PLoS ONE: Identifikation af genomiske Ændringer i kræft i bugspytkirtlen Brug Array-Based Comparative Genomic Hybridization

Abstrakt

Baggrund

Genomisk aberration er et fælles træk ved menneskelige kræftformer, og også er en af ​​de grundlæggende mekanismer, der fører til overekspression af onkogener og underekspression af tumorsuppressorgener. Vores undersøgelse har til formål at identificere hyppige genomiske forandringer i bugspytkirtelkræft.

Materialer og metoder

Vi brugte vifte komparativ genomisk hybridisering (array CGH) for at identificere tilbagevendende genomiske forandringer og valideret protein ekspressionen af ​​udvalgte gener ved immunhistokemi.

Resultater

Seksten gevinster og toogtredive tab skete i mere end 30% og 60% af tumorerne, hhv. Højt niveau amplifikationer på 7q21.3-q22.1 og 19q13.2 og homozygote sletninger på 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13. 2, 17q21.31 og 22q13.1 blev identificeret. Især forstærkning af AKT2 blev påvist i to carcinomer og homozygot deletion af CDKN2C i to andre tilfælde. I 15 uafhængige validering prøver, fandt vi, at AKT2 (19q13.2) og MCM7 (7q22.1) blev opformeret i 6 og 9 sager, og CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) blev homozygot slettet i 3 og 1 tilfælde. AKT2 og MCM7 blev overudtrykt, og CAMTA2 og PFN1 blev underexpressed i bugspytkirtelkræft væv end i morfologisk normale operative margin væv. Både transportcenter og Genomisk Workbench software identificerede 22q13.1 indeholder APOBEC3A og APOBEC3B som den eneste homozygot sletning region. Og ekspressionsniveauerne af APOBEC3A og APOBEC3B var signifikant lavere i tumorvæv end i morfologisk normale operative margin væv. Yderligere validering viste, at overekspression af PSCA var signifikant associeret med lymfeknudemetastaser, og overekspression af HMGA2 var signifikant associeret med invasiv dybde af pancreascancer.

Konklusion

Disse tilbagevendende genomiske ændringer kan være nyttige til afslører den mekanisme af pancreas carcinogenese og give kandidat biomarkører

Henvisning:. Liang JW, Shi ZZ, Shen TY, Che X, Wang Z, Shi SS, et al. (2014) Identifikation af genomisk Ændringer i kræft i bugspytkirtlen Brug Array-Based Comparative Genomisk hybridisering. PLoS ONE 9 (12): e114616. doi: 10,1371 /journal.pone.0114616

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 16. juli 2014 Accepteret: November 12, 2014; Udgivet: 11. december 2014

Copyright: © 2014 Liang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science and Technology Major Project Kina (2012ZX09506001, 2011YQ17006710), og National Natural Science Foundation of China (81.241.086), og Yunnan Provincial Forskningsfond for Basic Research, Kina (Grant nr 2013FD012). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

kræft i bugspytkirtlen er en af ​​de mest malignent kræftformer i verden med et 5-års overlevelse på under 5% [1]. Indtil nu er der ikke konventionel behandling med en betydelig indvirkning på forløbet af pancreascancer, således at prognosen for patienter stadig dårlig. Derfor identifikation af de molekylære ændringer underliggende denne kræft vil danne grundlag for forbedring af den kliniske ledelse og resultater.

Genomisk ustabilitet er et karakteristisk træk ved næsten humane tumorer [2]. Kopital ændringer er ofte i cancere, og menes at bidrage til initiering og progression af tumorer ved amplifikation og aktivering af onkogener eller deletion-induceret ned-ekspression af tumorsuppressorgener. Flere tidligere undersøgelser har identificeret nogle tilbagevendende kromosom ændringer i pacreatic cancer, såsom gevinster på 1q, kromosomer 2, 3 og 5, 7p, 8Q, 11q, 12p, 14q, 17q, 19q og 20q, tab på kromosomer 1P, 3P, 6 , 8 p, 9p, 10Q, 13q, 14q, 15q, 17p og 18q, og amplifikationer af FGFR1, HER2 og DcR3 [3], [4], [5], [6], [7], [8], [ ,,,0],9]. Imidlertid er de foreliggende oplysninger stadig begrænset, især for kinesisk kræft i bugspytkirtlen.

Den foreliggende undersøgelse identificerede fælles gevinster, tab, amplifikationer og homozygote sletninger i kræft i bugspytkirtlen. Vi vurderes yderligere protein udtryk niveau kopitallet-øgede gener HMGA2 og PSCA.

Materialer og Metoder

Study Design

Først, de genetiske afvigelser i bugspytkirtelcarcinomer var påvises ved hjælp af Agilent 44K human Genome CGH microarray og fælles genomiske forandringer blev identificeret. Derefter valideret vi proteinet udtryk for HMGA2 og PSCA som var placeret i de fælles aberration kromosomområder i pancreactic kræft.

Patienter og prøver

Frisk resektion væv fra 93 bugspytkirtlen carcinoma patienter blev indsamlet af Institut for Patologi, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing, Kina fra 2006 til 2008. Alle de bugspytkirtlen kræftpatienter blev behandlet med radikal operation, og ingen af ​​dem har modtaget nogen behandling før operation. Repræsentative tumor regioner blev udskåret af erfarne patologer og straks opbevaret ved -70 ° C indtil anvendelse. Alle prøver, der anvendes i denne undersøgelse, var resterende prøver efter diagnosen prøveudtagning. Enhver patient underskrevet separate informerede samtykke formularer til prøvetagning og molekylær analyse. Kliniske kendetegn for patienter, der anvendes i array CGH undersøgelsen er vist i tabel 1. Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Cancer Institute og Hospital, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences (nr NCC2013B-30).

Genomisk DNA Extraction

Genomisk DNA blev isoleret fra tumorvæv under anvendelse af Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit som beskrevet af producenten (Qiagen, Hilden, Tyskland). Tumor celleindhold af alle prøverne var mere end 50% af HE farvning.

Array-baserede CGH

blev udført Array CGH eksperimenter ved hjælp af standard Agilent protokoller (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien) . Kommercielt humant genomisk DNA (Promega, Warrington, UK) blev anvendt som reference. For hver CGH hybridisering blev 500 ng henvisning genomisk DNA og den samme mængde tumor DNA fordøjet med Alu I og RSA-restriktionsenzym (Promega, Warrington, UK). De fordøjede reference- DNA-fragmenter blev mærket med cyanin-3 dUTP og tumor-DNA med cyanin-5 dUTP (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Efter oprydning, blev reference- og tumor DNA-prober blandet og hybridiseret på Agilent 44K menneskelige genom CGH microarray (Agilent) for 40 timer. Vaske, scanning og dataudtræk procedurer blev udført efter standard protokoller.

Microarray Data Analysis

Microarray data blev analyseret ved hjælp af Agilent Genomisk Workbench (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og BRB-arraytools ( https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html). Agilent Genomisk Workbench blev anvendt til at beregne log

2

ratio for hver probe og identificere genomiske aberrationer. Mean log

2

forholdet mellem alle sonder i et kromosom region mellem 0,25 og 0,75 blev klassificeret som genomisk gevinst, 0,75 så højt niveau DNA-amplifikation, -0,25 så hemizygote tab, og -0,75 som homozygote deletion. I vej berigelse analyse, p-værdi beregnes for hver vej baseret på nul-fordeling opnået ved en 1000-tid stikprøvekontrolmetode.

Real-time PCR

PCR reaktioner blev udført i et samlet volumen på 20 pi, herunder 10 pi 2XPower SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Warrington, UK), 2 pi cDNA /genomisk DNA (5 ng /pl), og 1 pi af primer mix (10 pM hver ). PCR-amplifikation og detektion blev udført i ABI 7300 (Applied Biosystems, Warrington, UK) som følger: en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 min; 45 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Den relative genekspression eller relative kopital af målgenet blev beregnet under anvendelse af komparativ CT Metode ved normaliseret til en endogen GAPDH. Den relative til kalibrator blev givet ved formlen 2

-ΔΔCt. ACt blev beregnet ved at subtrahere den gennemsnitlige GAPDH CT fra gennemsnittet CT af genet af interesse. Forholdet definerer den relative ekspression eller relative kopital af målgenet til den for GAPDH. 2

-ΔΔCt 2,0 blev sat for et mål forstærkning, og 2

-ΔΔCt. 0,25 blev sat for et mål homozygot deletion

immunhistokemisk farvning

formalin-fikseret, paraffinindlejrede pankreatiske tumorer placeret på vævet microarray. For hvert tilfælde cancervæv blev gentaget tre gange og tilstødende morfologisk normale væv for to gange. Objektglassene blev deparaffineret, rehydreret, nedsænket i 3% hydrogenperoxidopløsning i 10 minutter, opvarmet i citratbuffer (pH 6) i 25 minutter ved 95 ° C og afkølet i 60 minutter ved stuetemperatur. Objektglassene blev blokeret med 10% normalt gedeserum i 30 minutter ved 37 ° C og derefter inkuberet med monoklonalt muse-antistof mod HMGA2 (Abcam, Cambridge, MA) og kanin-polyklonalt antistof mod PSCA (Abcam, Cambridge, MA) natten over ved 4 ° C. Efter at være blevet vasket med PBS blev objektglassene inkuberet med biotinyleret sekundært antistof (fortyndet 1:100) i 30 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af streptavidin-peroxidase (1:100 fortynding) inkubering i 30 minutter ved 37 ° C. Immunolabeling blev visualiseret med en blanding af 3,3′-diaminobenzidin-opløsning. Kontrastfarvning blev udført med hæmatoxylin.

Expression niveau blev fastsat på grundlag af farvning intensitet og procentdelen af ​​immunoreaktive celler. Negativ ekspression (score = 0) var ingen eller svag farvning eller moderat til stærk farvning i 25% af cellerne. Svag ekspression (score = 1) var en moderat eller stærk farvning i 25% til 50% af cellerne. Og stærk udtryk (score = 2) var . 50% af cellerne med kraftig farvning

Statistisk analyse

t-test og Chi square test blev udført med den statistiske software SPSS 15.0 . Forskellene blev bedømt som statistisk signifikant, når den tilsvarende tosidet

P Drømmeholdet værdi var. 0,05

Resultater

gevinst og tab i pancreas Carcinoma opdaget af Array CGH

Femten prøver af pancreas carcinom blev analyseret i denne undersøgelse, og alle af dem havde genomiske ændringer (Range: 1 til 387). Seksten gevinster og toogtredive tab blev ofte opdaget (hyppighed af gevinst 30%, og tab 60%). De hyppigste gevinster var 8p23.3 (41,7%), 1q44 (40%), 14q32.33 (40%), 19q13.43 (36,7%), 1q21.3 (36%) og 5q31.1-q31.2 (35,6%), og de fleste almindelige tab var 11p15.4 (70,7%), 15q15.1-q21.1 (70%), 3p21.31 (68,9%), 17p13.3-p13.2 (66,7%), 19p13.3-p13.2 (66,7%), 5p13.3 (63,3%), 11p11.2 (63,3%) og 19p13.3-p13.11 (63,3%). Transportcenter analyse viste, at kopi nummer fald i APOBEC3A (22q13.1) og APOBEC3B (22q13.1) var signifikant (fig. 1 og tabel 2).

A. Genom-dækkende frekvens plot af kræft i bugspytkirtlen ved vifte CGH-analyse. Line på ret 0% aksen, gain; linje til venstre på 0% aksen, tab. B. Antal afvigelser i bugspytkirtelkræft. X, antal aberrationer; Y, antal sager. C. Gevinst og tab (HDS) identificeret ved transportcenter.

Amplifikationer og Homozygot deletioner i pancreas karcinom Opdagede ved Array CGH

højt niveau amplifikationer blev påvist ved to kromosom regioner, herunder 7q21.3-q22.1 og 19q13.2. Homozygote sletninger blev identificeret i 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 og 22q13.1 (tabel 3). Især blev kræft-gen AKT2 (19q13.2) forstærkes i to carcinomer, og CDKN2C (1p33) blev homozygot slettet i to andre tilfælde. (Fig. 2). Ved at søge COSMIC database, fandt vi, at amplifikation af AKT2 var forbundet med den øgede sentitivity for lægemidlet Z-LLNIe-CHO. Mere interessant var homozygot sletning af 22q13.1 indeholder APOBEC3A og APOBEC3B identificeret i både transportcenter og Agilent Genomisk Workbench analyse (fig. 3).

A. amplifikation af AKT2. B. homozygot sletning af CDKN2C. Pile angiver placeringen af ​​AKT2 og CDKN2C.

Cykler repræsenterer sonderne i APOBEC3A og APOBEC3B.

Vi yderligere udvalgte de forstærkede gener AKT2 (19q13.2 ) og MCM7 (7q22.1) og homozygot slettede gener CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) til validering af real-time PCR. I 15 uafhængige validering prøver, blev påvist amplifikationer af AKT2 og MCM7 i 6 og 9 sager, og homozygote sletninger af CAMTA2 og PFN1d i 3 og 1 tilfælde, henholdsvis (fig. 4A og 4B). AKT2 og MCM7 blev overudtrykt, og CAMTA2 og PFN1 blev underexpressed i bugspytkirtelkræft væv end i morfologisk normale operative margin væv (Fig. 5A og 5B).

A. amplifikation af AKT2 og MCM7. B. homozygot sletning af CAMTA2 og PFN1. C. homozygot sletning af APOBEC3A og APOBEC3B. Ratio = (Copy antal kandidat gen i tumorvæv) /(Kopi antal kandidat gen i kommercielle humant genomisk DNA).

A. Overekspression af AKT2 og MCM7. B. underekspression af CAMTA2 og PFN1. C. underekspression af APOBEC3A og APOBEC3B.

I uafhængige validering prøver, APOBEC3A og APOBEC3B var homozygot slettet i 3 og 4 tumorer, (fig. 4C). MRNA ekspressionsniveauer af APOBEC3A og APOBEC3B i tumorvæv var betydeligt lavere end i morfologisk normale operative margin væv (fig. 5C)

Pathways Beriget for Copy Number Ændringer

Pathway berigelse analyse ved hjælp Kegg database blev påført CGH data. Vi fandt, at to veje beriget i gener med forstærkning og at seks veje beriget i gener med tab. De genomiske gevinster i pancreascarcinom ændret veje for gamma-hexachlorcyclohexan nedbrydning og oxidativ phosphorylering. Men cyanoamino syre stofskifte, glutathion stofskifte, atrazin nedbrydning, taurin og hypotaurin stofskifte, arachidonsyremetabolisme og Parkinsons sygdom veje blev ændret ved de genomiske tab (tabel 4).

Validering af HMGA2 og PSCA i Kræft i bugspytkirtlen ved hjælp Immunhistokemi

Kopier nummer stigning i HMGA2 og PSCA blev påvist i et og fire tumor, hhv. På grund af deres betydelige rolle i tumorigenese [10], [11], [12], [13], vi analyserede protein udtryk for HMGA2 og PSCA hjælp immunhistokemisk (IHC). Resultaterne viste, at overekspression af HMGA2 og PSCA blev påvist i 76,7% og 65,0% af patienter med pancreascancer, (fig. 6). Endvidere overekspression af PSCA var signifikant associeret med lymfeknudemetastaser (tabel 5), og overekspression af HMGA2 var signifikant associeret med invasiv dybde af pancreascancer (tabel 6).

A. Stærk og negative udtryk for HMGA2. B. Stærk og negative udtryk for PSCA. Vejviser

Diskussion

Genomisk afvigelser kan bidrage til carcinogenese og tumor progression. For at identificere DNA kopi nummer ændringer i bugspytkirtelkræft, vi udførte vifte-baserede komparativ genomisk hybridisering og fandt, at seksten gevinster med frekvens over 30% og toogtredive tab på over 60%, med to højtstående amplifikationer på 7q21.3- q22.1 og 19q13.2 og ti homozygote sletninger på 1p33-p32.3, 1p22.1, 1q22, 3q27.2, 6p22.3, 6p21.31, 12q13.2, 17p13.2, 17q21.31 og 22q13. 1. Ved at sammenligne vores resultater med CGH data præsenteret i progenetix hjemmeside [14], [15], fandt vi, at de fleste genomiske afvigelser var konsistente. Men der var stadig nogle forskelle. For eksempel, tab af 9p var hyppigere end tab af 9q i progenetix data, men hyppigheden af ​​9q tab var højere end 9 p tab i vores undersøgelse. Forstærkningen af ​​kromosom 7 var meget almindeligt i progenetix data, men tabet af denne kromosom var hyppigere i vores data.

Betydeligt, blev kræft-gen AKT2 forstærkes i to bugspytkirtlen kræftpatienter, og kræft gen CDKN2C blev homozygot slettet i to andre tilfælde. Vi valideret forstærkningen af ​​AKT2 og MCM7 (7q22.1) og homozygot sletning af CAMTA2 (17p13.2) og PFN1 (17p13.2) i bugspytkirtelkræft, og endvidere, at AKT2 og MCM7 blev overudtrykt, og CAMTA2 og PFN1 blev underexpressed i bugspytkirtelkræft i forhold til dem i morfologisk normale operative margin væv. Disse resultater antydede, at gener, herunder AKT2, MCM7, CAMTA2 og PFN1 kunne spille en vigtig rolle i kræft i bugspytkirtlen. Homozygote deletion af CDKN2C er fundet ved myelom, og kopiantal fald i CDKN2C var signifikant associeret med en ringere samlet overlevelse [16], [17], [18]. Dog var der stadig lidt information om den rolle, CDKN2C i bugspytkirtelkræft. Om ændring af AKT2 i humane maligniteter, Miwa et al. har rapporteret forstærkningen af ​​AKT2 var i 3 af 12 bugspytkirtelkræft cellelinjer og i 3 af 20 primære bugspytkirtelcarcinomer. Overekspression af AKT2 blev også påvist i de 3 cellelinier med amplificeret AKT2 [19]. Opreguleringen af ​​AKT2 var korreleret med prognosen [20]. Tanno et al. fundet, at aktiv AKT fremmet invasiv af bugspytkirtelkræftceller gennem opregulering IGF-IR udtryk [21]. RNAi samtidigt målretning AKT2 og K-ras kunne inhibite pancreas tumorvækst [22]. Chen et al. viste, at AKT2 inhibering kunne ophæve gemcitabin-induceret aktivering af AKT2 og NF-KB, og fremme gemcitabin-induceret PUMA opregulering, hvilket resulterer i chemosensitization af pancreastumorer at gencitabine [23]. Vores resultater yderligere kontrolleret opformering af AKT2 i bugspytkirtelkræft. Ved at søge COSMIC database, vi fandt også, at amplifikation af AKT2 var forbundet med den øgede sentitivity for lægemidlet Z-LLNIe-CHO. Alle disse resultater antydede, at forstærkning af AKT2 måske udvikle sig til en biomarkør at opdele bugspytkirtlen kræftpatienter i forskellige undergrupper for anvendelse af forskellige terapi-strategi. Og i fremtiden, om lægemidlet Z-LLNIe-CHO kan anvendes til behandling af pancreas cancer patienter med AKT2 amplifikation bør undersøges.

Interessant både transportcenter og Genomisk Workbench Software identificeret 22q13.1 (indeholdende APOBEC3A og APOBEC3B) som homozygot deletion region. Real-time PCR-analyse viste, at APOBEC3A og APOBEC3B blev underexpressed i bugspytkirtelkræft væv end i morfologisk normale operative margin væv. APOBEC enzymer fungerer i medfødte immunrespons, herunder dem, der målrettet retrovirus, hvilket tyder på sammenhæng mellem immunitet, mutagenese og virusinfektion i processen med udvikling af kræft. APOBEC3A kunne fremkalde hypermutation af genomisk DNA og DNA dobbelt strengebrud, og katalysere overgangen fra et sundt at en cancer genom [24], [25]. Pham et al. rapporterede, at APOBEC3A blev udtrykt i keratinocytter, og opreguleret i hudkræft [26]. APOBEC3B blev overudtrykt i et flertal af æggestokkene cancercellelinier og høj kvalitet primære ovariecancere. Improtantly APOBEC3B ekspression blev korreleret med total mutaion belastning samt forhøjede niveauer af transversionsmutationer [27]. Harris et al. rapporterede, at APOBEC3B tegnede sig for op til halvdelen af ​​den mutations belastning i bryst karcinomer, der udtrykker dette enzym [28]. I andre cancere, herunder blære, cervix, lunge og hoved og hals, blev APOBEC3B også opreguleret og dens foretrukne målsekvens blev hyppigt muteret og grupperet [29]. Deletion af APOBEC3B svækket HBV clearance, og resulterede i HBV-infektion og øget risiko for at udvikle hepatocellulært carcinom [30]. Sletning af APOBEC3 var også forbundet med risiko for brystkræft blandt kvinder af europæisk herkomst [31]. Homozygot sletning af APOBEC3B var signifikant associeret med ugunstige resultater for HIV-1 erhvervelse og progression til AIDS [32]. Det vil være interessant at undersøge, hvilken rolle homozygot sletning af APOBEC3A og APOBEC3B i bugspytkirtlen carcinogenese.

HMGA2 og PSCA er blevet rapporteret at være forbundet med kræft i bugspytkirtlen. Piscuoglio et al. viste, at procentdelen af ​​tumorceller med HMGA2 og HMGA1 nuklear immunreaktivitet korrelerede positivt med stigende malignitet kvalitet og lymfeknudemetastaser [33], [34]. Og HMGA2 opretholdt onkogene RAS-induceret epithelial-mesenkymale overgang i humane bugspytkirtelkræftceller [35]. Vores undersøgelse viste, at blev detekteret gevinster HMGA2 og PSCA i et og fire bugspytkirtelcarcinomer hhv. I IHC assay blev overekspression af HMGA2 påvist i 76,7% og af PSCA i 65,0% af tumorer. Og overekspression af PSCA var signifikant associeret med lymfeknude metastaser og overekspression af HMGA2 var signifikant associeret med invasiv dybde af kræft i bugspytkirtlen.

Samlet set vores undersøgelse identificeret flere kopital-ændret kromosomområder i kræft i bugspytkirtlen. Disse resultater giver et vigtigt indblik i de molekylære ændringer er forbundet med bugspytkirtlen tumorigenese. bør foretages yderligere undersøgelser for at udforske de mulige tumorigene roller disse kopi nummer ændrede gener.