PLoS ONE: megakaryocytisk forstærkende Factor og Ældre Mesothelin stimulere væksten af ​​en lungekræft cellelinie i bughulen af ​​mus

abstrakt

mesothelin (

MSLN

) genet koder for et 71 kilodalton (kDa) precursor protein, som forarbejdes til megakaryocytisk forstærkende faktor (MPF), en 31 kDa protein, som secerneres fra cellen, og moden mesothelin (mMSLN), en 40 kDa celleoverfladeprotein. Den mMSLN binder til CA125, en interaktion, der er blevet impliceret i den intra-cavitary spredning af mesotheliom og ovariecancer. For bedre at definere den rolle, MPF og mMSLN blev væksten af ​​lungekræft cellelinje A549 evalueret i svækket immunforsvar mus med inaktivering af

Msln

gen. Vi observerede, at

Msln

– /- mus xenotransplanteret med intraperitoneale A549 tumorer overlever væsentligt lange end tumor-bærende

Msln + /+

mus. Når tumor-bærende

Msln

– /-

mus

suppleres med rekombinant MPF (og i mindre grad mMSLN), er det meste af denne overlevelse fordel tabt. Disse undersøgelser viser, at MPF og mMSLN har en vigtig rolle i væksten af ​​lungekræft celler

i

vivo

og hæve den mulighed, at inaktivering af MPF kan være en nyttig behandling for lunge- og andre MSLN udtrykke kræftformer

Henvisning:. Zhang J, Bera TK, Liu W, Du X, Alewine C, Hassan R, et al. (2014) megakaryocytisk forstærkende Factor og Ældre Mesothelin stimulere væksten af ​​en lungekræft cellelinie i bughulen af ​​mus. PLoS ONE 9 (8): e104388. doi: 10,1371 /journal.pone.0104388

Redaktør: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, USA

Modtaget: April 24, 2014 Accepteret: 12 juli 2014; Udgivet: 13 August, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mesothelin

(MSLN)

genet koder en afstamning begrænset tumorantigen, der er udtrykt i normal mesotelceller foring lungehinden, bughinden og hjertesækken. Det er også højt udtrykt i epitheliod mesotheliomas, som er afledt fra normale mesotelceller, og aberrerende i mange andre cancerformer, herunder ovarie-, pankreas-, lunge-, mave-, cholangiocarcinom og tredobbelt negativ brystcancer [1] – [4].

MSLN

gen koder for et 71 kDa precursor protein, som forarbejdes i to modne proteiner: megakaryocytiske potensering Factor (MPF) og moden MSLN (mMSLN). MPF er en 31 kDa glycoprotein, som udskilles fra cellen ind i blodet. Den mMSLN er en 40 kDa glycoprotein protein, der forbliver bundet til cellemembranen ved phosphatidylinositol [5], [6], men kaster fra celleoverfladen over tid via virkningen af ​​TNF-α-omdannende enzym (fig. 1) [7 ]. Den mMSLN er blevet vist at binde til MUC16 (CA125); denne interaktion er blevet impliceret i den intra-cavitary spredning af mesotheliom og ovariecancer [8]. Undersøgelser af

Msln

gen knock out (- /-) mus viser, at genet ikke er afgørende for en normal udvikling og reproduktion, men flere nyere undersøgelser har rejst muligheden for, at

MSLN

kunne regulere kræft cellevækst [9] – [12]. I Eker rotter blev udviklingen af ​​tuberøs sklerose-2-induceret renal carcinoma væsentligt reduceret i mangel af en homolog af

MSLN

gen [13], [14]. I bugspytkirtelkræftceller, overekspression af

MSLN

har været impliceret i betydelig forøgelse af tumorcellevækst og migration

I

vitro

[11]. For nylig ekspressionsniveauet af MSLN protein blev korreleret med tumor aggressivitet samt nedsat samlet overlevelse af patienter med tidlige fase lungeadenokarcinom [15], men den molekylære mekanisme, der bidrager til disse fænotyper er ikke godt forstået. CA125, et membranassocieret ovariecancer antigen, er blevet rapporteret at interagere med MSLN, og det er blevet foreslået, at denne interaktion kan lette ovariecancer metastase. Selvom binding af MSLN-udtrykkende celler til CA125 er blevet demonstreret i cellekultur [8], [16], er der ingen dyreforsøg viser, at denne interaktion er vigtig i tumorbærende mus.

GPI, glycosylphosphatidylinositol.

Vi har genereret atymiske nøgne mus, hvor

Msln

gen er inaktiveret, forebygge produktion af mMsln og MPF protein. Disse mus reproducere normalt, og ingen abnormiteter i deres vækst eller andre egenskaber er blevet observeret. Fordi disse mus ikke gør MPF og ikke har Msln på cellerne, der beklæder peritonealhulen, har vi brugt dem til at undersøge, om fraværet af Msln påvirker væksten af ​​lungecancerceller inokuleret i bughulen af ​​disse mus.

Materialer og metoder

cellelinjer og Immunhistokemi

lungekræft cellelinje A549 blev opnået fra Dr. Hisataka Kobayashi (National cancer Institute, NIH, Bethesda, USA) og dets identitet blev bekræftet ved DNA-fingeraftryk under anvendelse af Short tandemgentagelser assay. Den humane epidermoide carcinom cellelinje A431 blev købt fra ATCC (Mananasas, VA) og holdt i laboratoriet som anbefalet. Immunohistokemisk farvning for MSLN og CA125 blev udført ved Histoserv, Inc (Germantown, MD) under anvendelse af muse-anti-MSLN 5B2 (Novocastra Reagenser fra Leica Bioystems, Buffalo Grove, IL) som tidligere beskrevet [17], og muse-anti-CA125 OC125 (Zymed Laboratories) ved 1:50 fortynding.

dyreforsøg

Animal Undersøgelse Forslagene (LMB-053 og LMB-014) blev godkendt af NIH Animal Care og brug Udvalg. Alle dyreforsøg, herunder behandling og offer blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer fra NIH. Athymiske nøgne mus (ncr-nu /nu) og Nude /

Msln

– /- mus opnået fra NCI-Frederick blev huset i mikro-isolator bure under hele forsøget. Alle anvendte mus til forsøg var kvinder, vægt (15-20 g) og alder (7-10 uger) matches. Alle injektioner var intraperitoneal (IP), medmindre andet er angivet. A549 og A431 IP xenotransplantater blev etableret ved at pode 2 × 10

6 celler i 200 pi cellesuspension i phosphatbufret saltvand (PBS). For det subkutane model blev 2 × 10

6 A549-celler injiceret i højre lår. Alle rekombinante protein behandlinger blev udført ved IP-injektion af 25 ug undersøgelse protein i 200 pi PBS, tre gange om ugen i i alt tre uger. For overlevelse studier blev mus overvåges dagligt og aflives ved CO

2 inhalering, når døende

Generering af

Msln

-. /- Athymiske nøgne mus

Mand

Msln

null mus i C57 /BL6 genetisk baggrund (

Msln

– /-) [9] blev anvendt til at bakke krydse med BALB /c vildtype (WT) mus og kuld blev screenet for

Msln

heterozygot allel. Mandlige heterozygote mus fra hver generation blev anvendt til at bakke den ind med WT BALB /c hunner og tilbage passage blev udført i mere end ti generationer. Hannerne heterozygot for

Msln

i BALB /c genetiske baggrund blev krydset med athymiske nøgne (Fox N) kvinder til at generere Fox N null /

Msln

– /- mus. Da Fox N null /

Msln

– /- hunmus er ikke gode opdrættere, vi brugte

Msln

– /- /Fox N Het hunner som ynglende partnere for Fox N null /

Msln

– /- mænd til at fastholde og generere Fox N null /

Msln

– /-. hunner til vores eksperimenter

Generation of MPF-kanin (r) Fc, mMSLN- RFC og CD22-RFC fusionsproteiner i pattedyrceller

for at generere rekombinante versioner af mMSLN og MPF, mMSLN-RFC og MPF-RFC blev udtrykt som fusionsproteiner med kanin IgG (RFC) i HEK293T celler og renset som tidligere beskrevet [18]. CD22-RFC-fusionsprotein er udarbejdet til brug som en kontrol.

flowcytometri

Celler blev høstet, vasket og resuspenderes i iskold FACS-buffer (PBS med 5% FBS og 0,1 % natriumazid), derefter inkuberet med anti-mesothelin antistof, MN (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA) eller Morab-009 (Morphotek Inc, Exton, PA) eller anti-MUC16 antistof, OC125 (Abcam, Cambridge, MA) ved en koncentration på 5 ug /ml. Isotop-matchet antistof blev anvendt som kontrol. Bindingen af ​​primære antistoffer til tumorceller blev påvist ved anvendelse af enten gede-anti-muse konjugeret med R-phycoerythrin (R-PE) (Invitrogen) eller med gede anti-muse konjugeret med FITC (Biosource). Fluorescensen forbundet med de levende celler blev bestemt under anvendelse af et FACS Calibur (BD Biosicences). Geometriske middelværdier blev udtrykt som gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI). MFI af celler blev sammenlignet med MFI fra en standardkurve for R-PE-konjugerede kalibrering perler (BD QuantiBRITETM PE kvantificeringskit, BD Biosciences) og antal mMSLN sites per celle blev estimeret. Resultaterne var ens med MN (n = 2 eksperimenter) eller Morab-009 (n = 3 eksperimenter).

MPF Kvantificering

A549 celler stabilt transficeret med enten vektor kontrol (A549 /pcDNA) eller MPF ekspressionsvektor (A549 /MPF) blev udpladet i skåle indeholdende samme mængde af komplet medium og inkuberet i 48 timer. Totale cellepopulation blev talt under anvendelse af en Cellometer Vision celletæller (Nexcelom, St. Lawrence, MA) En rumfang alikvot af konditioneret medium blev fjernet fra hver skål, og koncentrationen af ​​MPF i opløsningen blev kvantificeret under anvendelse af en navnebeskyttet humant MPF enzymkoblet immunosorbent assaykit (Morphotek, Easton, PA).

blød agar-assay

A549 /pcDNA eller A549 /MPF stabile transfektanter blev suspenderet i 0,35% agar, udpladet i 6 brønd plader (2 x 10

3 celler /brønd), og inkuberet i 15-21 dage ved 37 ° C. Efter krystalviolet farvning blev pladerne vasket i 1 time, derefter scannet for at fremstille digitale billeder. Kolonier blev talt inden for en forud specificeret, centralt placeret firkantet felt med sidelængde lig med en tredjedel af brønden diameter. Multiple brønde (n) blev talt for hver af tre uafhængige forsøg. Det gennemsnitlige antal kolonier for hvert eksperiment er rapporteret med standardafvigelse (SD). KB-celler blev anvendt som en positiv kontrol for kolonidannelse.

Statistical Analysis

I overlevelse undersøgelser blev Kaplan-Meier-kurver afbildes og sammenlignet under anvendelse af log-rank test. En Mann-Whitney-test blev anvendt til statistisk sammenligning af overlevelsesdata. P 0,05 blev anvendt som tærsklen for statistisk signifikans. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism (version 5) til Mac (GraphPad software).

Resultater

Tidligere undersøgelser har vist, at mMSLN interagerer med kræft i æggestokkene tumor antigen CA125, og at denne interaktion kan være vigtigt i metastatisk spredning af ovariecancer gennem bughulen [8], [16], [19]. For at vurdere virkningen af ​​MSLN på IP væksten af ​​humane kræftceller, vi skabte Fox N null /

Msln

– /- mus. For at sikre, at

Msln

gen var inaktiveret, og at musene ikke gjorde Msln vi først bekræftet sletningen ved hjælp af polymerasekædereaktion til at screene for de slettede alleler af

Msln

gen (data ikke vist). Manglende mMsln proteinekspression blev bekræftet ved immunohistokemisk analyse af musevæv ved anvendelse kanin polyklonalt anti-Msln antistof efterfulgt af farve påvisning som beskrevet tidligere [9] (fig. 2). Den immunsuppression forårsaget af FoxN sletning tillader xenograft eksperimentere med humane tumorceller. Vi bruges lungekræft cellelinien A549, som har meget lav ekspression af MSLN (gennemsnit på 3,5 × 10

3 mMSLN bindingssteder /celle), men robust ekspression af CA125 (fig. 3). Vi injicerede to millioner A549-celler i peritonealhulen på

Msln

– /- og

Msln + /+

nøgne mus, overvåges så overlevelsen af ​​dyrene. Som vist i figur 4A, var der en statistisk signifikant forskel i overlevelse mellem de to grupper mus. Den mediane overlevelse

Msln + /+

mus var 31 dage, men steg til 46 dage i

Msln

– /- mus (p 0,0001). Næsten 25% af

Msln

– /- mus overlevede over fire måneder (tabel 1), mens alle de

Msln + /+

mus døde inden for 50 dage (. Figur 4A). Ingen lignende overlevelse fordel blev set, når A431 epidermoide kræftceller (fig. 4B), som udtrykker hverken MSLN eller CA125, blev inokuleret intraperitonealt. Tumorvækst blev også vurderet, når A549 lungecancerceller blev inokuleret subkutant. I denne model, tumorer i

Msln

–

/Kreis – og

Msln + /+

mus voksede med samme hastighed (. Figur 4C), hvilket viser, at

Msln

udtryk har ingen virkning på tumorvækst i dette rum.

En portion af lungevæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd indlejret i paraffin og snittet 5 til 6 um i tykkelse, derefter farvet for MSLN. A-C: Lungevæv formular

FoxN null /Msln

(+ /+) farvet med anti-Msln antistof (A: 100X; B: 200X forstørrelse); eller sekundært antistof alene (C: 100X forstørrelse) som negativ kontrol. D-F: Lungevæv formular

FoxN null /Msln

(- /-) farvet med anti-Msln antistof (D: 100X; E: 200X forstørrelse); eller kun sekundært antistof (F: 100X forstørrelse) som negativ kontrol. Som forventet stærk mesothelin ekspression blev påvist i mesothelial celle foring af lungerne fra

FoxN null /Msln

(+ /+) mus, men ingen udtryk i lunge fra

FoxN null /Msln

(- /-.) mus

Celler blev inkuberet med de angivne primære antistoffer eller isotop kontrol antistoffer og passende sekundært antistof (gede-anti-muse-IgG, R-PE eller gede-anti-muse FITC). Resultaterne er vist som histogram plots for binding af primært antistof (sort trace) eller isotypekontrol (grå trace). A431-celler er negative for både MSLN og CA125. A549 celler viser lav mesothelin udtryk (3,5 × 10

3 sites /celle), men yderst udtrykkelig CA125

(A) Plot viser overlevelsen af ​​mus efter IP injektion af A549 celler.; median overlevelse på

Msln

– /- mus er 46 dage og

Msln (+ /+)

mus er 31 dage (

s

0,0001). (B) Plot viser overlevelsen af ​​

Msln

(-

/Kreis -) eller

Msln

(+ /+) mus efter IP injektion af A431 celler. (C) Plot viser overlevelsen af ​​

Msln

(-

/Kreis -) eller

Msln (+ /+)

mus efter subkutan injektion af A549 celler (D) Overlevelse af A549 xenograft bærende

Msln

(- /-). mus efter MPF-RFC eller mMSLN-RFC eller CD22-RFC proteiner