PLoS ONE: Mycoplasma fermentans hæmmer aktiviteten for Cellulær DNA-topoisomerase I ved aktivering af PARP1 og Ændrer Effektivitet af sin anti-kræft Inhibitor

Abstrakt

For at forstå virkningerne af samspillet mellem Mycoplasma og celler på vært cellulær funktion, er det vigtigt at belyse de påvirkninger af infektion af celler med Mycoplasma om nukleare enzymer, såsom DNA-topoisomerase type i (Topo i). Menneskelig Topo Jeg deltager i DNA transaktionsprocesser og er målet for anti-cancer medicin, de camptotheciner (katodestrålerør). Her undersøgte vi den mekanisme, hvormed infektion af humane tumorceller med

Mycoplasma fermentans

påvirker aktiviteten og ekspressionen af ​​cellulær Topo I og anti-cancer effekt af CPT. Humane cancerceller blev inficeret eller behandlet med levende eller lydbehandledes

M. fermentans

og aktiviteten og ekspressionen af ​​Topo jeg blev bestemt.

M. fermentans

signifikant reduceret (med 80%) Topo I-aktivitet i de inficerede /behandlede tumorceller uden at påvirke niveauet af Topo I-protein. Vi viser, at denne reduktion i enzymaktivitet skyldtes ADP-ribosylering af Topo I-protein af Poly-ADP-ribose-polymerase (PARP-1). Desuden blev pERK aktiveret som et resultat af induktionen af ​​MAPK signaltransduktionsvej af

M. fermentans

. Da PARP-1 viste sig at blive aktiveret af pERK, konkluderede vi, at

M. fermentans

modificerede den cellulære Topo I-aktivitet ved aktivering af PARP-I via induktion af MAPK signaltransduktionsvejen. Desuden infektion af tumorceller med

M. fermentans

formindskede den inhibitoriske virkning af CPT. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at ændring af Topo I-aktivitet af

M. fermentans

kan ændre cellulær genekspression og respons tumorceller at Topo I-inhibitorer, påvirke anti-cancer kapacitet på Topo I antagonister

Henvisning:. Afriat R, Horowitz S, Priel E (2013)

Mycoplasma fermentans

hæmmer aktiviteten for Cellulær DNA-topoisomerase i ved aktivering af PARP1 og Ændrer effektivitet af sin anti-Cancer Inhibitor. PLoS ONE 8 (8): e72377. doi: 10,1371 /journal.pone.0072377

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: April 2, 2013; Accepteret: 9 juli 2013; Udgivet: 27 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Afriat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var leveres af Seed Research fond, Ben-Gurion universitetet. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mycoplasmaer, der tilhører Mollicutes klasse, er de mindste selvreplikerende eubakterier, blottet for en cellevæg og kun omgivet af en plasmamembran. Deres lille genom størrelse (lige 580-1380 kb) resulterer i begrænsede metaboliske evner og parasitisme [1], [2]. Mycoplasmaer kan findes som parasitter i en lang række værter, herunder mennesker, dyr, insekter, planter og celler dyrket i vævskultur.

Hos mennesker er nogle Mycoplasmaarter fundet som kommensale indbyggere, mens andre blev vist at være forbundet med infektionssygdomme og efter infektion patologier [3], [4].

de fleste af de kendte Mycoplasma arter findes som membran overflade parasitter, og for nylig blev nogle vist at trænge ind i cellerne og blive intracellulære beboere [5].

Mycoplasma kan forårsage kroniske infektioner på grund af sofistikerede mekanismer for unddragelse fra immunovervågning (dvs. molekylær mimicry, en unik type antigen variation), opregulering eller nedregulering af cytokinsekretion, adhæsionsmolekyler udtryk, transkriptionsfaktorer udtryk, MAP kinaser aktivitet, apoptotiske veje, og mere [2], [3].

for nylig har mange rapporter kraftigt støttet evne Mycoplasma at forårsage eller fremme onkogen transformation [6 ] -. [9], og søgen efter sammenhængen mellem Mycoplasma og kræft i øjeblikket udforskes [10]

lipoproteiner (LPMf) af

Mycoplasma fermentans

, et humant patogen, var grundigt undersøgt i løbet af det sidste årti. LPMf blev vist sig at ændre funktionerne for immunsystemets celler ved at inducere ekspression af oncogener [1], der påvirker flere faktorer, der deltager i signaltransduktion proteiner [11] – [13], transkription [14], og den apoptotiske proces [11], [15], [16].

M. fermentans

blev vist at inhibere apoptose proces induceret af tumornekrosefaktor α (TNFa) [17], [18]. Alle disse førte til den antagelse, at infektion af tumorceller af Mycoplasma kan påvirke aktiviteten og ekspressionen af ​​essentielle nukleare enzymer såsom topoisomeraser, som er de mål for flere anticancerlægemidler og således interferere med anti-cancer virkning af disse lægemidler. DNA topoisomeraser er en familie af væsentlige nukleare enzymer, der er ansvarlig for at kontrollere topologiske tilstand DNA-molekyler. De deltager i de fleste DNA transaktioner, såsom replikation, transkription, rekombination, og chromatin remodeling [19] – [21]. DNA topoisomeraser klassificeres som enten type I (spalter én streng af DNA) eller type II (spalter to DNA-strenge). Begge enzym typer er yderligere inddelt i undergrupper efter strukturelle og funktionelle egenskaber. Medlemmer af hver familie af enzymer er forskellige i sekvens, struktur og funktioner [22].

Den katalytiske aktivitet af DNA-topoisomeraser involverer dannelsen af ​​forbigående kovalente broer af enzym-DNA-komplekser. En tyrosyl gruppe i det aktive sted på enzymet angriber en phosphodiesterbinding på DNA rygrad og forbliver kovalent bundet til den ene side af pausen, efterlader en modsat fri hydroxyl (OH) ende, der tillader religering trin efter DNA topologi er løst, af en anden nucleofilt angreb af den kovalente enzym-DNA phosphotyrosin binding, frigøres enzymet til den næste katalytiske cyklus. Involveringen af ​​disse enzymer i væsentlige cellulære processer mærkede topoisomeraser som vigtige mål for anti-cancer behandlinger, og for udvikling af potente, mere effektive, lægemidler mod cancer [22], [23]. Cytotoksiciteten af ​​topoisomeraser inhibitorer, såsom Camptothecin (CPT) og dets derivater TPT og CPT-11 (som er godkendt til klinisk brug), skyldes deres evne til at stabilisere det spaltelige kompleks af Topo-DNA, som indfører enkelte og dobbelte strengbrud i DNA [21], [24], [25]. Topoisomerase aktivitet er påvirket af flere posttranslationelle modifikationer, blandt dem phosphorylering, poly-ADP-ribosylering og ubiquitinering. Nyligt arbejde udført i vores laboratorium demonstrerede O-GlcNAcylation af Topo IB, som påvirker dets aktivitet [26].

phosphorylering af DNA-topoisomerase I med caseinkinase II (CK II) og proteinkinase C (PKC) opregulerer enzymet DNA afslapning aktivitet, hvorimod dephosphorylering med alkalisk phosphatase inhiberede denne aktivitet. Desuden blev poly-ADP-ribosylering af poly-ADP ribose polymerase (PARP-1) af enzymet protein, der findes at nedregulere sin aktivitet [20], [27]. PARP-1 vides at blive aktiveret af DNA-brud; men for nylig blev det rapporteret, at PARP-1 kan aktiveres ved phosphoryleret ERK2 i fravær af stressbetingelser eller DNA-beskadigelse [28]. I de seneste undersøgelser blev Mycoplasma påvist at være stand til at aktivere forskellige MAPK’er, såsom SAPK /JNK, p38, NF-kB, AP-1, og ERK 1/2 i afhængighed af mycoplasma-afledt membran lipoproteiner [11], [29] – [31]. Det er derfor vigtigt at undersøge muligheden for, at den cellulære Topo I og effekten af ​​katodestrålerør som anti-cancer midler kan være påvirket af Mycoplasma-infektion.

Materialer og metoder

Celler

human brystcancer-cellelinier -MCF7 (American Type Culture Collection, HTB-22) og humant glioblastom cellecentre U251 (HTB-17) venligt modtaget fra Porgador A, Ben-Gurion University. Celler blev dyrket som monolag i DMEM og RPMI 1640-medium (Biological Industries, Beith HaEmek, Israel) henholdsvis suppleret med 10% føtalt bovint serum, 50 IE penicillin, 50 ug /ml streptomycin og L-glutamin (0,29 μγ /ml ). Cellelinier blev dyrket i en fugtig inkubator tilsat 5% CO

2 ved 37 ° C.

Enzymer, antistoffer og forbindelser

Stamopløsninger af Camptothecin (Sigma, Israel) til 20 mM (opløst i 100% DMSO) blev opbevaret i portioner ved -70 ° C og fortyndet i DMSO før tilsætning til reaktionsblandingen eller til cellekulturmediet. Supersnoede DNA-plasmid pUC19 blev indkøbt fra MBI Fermentas (Hanover, MD, USA). PD98059 og 3-aminobenzamid (3AB) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel)

Den primære antisera var som følger:. Monoklonalt muse-anti-β-actin-antistof (MP Biomedicals, LLC); gede polyklonalt IgG (C-15) anti-topo I, muse-monoklonalt IgG antiphospho-ERK (E-4), og kanin-polyklonalt IgG-anti-ERK (C-16) (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA); mus monoklonale anti-poly-ADP ribose antistoffer (Serotec, Oxford, UK); og ged anti-mus og anti-kanin IgG sekundære antistoffer (Biolabs Inc., Ipswich, MA, USA). For immunopræcipitationsanalyser, blev anti-Topo I-antistof afledt fra sclerodermia patientserum anvendes (TopoGene, Florida, USA).

forøget kemiluminescens (ECL) reagenser blev indkøbt fra Biological Industries (Beit Haemek, Israel).

Mycoplasma vækst

M. fermentans stamme

K7 blev dyrket i SP4 bouillon ved 37 ° C og 5% CO

2 indtil logaritmisk fase. En ml alikvoter indeholdende 2 × 10

8 kolonidannende enheder (CFU) blev holdt frosset ved -70 ° C indtil anvendelse. For hvert eksperiment blev en alikvot optøet, dyrket i SP4 bouillon ved en fortynding på 1/10 i 24 timer (37 ° C, 5% CO

2), efterfulgt af yderligere fortynding af 1/50 indtil en logaritmisk fase var observeret (efter ca. 24 timer). Den nøjagtige mængde af

M. fermentans

blev bestemt ved at tælle CFU, som tidligere beskrevet [32], [33].

mycoplasma proteinekstrakt Forberedelse

M. fermentans

blev dyrket som ovenfor; 500 ml kultur blev pelleteret (13000 x g, 30 min ved 4 ° C) og vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS). Pelleten blev derefter resuspenderet i PBS. CFU /ml blev bestemt, og den resuspenderede pellet blev opbevaret ved -70 ° C i yderligere forsøg. Frosne pellets af

M. fermentans

blev optøet og sonikeret ved 4 ° C i 4 x 30 sekunder ved 80% effekt (50% duty cycle; Heat Systems Ultralyd, Inc.) i nærvær af proteaseinhibitoren phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF 0,001 M). Disse betingelser for lydbehandling resulterede i en ikke-levende mycoplasma præparat (iagttoges ingen vækst i gentagne dyrkning procedurer). Proteinkoncentrationen af ​​det lydbehandlet

M. fermentans

blev bestemt ved Bio-Rad protein assay kit (Richmond, CA); 1 × 10

8 CFU svarede til 10 ug mycoplasma protein.

behandling af maligne cellelinier med Live

M.

fermentans

eller

M. fermentans Salg Total protein

MCF7 og U251-celler, forvasket en gang med PBS (1200 RPM, 5 min ved 4 ° C) og resuspenderes i et nyt dyrkningsmedium i en koncentration på 2 × 10

5 celler /ml, blev dyrket i 96-brønds sterile plader (Corning Inc., Corning, NY) ved en slutkoncentration på 4 × 10

4/200 gl /brønd. Lev

M. fermentans på

log-fase, forvasket en gang i PBS (13000 x g, 30 min ved 4 ° C), og resuspenderes i RPMI 1640 medium indeholdende 10% inaktiveret FCS, 1% penicillin og 1% glutamin, tilsat til cellekulturerne ved MOI 1000:1 (4 × 10

7 CFU /brønd). De co-kulturer blev inkuberet i fem timer ved 37 ° C, 5% CO

2. For eksperimenter med

M. fermentans Salg total protein, en koncentration på 20 ug /ml (svarende til 2 × 10

8 CFU) blev tilsat til de undersøgte tumorceller (2 × 10

5 celler /ml) i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO

2.

DNA Amplification af

M. fermentans

ved revers transkription-PCR (RT-PCR) under anvendelse af en nukleotidsekvens i Insertion Sequence element

Totalt RNA blev ekstraheret fra de inficerede MCF7 og U251-celler ved anvendelse TRI Reagent (T9424; Sigma- Aldrich, Rehovot, Israel), derefter revers transkriberet under anvendelse af 1 ug totalt RNA fra de undersøgte celler med oligo-dT-primer, under anvendelse RevertAid Kit (K1621, Fermentas, Vilnius). Forskellige cDNA isoleret fra

M. fermentans

-inficerede celler for forskellige intervaller (1,5, 3, 6, 12 og 24 timer) blev amplificeret under anvendelse REDTaq Ready Mix (R2523; Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel). Sekvenser af det syntetiske oligonukleotidprimer par (RWO04 og RWO05) anvendes til specifikke DNA-amplifikation af

M. fermentans

deres positioner i Insertion Sequence-element (IS-element) blev beskrevet tidligere [34]. Primersekvenserne og størrelser af PCR-produkterne var som følger: RW004 primer (24 nt): 5’GGA CTA TTG TCT AAA CAA TTT CCC og RW005 primer (24 nt): 5’GGT TAT TCG ATT TCT AAA TCG CCT. Størrelsen af ​​den diagnostiske DNA-bånd er 206 bp. Den termisk cykling profil amplifikation omfattede 40 cyklusser ved 95 ° C i 30 sekunder (240 sekunder i den første cyklus), 62 ° C i 60 sekunder og 72 ° C i 60 sekunder (øget til 10 minutter ved den endelige cyklus). PCR-produkterne blev visualiseret på en 1% agarosegel farvet med ethidiumbromid.

Nuclear proteinekstrakter Fremstilling

kerneekstrakter for Topoisomerase assays og Western blot-analyse fra MCF7 og U251-celler blev fremstillet som tidligere beskrevet [27], [35] – [40] og en blanding af proteaseinhibitorer (slutkoncentrationer: 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin a, 2 ug /ml antipain, 100 ug /ml PMSF) blev tilsat til udvinding buffere. Total proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Lab, CA, USA).

Bestemmelse af niveau af Topo I protein ved Western blot analyse

Lige mængder af nukleare proteiner fra Mycoplasma behandlede eller ubehandlede MCF7 og U251-celler, blev analyseret ved Western blot-analyse under anvendelse af enten anti-Topo i-antistof (Santa Cruz Biotechnology Inc.) eller anti-β-actin-antistoffer (MP Biomedicals, LLC) som tidligere beskrevet [36], [39], [41]. Immunkomplekserne blev påvist ved forøget kemiluminescens (ECL).

Topo I Assay

Topo I-assay blev udført som tidligere beskrevet [26], [37]. Stigende koncentrationer af nukleare proteiner blev tilsat til en Topo I reaktionsblanding indeholdende, i en endelig volumen på 25 pi: 20 mM Tris-HCI (pH 8,1), 1 mM dithiothreitol, 20 mM KCI, 10 mM MγCl

2, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 30 ug /ml bovint serumalbumin og 250 ng pUC19 supersnoet DNA-plasmid (MBI, Fermentas, Hanover, MD). Efter inkubering ved 37 ° C i 30 minutter blev reaktionen afsluttet ved tilsætning af 5 pi stop buffer (slutkoncentration: 1% natriumdodecylsulfat, 15% glycerol, 0,5% bromphenolblåt og 50 mM EDTA, pH 8). Reaktionsprodukterne blev analyseret ved elektroforese på en 1% agarosegel ved anvendelse af Tris /borat /EDTA-buffer (89 mM Tris-HCI, 89 mM borsyre og 62 mM EDTA) ved 1 V /cm, farvet med ethidiumbromid (1 ug /ml) og fotograferet under anvendelse af en kort bølgelængde UV-lampe (ChemiImager ™ 5500 udstyr, Alpha Inotech Corporation, San Leandro, CA). Densitometrisk analyse af resultaterne blev udført med EZ-Quant-Gel analyse software (EZ-Quant, Rehovot, Israel), og procentdelen af ​​Topo I-aktivitet blev beregnet ved anvendelse af følgende ligning: (1 – (prøve /kontrol)) × 100 [37].

immunopræcipitationsassay

mus monoklonalt anti-poly-ADP ribose (PAR) antistof (MCA 1480) blev købt fra Serotec (Oxford, UK). Ens mængder af nukleare proteiner (200 ug), der var præ-kogt i 5 minutter, blev underkastet immunpræcipitation med anti-humant Topo I-antistof (SC) i en endelig volumen på 100 pi af nuklear buffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl

2, og proteasehæmmere: 2 ug /ml aprotinin, 2 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin A, 2 ug /ml antipain, 100 ug /ml PMSF) . Blandingen blev roteret ved 4 ° C natten over. Protein A-Sepharose (0,1 g /ml) i TE-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8, 1 mM EDTA) blev tilsat i yderligere 1 time. Prøverne blev centrifugeret ved 10.000 x g i 2 minutter, og perlerne blev vasket tre gange med TE-buffer. Pelleten blev resuspenderet i 25 pi prøvepuffer (slutkoncentration: 7,5% glycerol, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% β-mercaptoethanol og 0,025% bromphenolblåt), koges i 5 minutter, og centrifugeret. Prøverne blev påsat 7,5% SDS-PAGE og Western blot-analyse blev udført ved anvendelse af gede-polyklonalt IgG (C-15) anti-Topo I eller anti-poly-ADP ribose (PAR) antistoffer.

Stripping af antistoffer fra nitrocellulosemembranen

membranen blev nedsænket i en stripping buffer (100 mM 2-β-mercaptoethanol, 2% SDS og 62,5 mM Tris-HCI, pH 6,7) efterfulgt af inkubation ved 50 ° C i 30 min med lejlighedsvis omrøring. Membranen blev vasket to gange med TPBS (31,25 mM Na

2HPO4, 12,5 mM Na

2HPO

4, 13,7 mM NaCl, 0,1% Tween) i 10 minutter ved stuetemperatur.

Cell cytotoksicitet Assay

Celler (5000 /brønd, i tre eksemplarer) blev inficeret med

M. fermentans på

2 × 10

1-2 × 10

3 MOI i 6 timer efterfulgt af behandling med 30 pM CPT eller 0,01% DMSO i yderligere 12, 24 eller 36 timer. Cell overlevelse blev undersøgt ved hjælp af Neutral Red assay [42].

Statistisk analyse

Studerende

t

-test blev anvendt til at bestemme betydningen mellem eksperimentelle prøver og kontroller.

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant (*);

P

værdier 0,01 (**) og 0,005 (***) blev anset for meget signifikant

Resultater

1.. Lev

M. fermentans

hæmmer DNA Afslapning Aktivitet af Topo Jeg

Effekten af ​​levende

M. fermentans

på aktiviteten af ​​cellulære Topoisomerase I blev undersøgt i to typer af cellelinier: human brystcancer (MCF7) og glioblastom (U251). Celler blev inficeret med levende

M. fermentans på

MOI på 10

3CFU /celle, for forskellige intervaller (1,5, 3, 6, 12 og 24 timer). Nukleare ekstrakter blev fremstillet fra inficerede og ikke-inficerede celler og Topo I-aktivitet blev målt. Ækvivalente mængder af kerneekstrakt proteiner blev tilsat til en Topo I DNA afslapning assayblandingen indeholdende supersnoet DNA-plasmid som substratet for enzymet; reaktionsprodukterne blev analyseret ved agarosegelelektroforese. Topo I-aktivitet måles ved omdannelsen af ​​supersnoet plasmid til sine helt eller delvist afslappede former [19]. Begge celletyper inficeret af

M. fermentans

påvistes et signifikant fald, op til 80%, i DNA afslapning enzymets aktivitet, sammenlignet med ikke-inficerede celler. blev observeret et gradvist fald i Topo I-aktivitet starter 1,5 timer efter infektion med

M. fermentans

, og blev påvist toppen af ​​nedsættelsen af ​​enzymaktiviteten (80%) ved 6 timer efter infektion. Væsentlig reduktion i DNA afslapning aktivitet af Topo I blev påvist også 12 og 24 timer efter infektion (30-50% for MCF7, 25-40% for U-251, henholdsvis) (Figur 1A-D). Den grad af reduktionen i Topo I-aktivitet faldt med tiden, hvilket antyder, at effektiviteten af ​​signalet medieret af Mycoplasma er svækket, som tidligere blev påvist for mycoplasma-medieret signaltransduktionsveje [31], [43]. For at bekræfte, at cellerne faktisk blev inficeret og den observerede virkning skyldes tilstedeværelsen af ​​

M. fermentans

, analyseret vi tilstedeværelsen af ​​Mycoplasma DNA i de inficerede celler ved revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) under anvendelse af

M

.

fermentans-

specifikke primere. Resultaterne bekræftede, at de undersøgte tumorcellelinjer faktisk blev inficeret med

M. fermentans

(figur 2A).

MCF7 (A, B) og U251 (C, D) kræftceller blev inficeret med levende

M. fermentans Hotel (

M.f

) for forskellige intervaller ved MOI på 10

3CFU /celle. Total kerneprotein (12,5 ng) blev tilsat til en specifik reaktionsblanding for Topo I. Reaktionsprodukter blev analyseret ved agarosegelelektroforese. (A, C) et repræsentativt billede (n = 4-5) i Topo I-DNA-afslapning aktivitet. (B, D) Kvantificering analyse af Topo I-aktivitet. Symboler: R og S er den afslappede og supersnoet form af pUC19-DNA, henholdsvis; TopoTargets ingen protein tilsat til reaktionsblandingen.

t

-test:. *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

0,005

prøver fra MCF7 og U251 inficerede celler (beskrevet i figur 1) blev analyseret til påvisning af mycoplasma DNA ved PCR (A, B). Nukleare ekstrakter afledt fra MCF7 og U-251 inficerede celler blev analyseret for Topo I proteinniveauet anvendelse af Western blot-analyse med anti-Topo I eller anti-p-actin-antistoffer, og kvantificeres ved densitometrisk analyse under anvendelse af EZquant software (C-F).

for at undersøge, om faldet i Topo i-aktivitet i inficerede tumorceller er en konsekvens af en reduktion i Topo i proteinniveauet blev kerneekstrakter afledt af både inficerede og ikke-inficerede celler analyseret ved Western blot med passende anti-Topo I-antistoffer. Som afbildet i figur 2C-F, niveauet af Topo I-protein i inficerede celler var den samme som fundet i ikke-inficerede celler. Resultaterne antyder, at reduktionen i Topo I-aktivitet ikke skyldtes et fald i enzymet proteinmængden.

2. Inhibition af DNA Relaxation Aktivitet af Topo I af sonikerede

M. fermentans

For at bestemme, om Mycoplasma effekt på Topo I udøves af materialer udskilles fra levende Mycoplasma eller af strukturelle proteiner af denne bakterie, vi undersøgte Topo I-aktivitet i tumorceller behandlet med ikke-levende, ultralydbehandlet ,

M. fermentans

. Celler (MCF7 og U251) blev behandlet i 24 timer med stigende proteinkoncentration (5, 10 og 20 ug /ml) afledt af sonikeret

M. fermentans

. Kerneekstrakt blev fremstillet ud fra de behandlede og ubehandlede celler og Topo I DNA afslapning aktivitet blev målt. Som vist i figur 3A, D, en signifikant reduktion i Topo I-aktivitet blev observeret, på en dosis-afhængig måde, i celler behandlet med

M. fermentans

proteiner (soniker). Kvantificering af Topo I-aktivitet [37] fra flere eksperimenter (n = 4) blev udført. En reduktion på 40-80% (

s Restaurant 0,05) i Topo I-aktivitet observeres i celler behandlet med 5-20 ug /ml sonikeret

M. fermentans

proteiner til 24 timer (figur 3B, E). Selv om der blev observeret reduktion af Topo I-aktivitet i celler behandlet med sonikeret Mycoplasma blev niveauet af Topo I-protein ikke påvirket (fig. 3C, F).

MCF7 (A-C) og U251 (D-F ) cancerceller blev behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer af

M. fermentans

proteiner. Total kerneproteiner (12,5 ng) blev tilsat til en specifik reaktionsblanding for Topo I. Reaktionsprodukter blev analyseret ved agarosegelelektroforese. (A, D) et repræsentativt billede (n = 4-5) af Topo I DNA afslapning aktivitet. (B, E) Kvantificering analyse af Topo I-aktivitet. (C, F) Topo I proteinniveauet undersøgt ved Western blot analyse. Symboler: R og S er den afslappede og supercoilede form af pUC19-DNA, henholdsvis TopoTargets ingen protein tilsat til reaktionsblandingen.

t

-test:. *

s

0,05, **

s

0,01, ***

s

0,005

Dette resultat indikerer, at enten levende eller ikke-levende (ultralydbehandlet)

M. fermentans

udøvet lignende virkninger på det cellulære Topo jeg enzym.

3.

M. fermentans

formindsket CPT Inhibition Effect på DNA Afslapning Aktivitet af Topo Jeg

Det var interessant at undersøge effekten af ​​Mycoplasma-infektion på den hæmmende evne kendte Topo I antagonister, såsom CPT. Indledningsvis vi gennemført en række forsøg, hvor celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CPT for at vælge den CPT dosis, der forårsager næsten fuldstændig hæmning af enzymaktiviteten inden for en kort periode (ikke vist). Vi valgte en CPT dosis på 30 uM, hvilket inhiberede Topo I-aktivitet med 90-95% inden for 1,5 h (figur 4A, B; sammenlign bane 4 med bane 2). Celler blev inficeret med levende

M. fermentans

i 6 timer ved MOI på 10

3 CFU /celle, efterfulgt af 30 uM CPT behandlinger i yderligere 1,5 timer. En væsentlig formindskelse i CPT-inhiberende virkning (fra 95% inhibering til ca. 60%) blev observeret i MCF7 celler udsat for kombinationen af ​​

M. fermentans

infektion og CPT behandling (figur 4A, B, sammenligner bane 6 til bane 4,

s

0,005). Lignende resultater blev opnået med U251-celler (Figur S1 A-B). Behandling af celler med CPT er kendt for at reducere mængden af ​​frit Topo I-proteinet er til stede i nukleoplasma grund af stabiliseringen af ​​enzym-DNA spaltelige komplekser ved CPT. Faktisk behandling af tumorceller med CPT reducerede niveauet af fri Topo I protein (figur 4C bane 3). Kombinationen af ​​Mycoplasma-infektion og CPT behandling ikke påvirke niveauet for fri Topo I protein, når de undersøges i forhold til mængden af ​​β-actin protein (figur 4C).

MCF7 celler blev inficeret med

M. fermentans Hotel (

M.f

) i 6 timer, efterfulgt af CPT (30 uM) behandlinger for yderligere 1,5 timer. Total kerneprotein (12,5 ng) blev tilsat til en specifik reaktionsblanding for Topo I. Reaktionsprodukter blev analyseret ved agarosegelelektroforese. (A) En repræsentant billede n = 5, i Topo I-DNA-afslapning aktivitet. (B) Kvantificering analyse af Topo I-aktivitet. (C) Topo I-protein niveau undersøgt ved Western blot analyse. Symboler: R og S er den afslappede og supercoilede form af pUC19-DNA, henholdsvis TopoTargets ingen protein tilsat til reaktionsblandingen

t

-test: *

s Restaurant 0,05, * *

s

0,01, ***

s

. 0,005

4. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antagonister forhindret Mycoplasma-inducerede hæmmende effekt på Topo I Aktivitet

De nævnte resultater tyder på, at reduktionen i Topo I-aktivitet i tumorceller udøves af

M. fermentans

kan skyldes posttranslationelle modifikationer af enzymproteiner. Topo I gennemgår flere post-translationelle modifikationer, som påvirker dens aktivitet: Phosphorylering af Topo I af Caseinkinase II eller ved PKC øger sin aktivitet, hvorimod Poly-ADP ribosylering af PARP-1 reducerer dets aktivitet. Desuden ubiquitinering af Topo I fører til dens proteolyse [44], [45]. For at bestemme vej, ad hvilken

M. fermentans

påvirker topoisomerase I, vi først undersøgte virkningen af ​​poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor -3-aminobenzamid (3AB) på Topo I-aktivitet, alene og som en forbehandling til

M. fermentans

infektion. MCF7-celler blev præinkuberet med 3AB ved forskellige koncentrationer (1-3 mM) i 1,5 timer efterfulgt af

M. fermentans Salg infektion (MOI på 10

3CFU /celle) og inkubation i yderligere 6 timer. Kerneekstrakt blev fremstillet og analyseret for Topo I-aktivitet som beskrevet ovenfor. Resultaterne er afbildet i figur 5A-B viser, at forbehandling med 3AB forhindrede

M. fermentans

induceret reduktion i Topo I-aktivitet. Behandling af ikke-inficerede celler med 3AB for den angivne tid ikke påvirke den cellulære Topo I-aktivitet (figur 5A, B). Lignende resultater blev opnået med de U-251 celler (figur S2 A-B).

MCF7-celler blev præ-inkuberet med 3-aminobenzamid (3AB) i 1 time ved forskellige koncentrationer efterfulgt af

M. fermentans Salg infektion (MOI på 10

3 CFU /celle) i yderligere 6 timer. Total kerneprotein (12,5 ng) blev tilsat til en specifik reaktionsblanding for Topo I. Reaktionsprodukter blev analyseret ved agarosegelelektroforese (A) og kvantificering af Topo I-aktivitet blev udført (B). Symboler: R og S er den afslappede og supercoilede form af pUC19-DNA, henholdsvis TopoTargets ingen protein tilsat til reaktionsblandingen

t

-test: *

s Restaurant 0,05, * *

s

0,01, ***

s

. 0,005

5. MEK Inhibitor forhindrede Mycoplasma-inducerede reduktion i Topo I Aktivitet og ERK 1/2 Phosphorylering

Seneste rapporter viste, at PARP-1 phosphoryleres af ERK [28]. Effekten af ​​levende

M. fermentans

på MAPK’er generelt var ikke grundigt undersøgt. De fleste af undersøgelserne vedrørende

M. fermentans

og MAPK’er blev udført ved hjælp af mycoplasma produkter eller varme inaktiveret Mycoplasma (HIM). viste imidlertid et par undersøgelser, at infektion af celler med forskellige Mycoplasma kan føre til ERK-phosphorylering [11], [17], [30]. I dette studie undersøgte vi virkningen af ​​MEK inhibitor PD-98059 på Topo I-aktivitet, alene eller før infektion med

M. fermentans

. MCF7 og U-251-celler blev præinkuberet med PD i 1,5 timer ved en koncentration på 25 pM efterfulgt af

M. fermentans Salg infektion (MOI på 10

3CFU /celle) og inkubation i yderligere 6 timer. Kerneekstrakt blev fremstillet og analyseret for Topo I-aktivitet og phosphorylering af ERK anvendelse af Western blot-analyse med specifikke anti p-ERK 1/2 antistof. Resultaterne viste, at tilsætning af MEK inhibitor til Topo I-reaktion ikke påvirkede Topo I-aktivitet (figur 6A, B), og i modsætning hertil behandling af celler med inhibitoren (PD) forhindrede

M. fermentans-

induceret reduktion i Topo I-aktivitet (figur 3A, B for U-251-celler). Desuden fandt vi, at mængden af ​​p-ERK1 /2 steg i inficerede celler (figur 6C for MCF7-celler og Figur S3 C i U-251), mens forbehandling med PD forhindret denne stigning. Niveauet af total ERK blev ikke påvirket af de forskellige behandlinger (Figur 6C). Disse resultater tyder på, at reduktionen i Topo I-aktivitet i

M. fermentans-

inficerede celler er medieret af MAPK signalering.

MCF7-celler blev præinkuberet med MEK-inhibitorer (PD) i 1 time ved en koncentration på 25 pM efterfulgt af

M. fermentans Salg infektion (MOI på 10

3CFU /celle) i yderligere 6 timer. Total kerneprotein (12,5 ng) blev tilsat til en specifik reaktionsblanding for Topo I. Reaktionsprodukter blev analyseret ved agarosegelelektroforese (A) og Topo I-aktivitet blev kvantificeret (B). Phosphoryleret ERK 1/2 proteinniveauet fra MCF7-ekstrakt blev undersøgt ved Western blot-analyse (C). Symboler: R og S er den afslappede og supercoilede form af pUC19-DNA, henholdsvis TopoTargets ingen protein tilsat til reaktionsblandingen

t

-test: ***

s Restaurant 0,005 .

6.

M. fermentans

Infektion Øget Poly-ADP-ribosylering af Topo I arvet fra MCF7 Celler

PARP-1 regulerer Topo I-aktivitet af ADP-ribosylering af enzymet protein [46]. For at undersøge, om infektion med

M. fermentans

induceret Topo I modifikation af PARP blev Topo I-protein immunpræcipiteret af anti-Topo I-antistoffer afledt fra sklerodermi (SC) patientserum [47] og analyseres ved Western blot under anvendelse af anti-Poly-ADP-ribose monoklonalt antistof (figur 7A).