PLoS ONE: Kvantificering af Alternativ splejsning varianter af human Telomerase revers transkriptase og Korrelationer med Telomerase Aktivitet i Lung Cancer

Abstrakt

Telomerase spiller vigtige roller i udviklingen og progressionen af ​​maligne tumorer, og dets aktivitet er primært bestemt ved transkriptionel regulering af human telomerase revers transkriptase (hTERT). Adskillige mRNA alternative splejsning varianter (ASV’er) for hTERT er blevet identificeret, men det er fortsat uklart, om telomerase aktivitet er direkte forbundet med hTERT splejsning udskrifter. I denne undersøgelse har vi udviklet nye real-time PCR-protokoller under anvendelse af molekylære beacons og påføres lungecarcinoma cellelinjer og cancervæv til kvantificering af telomeraseaktivitet og tre væsentlige hTERT sletning transkripter hhv. Resultaterne viste, at lunge- carcinoma cellelinier konsekvent demonstreret telomeraseaktivitet (14.22-31.43 TPG enheder pr 100 celler) og forskellige hTERT alternativ splejsning transkripter. For 165 lungekræfttilfælde viste telomerase aktivitet signifikant sammenhæng med tumor differentiering (poorly- moderately- godt-opdelte, P 0,01) og med histotypes (kombineret småcellet og planocellulært karcinom planocellulært karcinom adenosquamøst carcinoma adenocarcinom, P 0,05). Skønt de overordnede hTERT transkripter blev detekteret i alle prøverne, var de ikke forbundet med telomeraseaktivitet (r = 0,092, P = 0,24). Telomeraseaktivitet blev signifikant korreleret med den transkriptionelle bestanddel forhold mellem α-deletion (r = -0,267, p = 0,026), β-deletion (r = -0,693, p = 0,0001) og γ-deletion (r = -0,614, P = 0,001). Den positive sats og gennemsnitlig konstituerende forhold mellem β-sletning udskrifter (92,12%, 0,23) var højere end α-sletning (41,82%, 0,12) eller γ-sletning (16,36%, 0,18) udskrifter. Den kombinerede småcellet og planocellulært karcinom udtrykte mindre sletning udskrifter, især β-sletning, end andre histotypes, som kan forklare deres højere telomerase-aktivitet. Afslutningsvis de molekylære beacon-baseret real-time PCR-protokoller er hurtige, følsomme og specifikke metoder til at kvantificere telomerase-aktivitet og hTERT ASV’er. Telomerase-aktivitet kan tjene som en pålidelig og effektiv molekylær markør til brug ved vurderingen af ​​histologiske undertype og differentiering af lunge karcinomer. Yderligere undersøgelser af hTERT sletning splejsning udskrifter, snarere end de overordnede hTERT udskrifter, kan forbedre vores forståelse af telomerase regulering

Henvisning:. Liu Y, Wu Bq, Zhong Hh, Tian Xx, Fang Wg (2012) Kvantificering af Alternativ splejsning varianter af human Telomerase revers transkriptase og Korrelationer med Telomerase aktivitet i lungekræft. PLoS ONE 7 (6): e38868. doi: 10,1371 /journal.pone.0038868

Redaktør: Chi Zhang, University of Texas Southwestern Medical Center, USA

Modtaget: Februar 11, 2012; Accepteret: 15. maj 2012; Udgivet: 18 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til WG Fang fra 973 Program (2010CB529402) fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Normale somatiske celler undergår en såkaldt cellulære ældning på grund af progressiv telomer afkortning efter hver celledeling. Aktivering af telomerase menes at være ansvarlig for at opretholde tilstrækkelig telomert længde i tumor eller stamceller. Disse celler har overvundet denne proliferative blok ved at udtrykke enzymet telomerase, som giver celler med evnen til at dele sig kontinuerligt. Således regulering af telomerase-aktivitet har store konsekvenser for mange udviklingsmæssige processer, herunder celledeling, differentiering og aldring samt tumorigenese. Telomerase aktivitet er blevet påvist i næsten 90% af alle menneskelige maligniteter, hvilket gør det til et oplagt mål for kræft diagnostiske og terapeutiske strategier.

Den menneskelige telomerase revers transkriptase (hTERT) er en væsentlig bestanddel af den holoenzymkompleks der tilføjer telomert gentager til enderne af kromosomer. Ekspressionen af ​​normal fuld-længde hTERT korrelerer godt med telomeraseaktivitet og synes at være det hastighedsbegrænsende faktor for telomerase aktivitet i humane celler. HTERT-genet består af 16 exons og spænder ~37 kb af genomisk DNA, hvoraf ~33 kb er intronsekvenser og de resterende ca. 4 kb svarer til hTERT mRNA transkriptet. For nylig blev der fundet tre vigtigste alternative splejsning varianter (ASV’er) i revers transkriptase motiver af hTERT at være involveret i kontrollen af ​​telomerase-aktivitet: i) α-sletning: mangler 36 bp fra exon 6 herunder motiv A; ii) β-deletion: mangler 182 bp fra exon 7 og 8, hvilket fører til en nonsense mutation og trunkering af proteinet før de konserverede RT motiver; iii) γ-deletion: mangler 189 bp fra exon 11 inden motiver D og E [1]. Der er flere mulige kombinationer af disse alternative splejsningssites, der resulterer i et stort antal potentielle splejsnings- transkripter, men dem med mere end to splejsningssteder er ustabile og nedbrydes for hurtigt, der skal detekteres. Fordi a, p og γ sletning transkripter fører til trunkeringer eller mutationer i revers transkriptase domæne væsentlige for katalytisk aktivitet, de er enten ikke-funktionelt (β-deletion eller γ-deletion) eller selv har dominant negative virkninger (α-deletion) [1 ] – [4]. Derfor er sammenhængen mellem hTERT genekspression og telomerase-aktivitet er kompliceret.

Telomerase aktivitet og hTERT udtryk blev fundet i 67-85% og 48-95% af lungetumorer henholdsvis [5], [6], og begge var signifikant forbundet med dårlig samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [6], [7]. Men forholdet mellem telomerase aktivitet eller hTERT og klinisk-patologiske variabler var kontroversiel. Lantuejoul S og medarbejdere rapporterede, at hTERT-ekspression var signifikant lavere i adenocarcinom (ADC) end i pladecellecarcinom (SCC), basaloid carcinom og småcellet lungecancer og telomeraseaktivitet var lavere i trin I lungecarcinomer end i andre faser (II- IV) [5]. Wu TC og kolleger viste, at hverken telomerase-aktivitet eller hTERT udtryk i NSCLCs var korreleret med klinisk-patologiske karakteristika såsom kvalitet, tumor etaper, tumortyper eller TNM værdier [8]. Især de fleste tidligere studier kun testet telomerase aktivitet eller overordnede hTERT udskrifter, og ikke skelne mellem de forskellige splejsning variant udskrifter. I den foreliggende undersøgelse, en real-time telomer repeat amplifikationsprotokol (TRAP) med en revers primer-bundet probe (RPP), en slags molekylær beacon probe kæmning den reverse primer og fluorescens-mærket probe i et molekyle, blev udviklet til telomerase aktivitet kvantificering i lunge tumorcellelinjer og væv. En anden real-time PCR assay med molekylære beacons blev udviklet til analyse ekspressionsniveauerne af hTERT ASV’er i de samme prøver. undersøgte derfor vi karakterisering af telomerase-aktivitet og hTERT sletning splejsning transskription i lungekræft, som kan give vigtige oplysninger for forståelsen af ​​telomerase regulering i tumorigenese.

Metoder

Tumor Materiale og cellelinier

Tumor prøver blev opnået fra 165 lungekræftpatienter (115 mænd, 50 kvinder, median alder, 60 år, interval, 31-79 år). Inden for 10 minutter efter operationen, blev vævene uden nekrose og blødning dissekeret fra tumoren, efterfulgt af flash-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70 ° C. En del af hver prøve blev underkastet konventionel histologisk undersøgelse for at sikre, at prøverne indeholdt mindst 80% tumorceller. Diagnose, sortering og patologisk TNM (Tumor, Node, Metastaser) iscenesættelse blev bestemt uafhængigt af to erfarne patologer ifølge WHO og UICC klassificering.

Den menneskelige ikke-lille lungekræft-cellelinjer A549, H1299, SPC-A1 og PAA blev anvendt som positive kontroller for telomeraseaktivitet og hTERT-genekspression. PAA blev etableret fra en kinesisk patient med lungeadenocarcinom og holdt i vores laboratorium, mens andre cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), suppleret med 100 mL /L varmeinaktiveret kalvefosterserum (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), ved 37 ° C under 5% CO

2. Celler ved 80-90% konfluens blev høstet med 0,25% trypsin-EDTA og vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4). Efter celletælling, cirka 10

6 celler blev vasket to gange med PBS og pelleteret ved centrifugering ved 2000 g i 5 minutter ved 4 ° C. Cellepellets blev opbevaret ved -70 ° C for telomerase-analysen inden for seks måneder.

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Peking University Board Institutional Review med godkendelse nr IRB00001052- 10004. Alle deltagere i denne undersøgelse har givet skriftligt samtykke, som har været klageproceduren af ​​den etiske komité.

Primere og probe Design

Den traditionelle TRAP er en to-trins assay, hvor telomerase tilføjer telomere gentagelser på 3′-enden af ​​substratet oligonucleotid, og derefter de udvidede produkter amplificeres ved polymerasekædereaktion (PCR) under anvendelse af TS og en revers primer komplementær til de telomere gentagelser. I denne undersøgelse blev en real-time TRAP-assay udviklet ved anvendelse af en revers primer-bundet probe (RPP), der kombinerede den reverse primer og fluorescens-mærket probe i et molekyle. Princippet i denne RPP-baseret real-time TRAP assay afbildet i fig. 1. reverse primer-bundne probe blev syntetiseret ved Biosearch Technologies (Novato, CA, USA). Kvantificering af telomeraseaktivitet blev opnået ved overvågning af fluorescerende signaler, der udsendes fra de regionale beskyttelsesprogrammer, som var blevet inkorporeret i fælden produkter (Figur S1). Molekylære beacons til kvantificering af hTERT samlet eller sletning udskrifter spændte ikke-splejsning exons eller sletning sites henholdsvis ifølge GenBank NM_198253 (Figur S2). Primere og prober blev designet ved hjælp af Primer PREMIER 5.0 og OLIGO 6.0 software hhv. Deres sekvenser er vist i tabel S1. Delta entropi af den anden struktur i hver probe blev beregnet ved Mfold software (https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/) for at kontrollere stabiliteten af ​​stilk-løkke. Beaconprober for hTERT og Taqman probe til kontrol genet GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-genet) blev syntetiseret af Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Alle primersæt blev syntetiseret og oprenset ved AuGCT Bioteknologi (Beijing, Kina). Specificiteten af ​​PCR-amplifikationer blev vurderet ved 10% ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese.

Celleekstrakter svarende til de angivne antal A549-celler blev testet for telomeraseaktivitet. Resultater i gelelektroforese (til venstre), forstærkning plot (ovenfor) og standard kurver (nedenfor) konsekvent angivet den lineære sammenhæng mellem telomerase aktivitet og A549 celle nummer, mens fem repræsenterede en negativ kontrol.

Fast -tid Kvantificering Assay af telomeraseaktivitet

CHAPS lysepuffer blev fremstillet som tidligere beskrevet [9]. Cellepellets blev resuspenderet i iskold lysepuffer (5000 celler /ul) og inkuberes i 30 minutter på is. Efter centrifugering (12 000 g, 30 min, 4 ° C) blev supernatanterne opsamlet omhyggeligt og hurtigt nedfrosset ved -70 ° C. De lagrede vævsprøver blev delvist optøet og ca. 30 mg væv blev hakket under sterile betingelser indtil en glat konsistens var opnået. Prøven blev derefter overført til et sterilt 1,5 ml mikro-centrifugerør, og blandet med 200 pi CHAPS lysisbuffer. RNase inhibitor (Takara Biotechnology, Dalian, Kina, 100 enheder /ml) blev tilsat til CHAPS lysis buffer før ekstraktionen. Proteinkoncentrationen blev målt ved Bradford-metoden [10]. De endelige ekstrakter blev fortyndet til en koncentration på 2 ng /nl protein med lyseringspuffer og straks opbevaret i portioner ved -70 ° C.

Det samlede rumfang af reaktionsblandingen var 20 pi og indeholdt 1 × GoTaq flexi-buffer , 1,8 mM MgCl

2, 50 pM hver af dNTP, 160 nM modificeret substrat oligonucleotidprimer (MTS), 140 nM revers primer-bundet probe, 1unit af GoTaq DNA-polymerase (Promega Corporation, Madison, WI, USA), og 1 pi telomerase ekstrakter. PCR blev udført under anvendelse af en ABI StepOne Real-Time Cycler (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA). Efter 30 minutters inkubation ved 30 ° C i telomerase forlængelse, blev reaktionsblandingen opvarmet til 95 ° C i 3 minutter for at inaktivere telomerase, efterfulgt af en 40-cyklus amplifikation (94 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek herunder 10- sek plade læsning). Ti mikroliter af hver prøve ekstrakt blev inkuberet ved 95 ° C i 10 minutter og derefter dens en tiendedel volumen blev tilsat til en anden parallel reaktion som varmen-inaktivering kontrol. I hvert eksperiment blev 1 pi CHAPS lysisbuffer stedet for proteinekstrakt anvendt som en negativ kontrol.

TSR8 er et oligonukleotid identisk med MTS primeren forlænges med otte telomere gentagelser AG (GGTTAG)

7, som kan anvendes som en standard til at anslå mængden af ​​MTS primere med telomere gentagelser af telomerase forlænget i en given ekstrakt. Endvidere påvisning af TSR8 indikerer, at amplifikation trin af TRAP-assayet blev udført effektivt [11]. For at udføre TRAP-assayet, 1 pi hver TSR8 fortynding (0,2 Amol /pi, 0,04 Amol /pi, 0,008 Amol /pi og 0,0016 Amol /pi, henholdsvis) blev anvendt til opnåelse af standardkurven, ved hvilken 0,001 Amol TSR8 svarer til hver enhed af TPG (Total Production Genereret). For en gyldig analyse har passende kontroller medtaget i hver assay:

i) varme-inaktivering kontrol: ekstrakten alikvot opvarmet til 95 ° C i 10 minutter; ii) negativ kontrol: lysepuffer erstattes proteinekstrakt og iii) positiv kontrol: telomerase-positive celleekstrakter. Undertiden, kunne kun påvises positive telomeraseaktivitet i den fortyndede ekstrakt og kan ikke påvises i mere koncentrerede ekstrakter fordi vævet ekstrakt kan indeholde Taq-polymerase inhibitorer. Så for hver vævsprøve blev mindst tre proteinkoncentrationer (2 ug /uL, 0,2 ug /ul, 0,02 ng /nl) testet in duplo, hvor den højeste TPG værdi blev betragtet som den endelige telomeraseaktivitet.

RNA-ekstraktion og Real-time RT-PCR-analyse af hTERT ASV’er

Totalt cellulært RNA blev ekstraheret fra frosne prøver med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. RNA kvalitet blev vurderet ved denaturerende agarosegelelektroforese. Kun prøver med skarpe 18 S og 28 S rRNA-bånd og uden nedbrydning blev anvendt til yderligere analyse. To mikrogram RNA fra hver prøve blev anvendt til cDNA-fremstilling under anvendelse af M-MLV revers transkriptase og vilkårlige hexamerer (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Den fortyndede cDNA (1:10 fortynding) blev anvendt til amplifikation af kontrol GAPDH at vurdere revers transkription effektivitet samt RNA integritet.

Real-time PCR blev udført i et totalt volumen på 15 pi indeholdende 1 × GoTaq flexi buffer, 5 mM MgC

2, 200 uM af hver af dNTP, 1 enhed GoTaq DNA-polymerase, 800 nm primere (frem og bak), 400 nm sonder og en pi fortyndet cDNA (1:10 fortynding). Annealingstemperaturen var forskellige for forskellige ASV. Den cyklus-forløb bestod af 3 min indledende denaturering ved 95 ° C, og en 40-cyklus amplifikation (94 ° C i 15 sek, annealing temperatur i 60 sek herunder pladeaflæsningsspektrofotometer). Ved testning hver ASV transkript med specifikke primer sæt, to transkriptionelle produkter, med eller uden deletion, vil blive forstærket samtidig, men Beacon probe kun hybridiserede med sletningen transskriptionelle produkt og udsendte fluorescens [12]. Ct-værdi af hver hTERT splejsningsvariant blev normaliseret til Ct-værdien af ​​GAPDH ved subtraktion af GAPDH Ct-værdi fra målet Ct-værdi. Den relative ekspression niveauet for hvert mål PCR blev beregnet ved anvendelse af ligningen [13]: Relativ ekspression = 2

– [Ct (mål) -Ct (GAPDH)] × 10000. HTERT ASV konstituerende forhold (beregnet ved at dividere den relative ekspression værdien af ​​de samlede udskrifter af den for ASV’er) blev også bestemt for hver vævsprøve.

Statistisk analyse

Grundlæggende beskrivende statistiske data var opnået under anvendelse af SPSS 11.0 softwaren. Spearman s korrelationskoefficienter (r) blev beregnet til at vurdere foreninger blandt telomerase aktivitet, hTERT ASV udtryk og klinisk-patologiske data. Forskelle i telomeraseaktivitet eller kvantitativ hTERT-ekspression mellem de analyserede undergrupper blev evalueret ved den uparrede t-test eller envejs ANOVA. En p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

kvantificering af Telomerase Aktivitet og hTERT ASV’er i tumorcellelinier

følsomhed og linearitet RPP-baserede real. -tids TRAP-assay blev evalueret med ikke-småcellet lungekræft A549. Cellepellets indeholdende ca. 10

6 celler blev resuspenderet i 200 pi CHAPS lysepuffer, så ekstrakterne svarede til telomeraseaktivitet på 5000 celler pr mikroliter. Telomerase ekstrakter blev serielt fortyndet fra 1000 til 1 celle pr mikroliter, og 1 pi ekstrakt blev anvendt i kvantificeringen af ​​telomeraseaktivitet i triplikater. Telomerase i ekstrakter ville tilføje telomere gentagelser på 3′-enden af ​​substratet oligonukleotid (MTS) i det første inkubationstrin, og produkterne blev amplificeret som template i den efterfølgende PCR-processen. Som vist i figur 1, ved anvendelse af TRAP-polyacrylamidgelelektroforese (TRAP-PAGE) assay, kunne påvises telomeraseaktivitet i mindst ti A549-celler, indikeret ved tilstedeværelsen af ​​en synlig hexanukleotid stige af PCR-produkter på polyacrylamidgel. Men ved hjælp RPP-baseret real-time TRAP assay kan telomeraseaktivitet påvises, i så få som én A549 celle. En lineær sammenhæng blev også observeret mellem telomeraseaktivitet og logaritmen af ​​antallet af celler i området fra 1 til 1000 celler. Korrelationskoefficienten beregnet ud fra den lineære regressionsmodel var op til 96,4%. Herunder telomerase udvinding, kunne RPP-baseret real-time TRAP assay være færdig inden for tre timer, mens TRAP-PAGE ville tage mindst 5 timer. Vigtigere er det, RPP-baseret real-time TRAP-assay var nøjagtigt kvantitativ og reproducerbar. Som vist i tabel 1, cellelinjer A549, H1299, SPC-A1 og PAA konsekvent demonstreret telomeraseaktivitet fra 14.22 til 31.43 TPG enheder pr 100 celler.

Molekylære beacons er sensitiv og specifik, fordi proberne ikke hydrolyseres i amplifikation og kun genkende de perfekt komplementære mål. I kvantificering af hTERT ASV’er, det molekylære beacon probe annealer til de tilsvarende transkripter og overvåger syntesen af ​​de specifikke nukleinsyrer i realtid. For eksempel sonden H1810 er komplementær til DNA-sekvensen i krydset af exon 3 og exon 4 af hTERT-genet, og ville hybridisere til alle de hTERT transkripter og derfor detektere overordnede hTERT transkripter, herunder normale og variante splejsning transkripter. Imidlertid proben A2173, B2331 og R2699 kun registrere a, P eller γ deletion transkripter hhv. Ved anvendelse af nyudviklede kvantificering protokol, i SPC-A1-celler, blev alle de tre deletion splejsnings- transskripter detekteret, med forholdet 0,21, 0,26 og 0,04 for a, P eller γ deletion transkripter (tabel 1 og figur 2), som ville fremkalde partielle ikke-funktionelle udskrifter og kan forklare den lave telomerase-aktivitet. I andre cellelinjer, blev γ-sletning udskrift ikke påvist, og ekspressionsniveauerne af α-deletion udskrifter (interval, 0,25-0,44) var højere end p-sletning udskrifter (tabel 1).

Repræsentant lineær forstærkning kurver blev vist til kvantitativ påvisning af samlet hTERT (A), α-deletion (B), β-deletion (C) og γ-deletion (D) transkripter hhv. GAPDH tjente som en intern kontrol. NC:. Negativ kontrol

kvantificering af Telomerase Aktivitet og hTERT ASV’er i Lunge tumorprøver

I TRAP analysen af ​​tumorvæv prøve, resultaterne i både polyacrylamid gelelektroforese og forstærkning kurver af RPP-baseret real-time TRAP angivet det lineære forhold mellem telomeraseaktivitet og logaritmen til koncentrationen protein (figur 3). I et tilfælde af pladecellecarcinom, kunne telomeraseaktivitet detekteres ved en proteinkoncentration så lav som næsten 0,002 ng /nl. At få pålidelige kvantitative TRAP resultat blev mindst tre proteinkoncentrationer (0,02, 0,2 og 2 ug /uL) i to eksemplarer for hver tumor prøve analyseret med to separate forsøg.

seriefortyndet proteinekstrakter fra 2 ug til 0,0002 ug blev testet for telomeraseaktivitet i et tilfælde af pladecellecarcinom. Resultater i gelelektroforese (til venstre), forstærkning plot (ovenfor) og standard kurver (nedenfor) konsekvent angivet den lineære sammenhæng mellem telomerase-aktivitet og protein koncentration, mens 6 repræsenterede en negativ kontrol.

I alt 165 enheder af lunge tumorvæv, telomeraseaktivitet varierede fra 0.39-482.46 TPG enheder (tabel 2). Den gennemsnitlige telomeraseaktivitet i mandlige patienter var signifikant højere end den hos kvindelige patienter (P = 0,006). Telomeraseaktivitet var negativt associeret med tumor differentiering (r = 0,022, P = 0,005), i hvilken de ringe differentierede tumorer viste den højeste telomeraseaktivitet. Telomeraseaktivitet var signifikant forskellige blandt de fire vigtigste histologiske fænotyper af lungecarcinomer (P = 0,001), som også blev evalueret i par. Den kombinerede småcellet og pladecellecarcinom (CSS) viste den højeste telomeraseaktivitet (vs. tre andre histotypes, P = 0,001), efterfulgt af SCC og adenosquamøst carcinom (ASC) (vs. tre andre histotypes, P = 0,025 henholdsvis), mens Adc viste den laveste telomerase-aktivitet (vs. andre tre histotypes, P = 0,001). Ingen sammenhæng mellem telomerase aktivitet og TNM stadie blev fundet i denne undersøgelse (P 0,05)

Kvantificering af de overordnede og sletning splejsning hTERT udskrifter blev udført i alle tumorprøver.. I Spearman analyse, var der ingen signifikant korrelation mellem ekspressionen af ​​hTERT overordnede udskrifter og telomeraseaktivitet (r = 0,092, P = 0,241), og mellem ekspressionen af ​​hTERT overordnede transkripter og enhver clinicopathologic parameter (P 0,05). De a, p og γ sletning transkripter blev påvist i 41.82%, 92.12% og 16,36% af patienterne, og deres gennemsnitlige bestanddel 0,12, 0,23 og 0,18 hhv. Kun 16 patienter udtrykte alle tre deletion transskripter samtidigt. Det var bemærkelsesværdigt, at alle tre sletning udskrifter ‘konstituerende nøgletal var signifikant korreleret med telomerase-aktivitet, mens korrelationskoefficienten var -0,267 for α-sletning udskrift (P = 0,026), -0,693 for β-sletning udskrift (P = 0,0001) og -0,614 for γ-deletion transkript (P = 0,001), henholdsvis. Hos mandlige patienter, de gennemsnitlige konstituerende forhold af de tre deletioner var lavere end hos kvindelige patienter, i overensstemmelse med den højere telomeraseaktivitet blandt dem. Det er dog kun β-deletion og γ-deletion viste signifikant forskel mellem mandlige og kvindelige patienter (P = 0,006, P = 0,027, henholdsvis). Som for parvise sammenligninger mellem histologiske subtyper og tre deletion transkriptionel konstituerende forhold, viste CSS signifikant lavere bestanddel forhold i β-deletion (P = 0,011) og γ-deletion (P = 0,015) end ADC. SCC præsenterede kun lavere konstituerende forhold i γ-sletning (P = 0,006) end ADC. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem nogen deletion transkriptionel konstituerende forhold og tumor differentiering, stadium eller lymfeknudemetastase. Endvidere patienter med pleural metastase viste signifikant højere transkriptionel bestanddel forhold i β-deletion (P = 0,041), men ikke i to andre deletioner (P = 0,227 og P = 0,735 henholdsvis).

Diskussion

Da telomerase udtrykkes i næsten 90% af alle menneskelige kræftformer, har der været stor interesse for at udvikle en telomerase assay egnet til klinisk afprøvning [14]. Som et slutpunkt og semikvantitativ analyse, den traditionelle TRAP er lav-throughput, begrænset i nøjagtig kvantificering og sandsynligvis være falsk negativ, fordi PCR-amplifikation effektivitet kan hæmmes af proteinet i celleekstrakten. Kvantificering af telomerase-aktivitet ved hjælp af real-time analyse er mere præcis, fordi den bygger på Ct-værdier bestemt under den eksponentielle fase af PCR ved relativt lave koncentrationer af PCR-produkt før mætning eller plateau. Forrige real-time kvantitativ TRAP med fluorescerende farvestoffer eller Taqman probe mindre specifikt og mere begrænset i dens kvantitative potentiale på grund af ingen-til-en overensstemmelse mellem fluorescens og PCR-produktet [15], [16]. Her beskrev vi en hidtil ukendt kvantitativ TRAP-assay ved anvendelse af en revers primer-bundet probe (RPP). RPP er en molekylær omskifter til påvisning DNA-amplifikation ved anvendelse af energioverførsel mellem fluoroforen (FAM) og quencher (DABSYL). OFF til ON overgang forekommer, når konformationen af ​​RPP skifter fra en “lukket” intramolekylær hårnåle-struktur til en “åben” udvidet struktur. Denne strukturelle ændring opnås, når én RPP inkorporeres i et dobbeltstrenget DNA-molekyle ved PCR. Amplifikationen kan overvåges ved direkte måling af fluorescensen i reaktionsblandingen. I dette studie telomeraseaktivitet demonstreret tilfredsstillende lineære relationer med logaritmen af ​​dyrkede celle nummer eller proteinkoncentration i korrekt område. Telomerase-aktivitet kunne detekteres i så få som én dyrket tumorcelle eller så lav som 0,002 ug protein fra tumorvæv. I overensstemmelse med tidligere rapport, fluorescein-sonde-baseret real-time TRAP assay gav hurtigere, bedre resultater telomerase aktivitet kvantificering end traditionel TRAP med gelelektroforese [17]. I vores tidligere undersøgelse undersøgte vi telomeraseaktivitet af 60 lungekræft væv under anvendelse SYBR Green real-time TRAP, en relativ kvantitativ analyse, og kun fundet forskellen i telomeraseaktivitet mellem NSCLC og CSS [9]. I denne undersøgelse har vi anvendt den RPP-baseret real-time TRAP til et større antal lungetumorceller vævsprøver (165 tilfælde) og anvendes standardkurve-analyse. En væsentlig forskel i telomerase aktivitet blandt fire histologiske typer blev fundet: CSS Scc ASC ADC, hvilket var i overensstemmelse med Fujiwara rapport [18]. Ohmura og Maniwa har rapporteret højere telomerase aktivitet i NSCLC (42,3 og 75,24 TPG enheder henholdsvis), hvor de undersøgte 60 og 40 tilfælde henholdsvis, og brugte semi-kvantitativ metoder [19], [20]. Vi mener, at disse modsætninger kunne tilskrives mangfoldighed i populationer og stikprøvestørrelse, og især til de forskellige teknikker, der anvendes til at detektere telomerase-aktivitet. Det blev også modstridende i litteraturen om niveauet for telomeraseaktivitet blev korreleret med de aggressive klinisk-patologiske træk, såsom tumor differentiering og TNM stadie [6], [19] – [21]. Brug af RPP-baseret real-time TRAP, observerede vi en stærk sammenhæng mellem telomerase-aktivitet og tumor differentiering. Det var interessant, at forskellen i telomeraseaktivitet af mandlige og kvindelige patienter blev observeret i dette studie. At kvindelige patienter primært led af ADC, som havde lavere telomerase-aktivitet end andre undertyper, kan bidrage til deres lavere telomerase aktivitet end mandlige patienter. Synes således telomeraseaktivitet at være en nyttig markør ved bestemmelse histologiske type og differentiering i lungecarcinomer.

Nogle forfattere hævdede, at påvisningen af ​​hTERT-mRNA ved RT-PCR eller in situ hybridisering kan anvendes til at evaluere telomerase aktivitet [5]. Men den transkriptionelle og posttranskriptionel regulering af hTERT var kompleks og ikke fuldt belyst. Tidligere blev primersæt eller Taqman probe der spænder over deletionsstedet anvendes i de fleste undersøgelser for splejsningsvariant undersøgelser [22] – [26]. disse primersæt eller prober kan dog forstærke både i fuld længde transkripter og sletning transkripter grund af den forskudte annealing med blandede skabeloner. I den foreliggende undersøgelse har vi udviklet en kvantitativ analyse ved hjælp af molekylære beacons og detekteres alle tre deletion transkripter i SPC-A1-celler. Vi fandt en relativ høj bestanddel forhold (interval, 0,21-0,44) for α-sletning udskrifter i de fire lunge cancer cellelinjer, hvilket ikke er i overensstemmelse med de data, der viser lavere konstituerende forhold (interval, 0,06-0,15) tidligere [1] , [25], [27]. Dette kan tilskrives til vores anvendelse af mere specifikke molekylære beacon, snarere end de semikvantitative nestede PCR-assays. Mønstrene af hTERT ASV’er viste sig at variere i bryst, lever, mave, tyktarm, skjoldbruskkirtlen og lungetumorer, hvor de positive satser hTERT ASV’er var sandsynligvis overvurderet med en uddybning af et område, der spænder over både deletionssteder [1], [11] [21] – [24], [26], [28]. Vores kvantitativ analyse for hver sletning udskrift giver en løsning til nøjagtigt kvantificere ASV udtryk og evaluere sit forhold til klinik-patologiske parametre.

I denne undersøgelse blev der ikke observeret nogen sammenhæng mellem den overordnede hTERT udskrifter udtryk og telomerase-aktivitet, i overensstemmelse med tidligere rapporter i andre tumorer [29], [30], hvilket indikerede, at det ikke var rimeligt at erstatte den samlede hTERT mRNA detektion for evaluering telomerase-aktivitet. Vi fandt, at mere end 92% af patienterne udtrykte mindst en deletion transkription, men kun 9,7% udtrykt alle de tre deletion transkripter. Især blev de konstituerende forhold af de tre deletion transskripter signifikant korreleret med telomeraseaktivitet. De β-deletion transkripter var de mest almindelige splejsningsvarianter i de fleste lungecarcinomer og viste den stærkeste korrelation med telomeraseaktivitet. Dette svarer til de tidligere resultater i andre tumortyper [11], [22] – [24], [26].