PLoS ONE: anvendelsen af ​​forankrede agonister af fagocytisk Receptorer for Cancer Immunterapi: B16-F10 Murine Melanom Model

Abstrakt

Anvendelsen af ​​de fagocytiske receptor agonister i cancer-immunterapi blev undersøgt. Agonister (laminarin, molekyler med terminal mannose, N-formyl-methioninyl-leucyl-phenylalanin) blev fast forankret til tumorcelleoverfladen. Når særlige agonister af fagocytiske receptorer blev anvendt sammen med LPS (Toll-lignende receptor agonist), blev observeret høj synergi forårsager tumor svind og en midlertidig eller permanent forsvinden. Metoder til forankring fagocytiske receptoragonister (charge interaktioner, forankring baseret på hydrofobe kæder, kovalente bindinger) og forskellige regimer af fagocyterende agonist /LPS blandingen ansøgninger blev testet for at opnå maksimal terapeutisk effekt. Kombinationer af mannan /LPS og f-MLF /LPS (hydrofobe ankre) i passende (puls) regimer resulterede i en 80% og 60% genvinding for mus, henholdsvis. Vi foreslår, at en betydelig synergi mellem agonister af fagocyterende og Toll-lignende receptorer (TLR) er baseret på to begivenheder. TLR-ligand inducerer tidlig og massiv inflammatorisk infiltration af tumorer. Virkningen af ​​denne celleinfiltrat er rettet mod tumorceller, som bærer agonister af fagocytiske receptorer på deres overflade. Resultatet af disse processer var effektivt drab af tumorceller. Denne nye tilgang repræsenterer udnyttelse af medfødte immunitet mekanismer til behandling af kræft

Henvisning:. Janotová T, Jalovecká M, Auerová M, Švecová I, Bruzlová P, Maierová V, et al. (2014) anvendelsen af ​​forankrede agonister af fagocytisk Receptorer for Cancer Immunterapi: B16-F10 Murine Melanom Model. PLoS ONE 9 (1): e85222. doi: 10,1371 /journal.pone.0085222

Redaktør: Lucia Gabriele, Istituto Superiore di Sanità, Italien

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: November 25, 2013; Udgivet: 13 Jan 2014

Copyright: © 2014 Janotová et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af projekt nr. CZ.1.07 /2.2.00 /15,0361 finansieret af Den Europæiske Socialfond og tjekkiske statsbudget. Det blev yderligere understøttet af selskabet POLAK CZ s.r.o. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af POLAK CZ s.r.o. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer.

Introduktion

Ifølge bredt accepteret kræft immunoediting hypotese [1] kræftceller, som overvandt elimination og ligevægtsfaser, generere de kritiske ændringer er nødvendige for at omgå både medfødte og adaptive immunologiske forsvar (flugt fase). Talrige escape mekanismer omfatter nedregulering af tumorspecifikke antigener [2], tab eller nedregulering af MHC-antigener [3], defekter i antigen-bearbejdning og præsentation [4], ekspression af immun-inhiberende ligander på tumorceller [5] , induktion af centrale eller perifere tolerance [6] eller generering af en immunsuppressiv tumormikromiljøet [7].

Mens den vigtigste komponent af anti-tumor-immunitet er repræsenteret ved cytotoksiske T-lymfocytter [8], blandt celler fra medfødte immunitet, NK-celler synes at spille den vigtigste rolle [9]. Den rolle, som andre medfødte immunitet celler er langt mindre udforsket og næsten intet vides om anerkendelse af tumorceller ved ubevæbnede makrofager eller granulocytter [10].

Ikke desto mindre Cui et al. [11] og Hicks et al. [12] viste, at mus med et SR /CR-mutationen, hvilket muliggør genkendelse af tumorceller via en hidtil ukendt mekanisme, med succes dræbte tumorceller.

In vitro

forsøg viste, at celler i medfødte immunitet (NK-celler, makrofager, neutrofile) var ansvarlige for kræft celle drab. Udnyttelse af mønstergenkendelse receptor (PRR) agonister til at stimulere medfødte signalveje [13] er en anden delvis succes metode til behandling af cancer. Komplekst system til PRR agonistvirkning består i produktion af interferon type I og andre proinflammatoriske cytokiner, øget modning af dendritiske celler, sekretion af Th1 cytokiner, antigen cross-præsentation, aktivering af NK-celler og undertrykkelse af regulatoriske T-celler og tumorassocierede makrofager [ ,,,0],14]. Kliniske forsøg med fokus på brugen af ​​syntetiske ligander af Toll-lignende receptorer (TLR) 3,7,9 til tumor behandling [15].

Men ud over det faktum, at aktivering af signalering receptorer (primært TLR) kundeemner til etablering af stærke svar på niveauet for medfødte immunitet, tumorinfiltrerende immunceller skal anerkende tumorceller som de sande mål for deres angreb. Vi foreslår at manipulere fagocytiske celler (en vigtig komponent af inflammatorisk infiltrat) for at kunne finde deres mål ved kobling agonister af fagocytiske receptorer på overfladen af ​​tumorceller for at opnå en stærk antitumorvirkning. Denne effekt kan dramatisk forøges ved samtidig behandling af TLR receptorer med en agonist (fx LPS).

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Alle de eksperimentelle procedurer var gennemføres i overensstemmelse med lovgivningen i den Tjekkiske Republik om brugen af ​​eksperimentelle dyr, sikkerhed og brug af patogener. Undersøgelsen blev godkendt af Institut for Parasitologi, Biologi Centre af Academy of Sciences i Tjekkiet og Institutionelle og nationale udvalg (protokoller nr. 138/2008).

Anæstesi af mus (anvendes under transplantation af melanom celler) var baseret på intraperitoneal injektion af Ketamine.HCl (75 mg /kg) og Xylazine.HCl (75 mg /kg). For at overleve var analyse mus overvåget to gange om dagen. Hvor tumorvækst begrænset et dyrs evne til at bevæge sig normalt eller at spise eller drikke så musene aflivet via cervikal dislokation.

Kemikalier

Tissue dyrkningsmedier og kosttilskud, laminarin fra

Fingertang

, mannan fra

Saccharomyces cerevisiae,

lipopolysaccharider (LPS) fra

Escherichia coli

, lipoteichoinsyre (LTA) fra

Bacillus subtilis

, dithiothreitol (DTT), Tris ( 2-carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (TCEP), DAPI, og f-MLF (N-formyl-methioninyl-leucyl-phenylalanin) blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). 4 – (

N

-Maleimidomethyl) cyclo-hexanecarboxylic-syre N-hydroxysuccinimidester (SMCC) blev indkøbt fra Thermo Scientific (Erembodegem, Belgien). Biokompatible anker for cellemembranen (BAM, Mw 4000) og N- (succinimidyloxy-glutaryl) -L-α-phosphatidylethanolamin, dioleoyl (DOPE) blev opnået fra NOF EUROPE (Grobbendonk, Belgien). Anti-CD11-FITC-konjugat blev opnået fra MACS Miltenyi Biotec.

Monomannosyldekalysine blev syntetiseret ved Vidia (Prag, Tjekkiet). Mannose- (G)

5- (K)

12, mannose- (G)

5- (K)

10-STE (STE betyder stearinsyre), f-MLF- (G )

5- (K)

12, f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE, MLF- (G)

5- (K)

10-STE, og f-MLFKK blev syntetiseret ved Schafer-N (København, Danmark).

Syntese af laminarin-BAM, mannan-BAM, f-MLFKK-BAM, og f-MLFKK-DOPE

først både amineret laminarin og mannan blev fremstillet ved reduktiv aminering [16]. Laminarin (mannan) opløsning i et miljø af ammoniumacetat blev reduceret med natrium-cyanoborhydrid ved pH 7,5 og 50 ° C i fem dage. Opløsning blev yderligere dialyseret under anvendelse MWCO 3500 dialyserør (Serva, Heidelberg, Tyskland) mod PBS ved 4 ° C natten over. Peptid F-MLFKK allerede indeholdt en aminogruppe.

Binding af BAM (indeholder én alifatisk kæde) eller DOPE (to alifatiske kæder) på aminogruppen af ​​laminarin (mannan, f-MLFKK) blev udført ved pH 7,3 ifølge til Kato et al. [17]. Løbet af en time ved stuetemperatur N-hydroxysuccinimid (NHS) -gruppen af ​​BAM hhv. DOPE omsættes med aminogruppen i laminarin (mannan), eller med ε-aminogruppe af lysin hhv. Løsninger opnået (i PBS) blev opbevaret nedfrosset ved -20 ° C indtil brug.

Syntese af laminarin-SMCC, mannan-SMCC, f-MLFKK-SMCC, og deres

in vivo

in vitro

ansøgning

Ifølge producentens anvisninger (Thermo Scientific, Pierce Protein Biologi Produkter), på samme måde som det foregående afsnit, NHS gruppe af SMCC reagerede med aminogruppen af ​​amineret laminarin og mannan, eller med ε-aminogruppe af lysin i f-MLFKK (ækvimolære mængder) hhv. At garantere binding af SMCC indeholdende ligander til tumorceller, var det nødvendigt at sikre eksistensen af ​​-SH-grupper på cellerne. Det blev opnået i overensstemmelse med Christiaansen et al. [18] ved reduktion af cystiner. I vores

in vivo

eksperimenter brugte vi 50 mM opløsning af TCEP i PBS til dette formål. Denne opløsning blev injiceret intratumoralt (i.t.) en time før anvendelse af laminarin-SMCC, mannan-SMCC eller f-MLFKK-SMCC løsninger (i PBS). I vores

in vitro

eksperimenter brugte vi 5 mM opløsning af TCEP i PBS og en time inkubation på is.

cellelinjer og mus

Murint melanom B16-F10 celler og peritoneale makrofager PMJ2R blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Begge cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA, Østrig) og antibiotika. Celler blev holdt ved 37 ° C i befugtet luft med 5% carbondioxid.

Kvinde SPF C57BL /6-mus blev opnået fra Charles River Laboratories (Sulzfeld, Tyskland). Mus blev huset i plastikbure med træ-chip strøelse beliggende i et specifikt patogen- frie rum med en konstant temperatur på 22 ° C og en relativ fugtighed på 65%. Pellet diæt og vand blev steriliseret. Mus blev huset i en 12/12-timers fotoperiode miljø med fri adgang til foder og vand. Mus, der vejer 18-20 g blev anvendt i forsøgene.

Tumor transplantation

4 × 10

5 B16-F10 celler pr mus i 0,1 ml RPMI uden FCS blev podet subkutant (sc) i et barberet område på højre flanke.

behandling og evaluering af behandling

Mus blev randomiseret i grupper tolv dage efter tumor transplantation. Terapier begyndte straks (intratumorale anvendelser af 50 pi tilsvarende løsninger). Siden dette tidspunkt blev musene holdt individuelt.

Tumorer blev målt hver anden dag under anvendelse skydelærer. Volumen blev beregnet som tidligere beskrevet [19] ved hjælp af formlen V = π /6 AB

2 (A betegner den største dimension af tumor masse og B betegner den mindste dimension).

Mean reduktion af tumorvækst ( %)

Reduktion af tumorvækst (sammenlignet med kontrol) blev bestemt som følger:

Mean (i%) af værdier målt på dag 4, 6, 8, 10, 12 og 14 efter begyndelsen af ​​behandlingen blev beregnet og mærket som “gennemsnitlig reduktion på tumorvækst”.

Analyse af celleinfiltrat anvendelse af flowcytometri. Cytokin assay

Tumoren blev udskåret fra mus, som var blevet aflivet via cervikal dislokation. Den blev derefter forsigtigt vasket med koldt RPMI 1640, skæres i små stykker og anbringes i 1 ml kold RPMI 1640 indeholdende 0,33 mg /ml Liberase DL og 0,2 mg /ml DNase I (begge Roche Diagnostics, Tyskland). Efter 1 times inkubation på en rotationsryster ved 37 ° C blev klumper af vævs- aggregater centrifugeret ved 160

g

i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatant blev anvendt til IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6, (ELISA, eBioscience), og IL-8 (R klon 30-F11; 0,2 mg /ml), B-celler (anti-Mouse CD19 APC; klon eBio1D3 0,2 mg /ml), T-celler (anti-Mouse CD3e FITC, klon 145-2C11; 0,5 mg /ml), CD4 + T-celler (anti-muse CD4 APC, klon GK1.5; 0,2 mg /ml), CD8 + T celler (anti-muse CD8a, klon 53-6,7; 0,2 mg /ml), NK-celler (anti-Mouse NK1.1 PE; klon PK136, 0,2 mg /ml), granulocytter (anti-Mouse Ly-6G (Gr-1 ) Alexa Fluor 700; klon RB6-8C5; 0,2 mg /ml) og monocytter /makrofager (MF-celler) (anti-Mouse F4 /80 Antigen PE-Cy7; klon BM8; 0,2 mg /ml). Mærkede celleprøver blev vasket to gange i PBS ved centrifugering ved 160

g

i 2 min ved 4 ° C og analyseret under anvendelse af en BD FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences, USA) udstyret med to lasere med excitations- kapaciteter på 488 nm og 633 nm. Tyve tusinde arrangementer blev målt i hver suspension i tre uafhængige gentagelser. De mærkede cellepopulationer blev analyseret under anvendelse BD FACSDiva-software 6.1.3. Absolutte antal af leukocytundergrupper blev kvantificeret under anvendelse CountBright

TM absolutte optælling perler (Invitrogen, USA). Styringen af ​​alle specifikke monoklonale antistoffer, der genkender muse overfladeantigener blev udført på en prøve af splenocytter i hvert interval af forsøget. Celletal var genberegnet og udtrykt som celler /mm

3 i tumorvæv.

Histologi

Tumorer blev fikseret med 4% neutral opløsning af formaldehyd. Paraffinblokke blev fremstillet. Sektioner blev farvet af hæmatoxylin /eosin.

lungemetastaser

Lunger fikseret med 4% neutral opløsning af formaldehyd blev undersøgt ved hjælp af et dissektionsmikroskop. Tilstedeværelsen af ​​metastaser (sorte punkter) blev evalueret.

In vitro

analyse af den cytotoksiske virkning af makrofager aktiveret af en TLR-ligand på melanomceller bærer fagocytiske receptorer

assay var baseret på princippet tidligere [20] beskrevne. Murine B16-F10 melanomceller dyrket til konfluens i 96-brønds vævskulturplade (Nunc, Roskilde, Danmark) inkuberet (30 min, 37 ° C) med en opløsning af fagocytiske receptoragonister (0,02 mM laminarin-BAM eller 0,02 mM mannan- BAM eller 0,05 mM f-MLFKK-BAM i dyrkningsmedium) og efterfølgende vasket. Celler af murine makrofag cellelinie PMJ2R blev præinkuberet med LPS (1 ug /ml) i 2 timer ved 37 ° C, hvorefter de blev vasket, resuspenderet i RPMI 1640, 10% FCS og tilsat til B16-F10 i forholdet 05:01 . Denne blanding blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Efter inkubation blev PMJ2R og døde celler omhyggeligt vasket af. Living B16-F10 melanomceller blev frigivet ved trypsinering. Trypanblåt eksklusive celler blev kvantificeret med et hæmocytometer.

cellesignalering

2 × 10

5 af hver, B16-F10 og PMJ2R celler blev podet sammen i nærvær af laminarin-BAM eller B16-F10-celler med kovalent bundet laminarin-SMCC blev anvendt. Efter angivne inkubationstid blev cellerne lyseret i en modificeret RIPA buffer (1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoxycholat, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, og 50 mM Tris-HCI (pH 7,5)) i nærvær af proteasehæmmere (10 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 1 ug /ml pepstatin) og phosphataseinhibitorer (25 mM natriumfluorid og 2 mM natriumorthovanadat). Cellelysaterne blev blandet med 4x Laemmli prøvebuffer, end proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og overført til Immobilon-P membran. Blottene blev inkuberet med anti-phospho-NF-KB p65 (Ser536, Cell Signalling) og med anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology) antistof ved fortynding 1:1000. Proteiner blev visualiseret ved ECL (forstærket kemiluminiscens, Pierce), og deres overflod blev bestemt ved anvendelse af CCD-billedsensor systemet (ChemiDoc

TM MP Imaging System, BIO-RAD) og ImageLab software.

Funktion for BAM og DOPE at forankre molekyler til cellemembraner

Konjugation af BAM eller DOPE med B-phycoerythrin (PE) blev udført ved pH 7,3 i mørke som tidligere beskrevet [17]. En time varige interaktioner af PE-BAM, PE-DOPE og PE med 1 × 10

5 melanom celler blev udført ved 37 ° C i mørke i tre eksemplarer. Efter centrifugering (2 min. 4 ° C, 400 g) blev høstet og dens fluorescens målt ved Infinite M200 reader (Tecan, Schweiz) ved 545 nm.

Statistisk analyse

Statistisk analyse var udført under anvendelse af to-halet t-test. Mus overlevelse blev vurderet ved hjælp af Kaplan-Meier-test (MedCalc).

Resultater

Effekten af ​​laminarin i cancerbehandling

Effekten af ​​forankret laminarin (laminarin-BAM) på tumorvækst og dens samspil med LPS.

melanom B16-F10 blev transplanteret ind 20 C57BL /6-mus. Tolv dage efter dette blev musene randomiseret i fire grupper, der indeholder fem mus hver. På denne dag, blev tumor volumen målt og tumor terapi begyndte umiddelbart derefter. Som figur 1A viser, gjorde laminarin-BAM ikke have en betydelig effekt på tumorvækst. Virkningen af ​​LPS var statistisk signifikant resulterer i 63,2% gennemsnitlig reduktion af tumorvækst (se Materialer og Metoder til beregning af gennemsnitlig reduktion af tumorvækst). Kombinationen af ​​laminarin-BAM og LPS udviste synergistisk og stærk reduktion af tumorvækst (gennemsnitlig reduktion af tumorvækst blev 90,2% sammenlignet med kontrolgruppen). Vi observerede, at 60% af tumorer midlertidigt forsvundet eller en krympning på tumorvolumen indtraf. Formindskelse af tumorvækst var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollen og med virkningen af ​​individuelle (laminarin-BAM, LPS) komponenter. Vedrørende overlevelse, dens forlængelse i tilfælde af en /LPS-blanding laminarin-BAM var ikke statistisk signifikant.

C57BL /6-mus (hunner) blev inokuleret med 4 × 10

5 murine melanom B16-F10-celler per mus i 0,1 ml RPMI subkutant i et barberet område på højre flanke. Mus blev randomiseret i grupper på 5-6 tolv dage efter tumortransplantation. Terapier begyndte straks ved intratumorale anvendelser af 50 pi af tilsvarende opløsninger og fortsatte hver anden dag i 10 dage (samlet 6 doser). Efter terapi var begyndt, blev mus holdt individuelt. Tumorer blev målt hver anden dag i 14 dage, og deres volumen blev beregnet. (A) Forankret laminarin (laminarin-BAM). Grupper på 5 mus opnået 0,2 mM laminarin-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af 0,2 mM laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS alene. (B) Forankret mannose. Grupper på 6 mus opnået 3 mM mannose- (G)

5) – (K)

10-STE i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af 3 mM mannose- (G)

5- (K)

10-STE og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS alene. (C) Forankret mannan. Grupper på 5 mus opnåede 0,2 mM mannan-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af alene 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS. (D) Forankret formylpeptide receptor agonist ved oligolysin. Grupper på 6 mus blev injiceret med 3 mM f-MLF- (G)

5- (K)

12 i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af 3 mM f-MLF- (G )

5- (K)

12 og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS alene. (E) Forankret formylpeptide receptoragonist ved stearinsyre. Den samme ordning som i (D), 3 mM f-MLF- (G) 5- (K)

10-STE brugt

i stedet for 3 mM f-MLF- (G)

5- ( K)

12. * P ≤ 0,05, ** P≤0.01, *** P≤0.005, **** P≤0.001 forhold til at styre ■ p ≤ 0,05, ■■ P≤0.01, ■■■ P≤0.005 forhold til LPS oP≤ 0,05, ooP≤0.01, oooP≤0.005 forhold til liganden.

Synergy af laminarin-BAM med LPS, forskellige regimer af ansøgning.

En række forsøg svarende til ovenstående nævnte et blev udført. Optimering af lægemiddel ansøgning timing blev undersøgt. En blanding af 0,2 mM laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS blev anvendt. Resultaterne er angivet i tabel 1, fremhæver den væsentlige betydning af kort sigt, men tilstrækkelig effektiv terapi.

Anvendelse af anden form for laminarin binding til celleoverfladen.

Direkte kovalente

in vivo

binding af laminarin-SMCC til cellerne (med forudgående reduktion af cystiner af TCEP) blev påført. Laminarin-SMCC (0,2 mM) blev indgivet sammen med LPS (0,5 mg /ml). Denne terapi forårsaget stærkere reduktion af tumorvækst end laminarin-BAM /LPS, dog denne forskel ikke var statistisk signifikant (data ikke vist). Reduktion (TCEP) og SMCC bindende påvirkede ikke tumorvækst.

Kontrol eksperimenter.

For at demonstrere nødvendigheden af ​​laminarin forankring til kræftceller, gratis laminarin blev anvendt i stedet for laminarin-BAM. Laminarin reducerede ikke tumorvækst og dets blanding med LPS viste ingen tegn på additivitet eller synergi. Tumorvækst reducerende virkning af denne blanding svarede til aktiviteten af ​​LPS alene (data ikke vist). Anchor alene (lysin-BAM) viste ikke nogen antitumoraktivitet og dets blanding med LPS viste ingen tegn på additivitet eller synergi så godt.

Effekten af ​​molekyler med terminal mannose i kræftbehandling

Betydningen af ​​mannose forankring, påvirkning af LPS.

En 3 mM opløsning af mannose i PBS reducerede ikke tumorvækst, når de påføres hver anden dag, seks injektioner helt. Tilsætning af LPS (0,5 mg /ml) forårsagede ingen additivitet eller synergi, blandingen reducerede tumorvækst endnu mindre end LPS alene. Tumor celler betydeligt negativt ladet, så vi studerede deres interaktion med positivt ladede mannose-K

10, som indeholder ti lysinrester kæde. Mannose-K

10 ved 3 mM koncentration påvirkede ikke tumorvækst og tilsætning af LPS (0,5 mg /ml) forårsagede ikke additive eller synergi. En lav effekt (32,7% gennemsnitlig reduktion af tumorvækst i forhold til kontrol) blev bemærket under anvendelse af 3 mM opløsning af mannose- (G)

5) – (K)

12) i PBS, dvs. forbindelsen med 5 glycin Resten spacer mellem liganden og forankringsdelen af ​​molekylet. Denne reduktion var statistisk signifikant (sammenlignet med kontrollen) kun på dag 6 i terapi (data ikke vist).

Tilsætning af en lipofil anker (mannose- (G)

5- (K)

10) -STE) førte til en yderligere reduktion i tumorvækst. En opløsning af denne forbindelse i PBS (3 mM) forårsagede en statistisk signifikant reduktion af tumorvækst (figur 1B). Mean reduktion af tumorvækst var 75,6%. Tilsætning af LPS (0,5 mg /ml) forårsagede ingen additivitet eller synergi omvendt gennemsnitlig reduktion på tumorvækst faldet til 71,2%. Virkningen af ​​LPS alene forblev den stærkeste. Mus blev aflivet 14 dage efter begyndelsen af ​​behandlingen. Opløsningen af ​​mannose- (G)

5- (K)

10-STE fuldt undertrykt udseende af metastaser. Forekomst og intensitet af metastaser er opsummeret i tabel 2.

Virkningen af ​​forankrede mannan (mannan-BAM) på tumorvækst og dens samspil med LPS.

Mus blev behandlet med mannan -BAM, LPS og en blanding af de to (fig 1C). Mannan-BAM forårsagede en svag (50,5%), men statistisk signifikant reduktion af tumorvækst. Virkningen af ​​LPS var lidt højere (gennemsnitlig reduktion af tumorvækst var 63,2%). En kombination af begge forbindelser forårsagede en stærk synergistisk reduktion af tumorvækst (88,6% sammenlignet med kontrol) og tumorer tidsmæssigt forsvandt i 80% af musene. Faldet af tumorvækst forårsaget af mannan-BAM /LPS-blanding var oprindeligt statistisk signifikant sammenlignet med både kontrol- og både individuelle bestanddele af blandingen, senere kun med kontrollen. Forlængelse af musenes overlevelse, skyldes behandlingen med blandingen af ​​mannan-BAM /LPS, var ikke statistisk signifikant.

Synergy af mannan-BAM med LPS, forskellige regimer anvendelsesområder.

An optimal ordning blev bedst opnås ved puls intratumoral anvendelse af 50 pi af 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) blandingen på dag 0, 1, 2. 8, 9, 10,16, 17, 18,24, 25, 26 . Denne ordning forårsaget ikke blot signifikant reduktion af tumorvækst (94,7%), men også statistisk signifikant forlængelse af overlevelse (P≤0.005), se figur 2. En overlevelsesprocent 80% i 100 dage blev observeret.

Blanding af 0,2-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS blev påført det i puls regime (dag 0,1,2. 8,9,10.16,17,18.24,25,26). Både behandlet gruppe og kontrolgruppe indeholdt 5 mus hver. *** Angiver P≤0.005 forhold til kontrol.

Anvendelse af anden form for mannan binding til celleoverfladen.

Direkte kovalente

in vivo

binding af 0,2 mM mannan-SMCC til celler (primært reduceret med TCEP) blev testet. Mannan-SMCC blev administreret sammen med LPS (0,5 mg /ml). Som vist i tabel 3, blev der observeret høje reduktion af tumorvækst og højt forhold mellem mus med midlertidige forsvindende tumorer. Brugen af ​​fire terapeutiske impulser af mannan-SMCC /LPS-blanding forårsagede næsten statistisk signifikant forlængelse af overlevelse. Kun i dette tilfælde, overlevelse længere end 100 dage blev observeret.

Kontrol eksperimenter.

Som tidligere nævnt, gratis mannose reducerede ikke tumorvækst. Dets blanding med LPS også viste ingen tegn på additivitet eller synergi, al tumor reducerende virkning af blandingen svarede til virkningen af ​​LPS alene. De samme resultater blev opnået med fri mannan (data ikke vist). Afprøvning af nye forankring principper (elektrostatiske interaktioner, celle reduktion af TCEP og SMCC bindende) afslørede ikke nogen antitumoraktivitet og kombination med LPS viste ingen tegn på additivitet eller synergi så godt. BAM forankring afslørede ikke nogen anticancer aktivitet som allerede beskrevet. Hvad angår (G)

5- (K)

10-STE, som beskrevet nedenfor, ikke anticanceraktivitet blev forbundet med denne type af forankring samt.

Virkningen af ​​formylpeptide receptoragonister i cancer terapi

Betydningen af ​​forankring af formylpeptide receptoragonister.

indflydelsen af ​​LPS. I det første eksperiment blev agonister af formylpeptide receptorer bundet til tumoren cellens overflade på grundlag af ladningsinteraktion som allerede nævnt ovenfor. f-MLF- (K)

12 blev anvendt som en agonist. Selv ved 3 mM koncentration, var det ikke reducere væksten af ​​melanom. Agonisten virkning blev forøget ved anvendelse af et afstandsstykke (5 glycinrest kæde), hvilket muliggør højere fleksibilitet af terminalen f-MLF gruppe. Strukturen af ​​den ovennævnte forbindelse var f-MLF- (G)

5- (K)

12. Som vist i figur 1D, f-MLF- (G)

5- (K)

12 opløsning forårsagede svag, men ikke desto mindre statistisk signifikant reduktion af tumorvækst (gennemsnitlig reduktion af tumorvækst var 59,7%), der blev signifikant forøget ved tilsætning af LPS til 78,3% gennemsnitlig reduktion af tumorvækst. F-MLF- (G)

5- (K)

12 /LPS interaktion bør overvejes lidt additiv, som deres blanding viste kun en lidt højere effekt end den mere effektiv komponent af blandingen.

molekyle formylpeptide agonist blev yderligere modificeret. Ladningsinteraktioner blev koblet med forankring af alifatiske kæde i lipidlag af cytoplasmatiske membran. Strukturen af ​​denne forbindelse var f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE. Som vist i figur 1E, F-MLF- (G)

5- (K)

10-STE fungerer sammenligneligt (55,0% gennemsnitlig reduktion af tumorvækst) som forbindelsen uden stearinsyre, anvendes i tidligere forsøg ( 59,7%). Kombination af f-MLF- (G)

5- (K)

10-STE med LPS førte til en stærk synergistisk virkning, som viser markant reduktion af tumorvækst (98,7%). Denne reduktion var statistisk signifikant i sammenligning med begge komponenter i blandingen. Tumorer i fem af seks mus (83,3%), midlertidigt forsvundet. Stigningen i overlevelsestid i denne gruppe var statistisk signifikant (p ≤ 0,05).

Anvendelse af andre former for binding af f-MLF til celleoverfladen.

En række forsøg afsløret der forankret 0,5 mM f-MLF motiv i blanding med LPS (0,5 mg /ml) er tilstrækkelig til kraftig reduktion af tumorvækst. Ved hjælp af disse koncentrationer og forskellige måder at forankre og timing, vi udførte eksperimenter med det mål at finde de bedste betingelser for den stærkeste antitumorvirkningen.

Resultaterne er sammenfattet i tabel 4. Forsøg bekræftede den væsentlige betydning af kort, men tilstrækkeligt effektive indledende behandling, hvor blanding af 0,5 mM f-MLFKK-DOPE og LPS (0,5 mg /ml) viste sig at være den bedste. 60% af mus behandlet på denne måde overlevede 100 dage, lever videre uden patologiske symptomer.

eksperimenter Kontrol.

Gratis 3 mM f-MLF ikke viser nogen reduktion af tumorvækst og reduktion aktivitet af dets blanding med LPS svarede til aktiviteten af ​​LPS alene. Data er ikke vist. Ankre (DOPE som lysin-DOPE, (G)

5- (K)

10-STE som immunologisk inaktivt MLF- (G)

5- (K)

10-STE) ikke vise nogen antitumorvirkning og kombinationer med LPS viste ingen tegn på additivitet eller synergi.

Analyse af cellen infiltrere i tumorer ved hjælp af flowcytometri. Cytokinassays

Tre eksperimenter af samme design blev udført med tre forskellige fagocytiske receptorligander:. Laminarin-BAM, mannan-BAM og f-MLFKK-BAM alene eller i kombination med LPS

alle eksperimenter 3 mus fra hver gruppe (se forklaringen til figur 3, 4, 5, 6) blev dræbt i 12, 24 og 48 timers intervaller (+3 kontrolmus blev aflivet ved tid 0). Celler til flowcytometri og supernatanter til ELISA blev fremstillet og analyseret.

Grupper af 9 mus modtog en enkelt dosis på 0,2-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af 0,2 mM laminarin-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS alene i 50 pi det 3 mus fra hver gruppe blev dræbt i 12, 24 og 48 timers intervaller blev celler fra udskårne tumorer fremstilles ved enzymatisk behandling (Liberase DL og DNase I) og analyseret ved flowcytometri. For granulocyt påvisning anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 blev anvendt.

Grupper af 9 mus modtog en enkelt dosis på 0,2-BAM i PBS, LPS (0,5 mg /ml PBS), blanding af 0,2 mM mannan-BAM og LPS (0,5 mg /ml) i PBS, og PBS alene i 50 pi it 3 mus fra hver gruppe blev dræbt i 12, 24 og 48 timers intervaller blev celler fra udskårne tumorer fremstilles ved enzymatisk behandling (Liberase DL og DNase I) og analyseret ved flowcytometri. Følgende mærkede antistoffer blev anvendt: (A) anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) Alexa Fluor 700 for granulocyt påvisning, (B) anti-muse CD19 APC til påvisning af B-lymfocytter og (C) anti-Mouse NK1. 1 PE for NK-celler.

grupper af 9 mus fik en enkelt dosis på 0,5-MLFKK-BAM, LPS (0,5 mg /ml), blanding af 0,5 mM f-MLFKK-BAM og LPS ( 0,5 mg /ml), og PBS alene i 50 pi it Fremstilling af cellesuspension og granulocyt-farvning blev udført som i figur 3.

Grupper af 9 mus modtog en enkelt dosis på 0,5-MLFKK-BAM, LPS (0,5 mg /ml), blanding af 0,5 mM f-MLFKK-BAM og LPS (0,5 mg /ml), og PBS alene i 50 pi it 3 mus fra hver gruppe blev dræbt i 12, 24 og 48 timers intervaller. Efter fremstilling af celler fra udskårne tumorer blev tilsvarende supernatanter anvendt til IL-1 beta bestemmelse. IL-1 beta værdierne er udtrykt som pg af IL-1 beta /mm

3 i tumorvæv.

Terapi baseret på anvendelse af laminarin-BAM, LPS og deres blanding.

Ændringer i granulocyttal (GR1 +) kun blev observeret i den overvågede periode.