignet med nestin-positive patienter (log-rank p = 0,0148). Univariable analyse viste, at nestin udtryk, lymphovascular invasion, og lymfeknude-status signifikant var forbundet med cancer-specifik overlevelse (hazard ratio, 2,78, 2,15 og 2,80, henholdsvis). På multivariabel analyse, nestin udtryk og lymfeknude status var uafhængige prognostiske faktorer i kræft-specifikke overlevelse (hazard ratio, 2,45 og 2,65, henholdsvis).

Konklusioner

Resultaterne antyder, at nestin udtryk er en roman uafhængig prognostisk indikator for patienter med UCB og et potentielt nyttig markør for at vælge patienter, der kan være kandidater til adjuverende kemoterapi

Henvisning:. Tabata Ki, Matsumoto K, Minami S, Ishii D, Nishi M, Fujita T et al. (2014) Nestin er en uafhængig Predictor of Cancer-specifikke Overlevelse efter Radikal Cystectomy i patienter med urothelial Carcinoma af blæren. PLoS ONE 9 (5): e91548. doi: 10,1371 /journal.pone.0091548

Redaktør: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: Juni 15, 2013; Accepteret: 12. februar 2014 Udgivet: Maj 2, 2014

Copyright: © 2014 Tabata et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Grant-in-Aid for tredje periode Omfattende Kontrol Research for Cancer foretaget af Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd Japan og All Kitasato Project Study (21-1) fra Kitasato Universitet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

urotelial carcinom i blæren (UCB) er den anden mest almindelige malignitet og er en af ​​de førende årsager til dødsfald hos patienter med urogenitale kanal maligniteter [1]. Selv om de fleste patienter til stede med overfladiske UCB, ca. 50% til 70% af disse tilfælde er tilbagevendende; 10% til 15% af disse tilbagevendende tumorer fortsætte til både muskel invasion og lokal udvidelse, som er almindeligt behandles med radikal cystektomi [2]. For patienter med muskel-invasiv og refraktær non-muskel-invasiv UCB, standard behandling er radikal cystektomi. Trods fremskridt i kirurgiske teknikker og perioperativ kemoterapi, er den samlede 10-års sygdomsspecifikke overlevelse efter radikal cystektomi uændret i de seneste årtier [3], [4]. Selvom de nuværende kliniske og patologiske variabler give vigtige prognostisk information i blærekræft, har de begrænset evner til at forudsige tumor recidiv eller progression og patient overlevelse.

Nestin er en klasse VI cytoskelet mellemliggende filament protein, som udtrykkes i prolifererende celler under udviklingstrin i en række embryonale og føtale væv [5]. Som reaktion på skade, det centrale nervesystem, skeletmuskel og lever kan også udtrykke nestin [6], [7]. Nestin ekspression i tumorer blev oprindeligt rapporteret i nervesystemet maligniteter, såsom astrocytomer, glioblastomer, og schwannomer [8], [9]. For nylig har flere undersøgelser rapporteret, at nestin også udtrykkes i andre faste karcinomer [10] – [12]. I kræft i bugspytkirtlen, nestin udtryk korrelerer med nerve og stromale invasion [10]. Wolfman et al fastslået, at nestin er en kritisk bestanddel af en hidtil ukendt metastase vej hos prostatacancer [11]. For nylig Ryuge et al viste, at nestin ekspression er associeret med en dårligere prognose og er en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse i patienter med ikke-småcellet lungecancer [12]. Sammenhængen mellem nestin udtryk og kliniske resultater hos patienter med cancer gradvist afklaret.

I denne undersøgelse har vi fokuseret på forholdet mellem nestin ekspressionsniveauerne og clinicopathologic funktioner og overlevelse hos patienter med UCB efter radikal cystektomi.

Materialer og metoder

Patient befolkning

Mellem marts 1990 november 2006 133 konsekutive patienter med UCB, som gennemgik radikal cystektomi med bækken og iliaca lymphadenectomy på Kitasato Universitetshospital blev inkluderet i denne undersøgelse. Nitten patienter, der fik præoperativ neoadjuvansterapi, herunder enten stråling eller kemoterapi, 14 patienter, der blev tabt til opfølgning, og 7 patienter med anden type histologi, inklusive adenocarcinom, pladecellecarcinom, småcellet carcinom og sarcom, blev ekskluderet fra yderligere analyse. Ingen patienter havde fjernmetastaser på tidspunktet for cystektomi. Af de resterende 93 patienter, de 71 (76,3%) mænd og 22 (23,7%) kvinder havde en gennemsnitsalder på 64 år (range, 40-81, middelværdi, 62,5).

Indikationerne for cystektomi i patienter med initial Ta, T1, eller Tis UCB inkluderet intravesikal terapi svigt (

n

= 14), aggressive histopatologiske funktioner (high-grade tumorer, carcinoma in situ [CIS], multifokal omfattende sygdom;

n

= 5), eller progression af muskel-invasiv cancer (

n

= 13). Sixty-én patienter gennemgik cystektomi for en indledende præsentation af muskel-invasiv sygdom.

2002 tumor /node /metastaser klassifikation blev brugt til patologisk iscenesættelse, og WHO klassifikation blev brugt til patologisk sortering. Lymphovascular invasion bestemmes tilstedeværelsen af ​​kræftceller i endotel plads. Kræftceller, der blot invaderede en vaskulære lumen blev anset negativ. Formalin-fikseret, paraffinindlejrede blokke, der repræsenterer de mest invasive områder af hver tumor blev indsamlet til yderligere undersøgelse. Den mediane opfølgning var 38,4 måneder (interval, 1,1-253,7, middelværdi, 64,6) for patienter, der var i live ved sidste opfølgning. Når patienter døde, blev dødsårsagen bestemt af behandlende læger, diagram gennemgang bekræftes af dødsattester, eller dødsattester alene. Obduktion eksemplarer af blære urothelium fra 38 patienter uden nogen patologiske fund, der tyder på malignitet tjente som kontrol

Etiske udsagn

Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité af Kitasato Universitetshospital (Godkendt nummer.; C-09-504). Vi har fået skriftligt informeret samtykke fra alle undersøgelsens deltagere.

Immunhistokemi og scorer

Sektioner (3 um tyk) blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i en nedadgående ethanol serie, og derefter behandlet med 3% hydrogenperoxid i 10 min. Efter blokering med 0,5% casein i 10 minutter blev snittene omsat med 100 gange fortyndet anti-nestin polyklonale antistof (IBL, Takasaki, Japan) i 2 timer ved stuetemperatur. Specificiteten af ​​dette antistof blev beskrevet tidligere [12]. Efter skylning i Tris-bufret saltvand (TBS; 0,01 M Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl) 3 gange i 5 minutter hver, blev snittene omsat med Histofine Simple Stain MAX-PO (MULTI; Nichirei, Tokyo, Japan) i 30 min ved stuetemperatur. Snittene blev visualiseret efterfølgende med stabil DAB-opløsning (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og modfarvet med Mayer hematoxylin. Batch negative kontroller anvendes TBS. Alle objektglas blev revideret af to efterforskere (K.M. og Y. S.), der var blindet med hensyn til de kliniske og patologiske data. Cytoplasmatisk immunfarvning i tumorceller angivet positivitet for nestin. Den stainability af peritumorale vaskulære endotelceller blev anvendt som en intern positiv kontrol. Nestin blev scoret af tilsætning af procentdelen af ​​positive tumorceller og farvningsintensitet. Procentdelen af ​​tumorceller blev scoret som 0 (0%), 1+ (1-25%), 2+ (26-50%), 3+ (51-75%), og 4+ (75-100%) . Farvningsintensitet blev også scoret som 1+ (svag) = svagere end endotelceller; 2+ (moderat) = det samme som endotelceller; 3+ (stærk) = stærkere end endotelceller. Gennemsnittet af procent-værdier opnået ved tredobbelte målinger blev anset for analyse. I en indledende undersøgelse vurderede vi det diskriminerende værdi af hver cutoff i summen indeks, der spænder fra 0 til 7, med hensyn til UCB kendetegn og prognose. Kaplan-Meier-analyser af serielle trin på summen indekset som et cutoff for positiv og negativ afslørede, at afskæring på 0 for positiv og negativ var den bedste diskriminatoren for UCB progression og overlevelse (data ikke vist). Ligeledes evaluering af sammenslutningen af ​​denne cutoff for nestin med kliniske og patologiske egenskaber viste, at 0 var den eneste cutoff at give statistisk signifikante fund (data ikke vist). Expression snesevis af nestin blev stratificeret yderligere i positiv (score ≥1) og negative (score 0) til præsentation.

Postoperative opfølgende

Hver patient var planlagt til at have en postoperativ opfølgning hver 4. måned i det første år, halvårligt i det andet år, og derefter årligt; hyppigere undersøgelser var planlagt, hvis klinisk indiceret. Enogtyve patienter (22,6%) fik adjuverende kemoterapi (methotrexat, vinblastin, Adriamycin, og cisplatin [MVAC] eller gemcitabin og cisplatin [GC]) efter operation for uønskede patologiske karakteristika, herunder regionale eller fjerne lymfeknudemetastaser eller extravesical engagement. Fyrre-tre patienter (46,2%) modtog MVAC eller GC for recidiv.

statistiske analyser

Til denne analyse, tumor patologisk stadium (≤pT2 vs. ≥pT3), kvalitet (grad 1 og 2 vs. grad 3), og lymfeknude-status (n0 vs. N1 og N2) blev evalueret som dikotomiseret variabler. Fisher eksakte test blev anvendt til at evaluere associationen mellem køn, patologisk stadium, patologisk kvalitet, CIS, lymfeknude-status, og lymphovascular invasion. Forskellen i alder mellem nestin udtryk og tab grupper blev testet af Mann-Whitney

U

test. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til beregning overlevelsesfunktioner, og forskelle blev vurderet med log-rank test. Multivariable overlevelse analyser blev udført med Cox proportionel risiko regressions model, kontrol for nestin udtryk, patologisk stadium og kvalitet, samtidig CIS, og lymfeknudemetastaser. Statistisk signifikans i denne undersøgelse blev sat til p 0,05. Alle rapporterede p-værdier er tosidede. Alle analyser blev udført med Stata version 11 til Windows (Stata, Chicago, IL, USA).

Resultater

Foreningen af ​​nestin udtryk med clinicopathologic egenskaber

Tabel 1 viser i oversigtsform kliniske og patologiske karakteristika 93 patienter, som gennemgik radikale cystektomi for UCB. Iscenesættelse viste, at en patient havde pTis, 2 havde PTA, 16 havde PT1, 21 havde pT2, 17 havde pT3a, 19 havde pT3b, og 17 havde pT4 sygdom. De korrelationer mellem nestin udtryk og clinicopathologic egenskaber er også angivet i tabel 1. Cytoplasmisk nestin udtryk i tumorceller blev observeret i 13 ud af 93 patienter (14,0%). Den positive rate for nestin var signifikant højere hos patienter med ≥pT3 end i ≤pT2 sygdom (p = 0,006). Figur 1A viste repræsentativt fotografi som nestin udtryk ikke blev observeret i tumorceller. Nestin havde cytoplasmatisk ekspression i tumorceller (figur 1b). Nestin ekspression blev også observeret i cytoplasmaet i vaskulære endotelceller og fibroblaster i tumor stroma i hvert tilfælde (figur 1A, B).

Fotografierne er repræsentative tumorceller der var negative (A) og positive (B) for nestin. Nestin udtryk blev også observeret i cytoplasmaet af vaskulære endotelceller og fibroblaster i tumor stroma i hvert tilfælde (figur 1A, B).

Forholdet mellem nestin udtryk og overlevelse i UCB

Inden for en median opfølgning på 38,4 måneder, 45 patienter (48,4%) havde sygdomstilbagefald, 41 (44,1%) døde af UCB, og 7 (7,5%) døde af andre årsager. Foreningen af ​​nestin udtryk med hastigheden af ​​progressionsfri overlevelse og kræft-specifikke overlevelse og samlet overlevelse blev analyseret ved hjælp af Kaplan-Meier analyse (figur 2A-C). Hastigheden for progressionsfri overlevelse i nestin-positive gruppe var signifikant dårligere end i nestin-negative gruppe (p = 0,0195, figur 2A). Markant fattigere satser for kræft-specifikke overlevelse og samlet overlevelse blev set i nestin-positive gruppe sammenlignet med den nestin-negative gruppe (p = 0,0051 og 0,0148, henholdsvis, 2B og C).

( A) Progressionsfri overlevelse; (B) kræft-specifik overlevelse; og (C) den samlede overlevelse.

Prognostiske konsekvenser af nestin udtryk i UCB

For at undersøge om nestin udtryk var en uafhængig prognostisk faktor for overlevelse af patienter med UCB, univariable og multivariable Cox regressions analyser blev anvendt. På univariable Cox regressionsanalyse, nestin udtryk, pT stadium, lymphovascular invasion, og lymfeknude status var signifikant associeret med recidiv, og nestin udtryk, lymphovascular invasion, og lymfeknude status var signifikant associeret med cancer-specifik overlevelse (Tabel 2). Modtagelse af kemoterapi efter cystektomi ikke positiv indflydelse kræftspecifikke overlevelse og progressionsfri overlevelse (data ikke vist). Ved at bruge multivariable Cox regressionsanalyse blev nestin udtryk fundet at være uafhængig prognostisk faktor for kræft-specifikke overlevelse, men marginal for recidiv (hazard ratio [HR] = 2.45 og p = 0,04; HR = 2,27; p = 0,06, henholdsvis; tabel 2). I denne multivariable analyse blev lymphovascular invasion udelukket som i en tidligere rapport [12], fordi at bestemme effekten af ​​nestin på tilbagefald eller overlevelse, kan lymphovascular invasion være en mellemliggende faktor i vejen for nestin-tilbagefald /overlevelse forhold.

diskussion

prognosen for de fleste patienter med fremskreden UCB er dårlig, selv efter tilstrækkeligt udført radikal cystektomi og bækken lymphadenectomy [13]. Med kirurgi alene, vil 40% til 90% af patienter med ≥pT3 sygdom har fjernmetastaser eller lokalt recidiv eller begge, og vil til sidst dø af sygdommen [4], [13]. Derfor bør det overvejes perioperativ yderligere behandling, herunder systemisk kemoterapi for patienter med høj risiko for tilbagefald, hvis berettiget baseret på den enkeltes tilstand. Men for at forfine den kliniske beslutningsproces i udvælgelsen af ​​yderligere perioperative behandling for avanceret UCB, klinikere brug molekylære markører i forbindelse med den biologiske og kliniske adfærd af disse tumorer. For eksempel kan patienter med en lav sandsynlighed for sygdomsprogression spares bivirkninger af unødvendig systemisk kemoterapi, mens dem med høj risiko for sygdomsprogression kan tilskyndes til at modtage systemisk kemoterapi. Således kunne molekylære markører foruden clinicopathologic funktioner være hjælp i individualiseret beslutningsproces med hensyn til adjuverende kemoterapi.

Den foreliggende undersøgelse præciseret, at nestin udtryk i tumorceller var forbundet med progressionsfri overlevelse, kræft-specifikke overlevelse, og samlet overlevelse af patienterne med UCB (figur 2A-C). Desuden er det i multivariabel Cox regressionsanalyse, nestin ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for cancer-specifik overlevelse (HR, 2,45; p = 0,04; Tabel 2). Selvom lymfeknude status var også en uafhængig prognostisk faktor for kræft-specifik overlevelse (HR, 3,59; p 0,001) og sygdom tilbagefald og (HR, 2,65; p = 0,006) i vores undersøgelse, lymfeknudeinvolvering som en selvstændig risikofaktor efter cystektomi for tilbagefald og overlevelse efter cystektomi blev allerede etableret i flere undersøgelser [14], [15]. Nestin udtryk i stromale celler blev observeret i alle tilfælde. Vi spekulerede at stromale celler alene ikke påvirker overlevelsen eller fornyet uden nestin-positive tumorceller, fordi stromacelle- rum spiller en afgørende rolle i tumorigenese og invasion ved at stimulere transformationen af ​​normale celler til at producere vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner, der kan aktive tumorceller. I mellemtiden blev lymphovascular invasion udelukket fra multivariable Cox regressionsanalyse i denne undersøgelse. Rolle lymphovascular invasion som prognostisk faktor for sygdomsprogression og overlevelse er kontroversiel. Tidlige studier identificeret lymphovascular invasion som en dårlig prognostiske funktioner [16], [17]. I andre undersøgelser, dog lymphovascular invasion var ikke en indikator for tilbagefald eller overlevelse [14], [18], [19]. Tidligere rapporter om bugspytkirtlen, prostata, og lungekræft afslørede, at nestin udtryk var vigtigt for migration og invasion kapaciteter af tumorceller, som efterfølgende resulterede i fattige prognoser [10] – [12]. Derfor blev lymphovascular invasion også betragtes som et mellemprodukt faktor i vejen for nestin-overlevelse /tilbagefald forhold i UCB. Forrige undersøgelse også udelukket vaskulær invasion, lymfe invasion, pleural invasion fra multivariable analyse, og dermed justere for dem kan undervurdere effekten af ​​nestin. Desuden patienter uden lymfeknude engagement og uden nestin udtryk viste forlænget progressionsfri overlevelse og cancer-specifik overlevelse (data ikke vist). Derfor nestin udtryk muligvis hjælper kliniske beslutningsproces i udvælgelsen af ​​yderligere behandling, selv hos patienter uden lymfeknude involvering ved cystektomi.

På den anden side, epiteliale tumorer er heterogene populationer af celler med meget varierende evner til at overleve , vokser, og metastaserer [20], [21]. Tidligere rapporter foreslog, at en sådan intratumoral heterogenitet skyldes genetiske og epigenetiske forskelle i tumorceller gennem selektivt pres under tumor evolution. For nylig ny dokumentation understøtter eksistensen af ​​et cellulært hierarki inden epiteliale tumorer. På toppen af ​​dette hierarki er en cancer stamcelle (CSC) population, som kan forny sig selv og differentiere til afkom celler, hvilket således resulterer i den observerede cellulære og funktionel heterogenitet epiteliale tumorer [22], [23]. CSCS er blevet isoleret fra leukæmi og flere solide tumorer [24], [25]. Disse celler kan ekspanderes in vitro som tumor kugler og er i stand til at reproducere den oprindelige tumor, når transplanteres ind immunsvækkede mus. Eksistensen af ​​CSCS har også for nylig blevet rapporteret i human UCB [26]. For nylig, nestin blev rapporteret som en af ​​formodede markører for CSCS i en række tumorer, herunder UCB [27], [28]. Tidligere rapporter foreslået, at svigt af cancerterapier kan skyldes deres lavere effekt på CSCS der bevarer deres fulde kapacitet til at gennemgå og genoprette tumorcellemassen. For nylig, fra dette koncept, CSC-målrettede behandlinger er blevet undersøgt i flere tumorer [29], [30]. Men manglen på pålidelige markører til identifikation af CSCS forhindrer udviklingen af ​​denne behandling. I denne henseende nestin er ikke kun en prognostisk faktor, men også kan udvide mulighederne for CSC-target behandling i UCB.

Denne undersøgelse har iboende begrænsninger for enhver retrospektiv dataindsamling. Prøven størrelse og variationer i opfølgning kan have begrænset vores evne til at detektere små forskelle. denne undersøgelse viste imidlertid, at positiv nestin ekspression er associeret med dårlig prognose og er en uafhængig prognostisk faktor for cancer-specifik overlevelse hos patienter med UCB efter radikal cystektomi. I fremtiden har vi brug for en validering af denne roman prognostisk markør ved hjælp større kohorte med langsigtede, prospektivt studie.

Konklusioner

Som konklusion, vi har vist, at nestin udtrykkes i en delmængde af UCB og dens udtryk er forbundet med clinicopathologic faktorer. Vi fandt, at nestin udtryk er en hidtil ukendt prognostisk indikator for ringe overlevelse for patienter med UCB efter cystektomi; men dens prognostisk betydning kræver stadig bekræftelse med større patientgrupper.