PLoS ONE: Aktivering af PI3K /mTOR Pathway efter PARP Hæmning i småcellet Cancer

Abstrakt

Lille celle lungekræft (SCLC) er en aggressiv malignitet med begrænsede behandlingsmuligheder. Vi har tidligere fundet, at PARP overudtrykkes i SCLC og at målrette PARP reducerer cellelinie og tumorvækst i prækliniske modeller. Dog SCLC-cellelinier med PI3K /mTOR-aktivering var relativt mindre følsomme over for PARP-inhibering. I denne undersøgelse undersøgte vi proteomik ændringer i PI3K /mTOR og andre veje, der forekomme efter PAPR hæmning og /eller knockdown

in vitro

in vivo

. Brug omvendt fase protein array, fandt vi de proteiner, mest markant opreguleret efter behandling med PARP-inhibitorer olaparib og rucaparib var i PI3K /mTOR pathway (p-mTOR, p-AKT, og PS6) (p≤0.02). Desuden blandt de mest markant nedreguleret proteiner var LKB1 og dens mål AMPK og TSC, som har en negativ regulere PI3K pathway (p≤0.042). Efter PARP knockdown i cellelinjer, phosphoryleret mTOR, blev AKT og S6 forhøjet, og LKB1 signalering blev formindsket. Globale ATP-koncentrationer steg efter PARP hæmning (p≤0.02) fører os til hypotesen, at den observerede øgede pathway aktivering PI3K /mTOR efter PARP hæmning resultater fra nedsat ATP forbrug og et efterfølgende fald i stressrespons signalering via LKB1. Baseret på disse resultater, så undersøgte vi, om co-targeting med et PARP og PI3K-inhibitor (BKM-120) ville fungere bedre end enten enkeltstof alene. Et flertal af SCLC-cellelinier var følsomme over for BKM-120 ved klinisk opnåelige doser, og cMYC ekspression var den stærkeste biomarkør for respons. Ved klinisk opnåelige doser talazoparib (den mest potente PARP hæmmer i SCLC klinisk afprøvning) og BKM-120, blev en additiv virkning observeret

in vitro

. Ved afprøvning i to SCLC dyremodeller, blev en større end additiv interaktion set (p≤0.008). De data, der præsenteres her, tyder på, at kombinere PARP og PI3K hæmmere øger effekten af ​​enten midlet alene i prækliniske modeller af SCLC, berettiger yderligere undersøgelse af sådanne kombinationer i SCLC patienter

Henvisning:. Cardnell RJ, Feng Y, Mukherjee S , Diao L, Tong P, Stewart CA, et al. (2016) Aktivering af PI3K /mTOR Pathway efter PARP Hæmning i småcellet lungekræft. PLoS ONE 11 (4): e0152584. doi: 10,1371 /journal.pone.0152584

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, SPANIEN

Modtaget: November 9, 2015; Accepteret: 15. marts 2016 Udgivet: April 7, 2016

Copyright: © 2016 Cardnell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af MD Anderson Cancer center Support Grant (NIH P30 CA016672); University of Texas-tex og MD Anderson Cancer Center Lung SPORE (5 P50 CA070907); gennem generøse filantropiske bidrag til The University of Texas MD Anderson Lung Cancer Moon Shot Program; NIH 1R01 CA168484-01 (JVH); David Bruton, Jr., Begavet Stol (JVH); Den Rexanna Fond til Bekæmpelse Lung Cancer (https://www.rexannasfoundation.org/) (JVH); MD Anderson Cancer Center Læge Scientist Award (LAB); Lee Clark Fellowship of The University of Texas MD Anderson Cancer Center, støttet af Jeane F. Shelby Scholarship Fund (LAB); en NCI Cancer Clinical Investigator Team Leadership Award (P30 CA016672) (LAB); Sheikh Khalifa bin Zayed Al Nahyan Institut for Personlig Cancer Therapy s (IPCT s) Center for erhvervsuddannelser (LAB); National Lung Cancer Research Partnership, muliggjort af North Carolina Lung Cancer Partnership (https://www.freetobreathe.org/) (LAB); Lung Cancer Research Foundation (https://www.lungcancerresearchfoundation.org/) (LAB); LUNGevity Foundation (https://www.lungevity.org/) (LAB); og The Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research (https://kimmel.org/) (LAB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. YF og YS er ansat i BioMarin Pharmaceutical Inc. JVH tjener om de rådgivende bestyrelser AstraZenica, Abbvie, Novartis og Genentech. Dette ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er den mest aggressive form for lungekræft, med en 5-årig overlevelse på kun 6% [1]. Der er cirka 30.000 dødsfald som følge af SCLC årligt i USA (som udgør 13% af lungekræfttilfælde), hvilket gør SCLC alene 8

th førende årsag til kræft dødsfald i USA i 2011 [2, 3]. De fleste tilfælde af SCLC reagere på kemoterapi og strålebehandling i første omgang. Men tilbagefald er næsten universel, og i de fleste patienter yderligere systemisk terapi producerer ingen reaktion. I modsætning til ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), SCLC har i øjeblikket ingen godkendte målrettede behandlinger med påvist gavn for patienterne. Derfor er udviklingen af ​​nye, aktive, og potentielt målrettede lægemidler til behandling af SCLC er et stort udækket medicinsk behov.

Vi har tidligere rapporteret, at poly-ADP ribose polymerase 1 (PARP1) er overudtrykt i SCLC, identificere PARP som et potentielt terapeutisk mål i denne cancer [4]. Yderligere arbejde med vores gruppe har vist, at PARP1 /2 hæmmere talazoparib (BMN 673), olaparib (AZD2281), og rucaparib (CO-338, AG 014.699) har single-agent aktivitet i prækliniske modeller [4, 5]. Mens PARP inhibitorer er i sent stadium udvikling til behandling af ovariecancer (olaparib godkendt, rucaparib Fase 3), baseret på disse prækliniske data, der flere kliniske studier af PARP-inhibitorer, der gennemføres i SCLC at undersøge effekten af ​​disse lægemidler som enkelte agenter eller i kombination med kemoterapi (fase i-talazoparib, fase II olaparib og veliparib) [6]. I fase I studie med monoterapi talazoparib, vi observerede partielle responser i en undergruppe af patienter med recidiverende [7] SCLC. Men som med andre målrettede lægemidler, identificere mekanismer forbundet med medfødt og erhvervet resistens narkotika og rationelle kombinationer for at øge responsrater og /eller varighed er afgørende for at optimere den kliniske anvendelse af disse stoffer [7, 8].

i tidligere prækliniske arbejde, ved hjælp af et panel af 8 SCLC-cellelinier vi korreleret cellelinie følsomhed over for PARP-inhibering med hver cellelinje er proteomisk [5] profil. Cellelinjer med den største aktivering af PI3K /mTOR pathway var den mindst følsomme over for talazoparib; med fosforyleret (p) -Akt (T308) og p-AKT (S473) som de øverste markører for resistens [5]. Genetiske ændringer i PI3K /mTOR pathway er ikke ualmindelige i SCLC [9, 10], med typisk gensidigt udelukkende ændringer i

PIK3CA

,

PTEN

,

AKT2

,

Akt3

,

Rictor

, eller

mTOR, fundet i 36% af patienterne [10]. Prækliniske rapporter har vist PI3K hæmmere såsom PIK75 og PF-4.989.216 at have aktivitet i SCLC modeller med

PIK3CA

mutationer, men ikke

PTEN

mangel, hvilket indikerer en mulig rolle for PI3K /mTOR-målrettet terapi i SCLC [11, 12]. Relateret til dette fund, har tidligere rapporter i brystkræft vist, at behandling med en PI3K-hæmmer forsinket tumorvækst men steg indikatorer for DNA-skader såsom poly-ADP ribose (PAR) [13, 14]. Mens PARP-inhibering alene i disse brystkræft modeller kun moderat svækket vækst, kombinationen af ​​PARP og PI3K-inhibering var særlig potent ved undertrykkelse vækst [13, 14].

Som proteomisk analyse viste en omvendt korrelation mellem aktivitet af PI3K /mTOR pathway og reaktion på talazoparib

in vitro

[5], vi hypotese, at tilsætning af PI3K /mTOR hæmning yderligere kunne bevidstgøre SCLC til PARP-inhibitorer. Vi først undersøgt i SCLC cellelinjer det intracellulære respons på PARP hæmning, observere øget PI3K /mTOR signalering efter PARP hæmning.

I denne undersøgelse viser vi for første gang, at PI3K /mTOR signalering stiger efter hæmning af PARP i SCLC og at dette kan drives gennem en reduktion i leveren kinase B1 (LKB1) signalering-ændringer valideret af PARP1 knockdown. Derfor undersøgte vi de antitumor effekt af at kombinere en PARP-inhibitor med en PI3K-specifik inhibitor i prækliniske modeller for SCLC. Kombination undersøgelser rettet mod PARP og PI3K

in vitro

afslørede en additiv vekselvirkning mellem disse to inhibitorer i proliferationsassays. Dyreforsøg har vist, at denne kombination har større effekt end hvert lægemiddel alene reducere tumor volumen, hvilket giver en god grund til fremme af denne kombination i kliniske studier i SCLC-patienter.

Materialer og metoder

cellelinjer

Menneskelig SCLC-cellelinjer COR-L88, DMS1114, DMS 153, DMS 53, DMS 79, H1048, H1092, H1105, H128, H1341, H1417, H1436, H146, H1672, H1836, H187, H1876 , h1930, H196, H1963, H2081, H209, H211, H2141, H2171, H2195, H2227, H2330, H250, H345, H378, H446, H510, H524, H526, H69, H719, H748, H774, H82, H841, H847 , H865, H889, og SHP-77 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) eller Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); GEMM-afledte cellelinjer KP1, KP3, Kp11, og Kp12 [15] og den menneskelige patient-afledt xenograft (PDX) afledt cellelinje NJH29 blev alle generøst tilvejebragt af Dr. Julien Sage (Stanford University, Stanford CA). Alle celler blev dyrket i foreslået medium suppleret med føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin. Celler blev passeret for færre end 6 måneder efter modtagelsen.

Protein analyse

For RPPA og western blot analyse blev cellerne behandlet i to eksemplarer med 1 pM olaparib (Selleck Chemicals, Houston TX), rucaparib ( Selleck Chemicals, Houston TX), eller talazoparib (Biomarin Pharmaceutical Inc, Novato CA). Western blots blev undersøgt for PARP1 (cs9542), mTOR pS2448 (cs2971), mTOR (cs2983), AKT pT308 (cs9271), AKT (cs9272) S6 pS240,244 (cs2215), S6 (cs2217), LKB1 (cs3050), AMPKα pT172 (cs2532), AMPKα (cs2532) (Cell Signaling Technlogy, Danvers MA), og actin (sc1616, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX).

Omvendt fase protein-array

Proteinlysater var opsamles i en buffer indeholdende 1% Triton X-100, 50 mmol /l HEPES (pH 7,4), 150 mmol /l NaCl, 1,5 mmol /l MgCl

2, 1 mmol /L EGTA, 100 mmol /l NaF, 10 mmol /l Nappi, 10% glycerol, 1 mmol /l PMSF, 1 mmol /l Na

3VO

4, og 10 mg /ml aprotinin. Prøver blev kvantificeret og proteinarrays blev trykt fra lysater og farvet som tidligere beskrevet [4, 16]. Kort fortalt blev lysbilederne kvantificeres ved hjælp MicroVigene 4,0 (VigeneTech, Carlisle, MA). De spot niveau rå data blev behandlet ved hjælp af R-pakken SuperCurve [17-19], som returnerer den estimerede proteinkoncentration (rå koncentration) og en kvalitetskontrol (QC) score for hvert dias. Kun glider med en QC score 0,8 blev anvendt til nedstrøms analyse. De rå koncentrationsdata blev normaliseret ved median-centrering hver prøve på tværs af alle proteinerne at korrigere loading bias.

Proliferationsassay

Celler blev podet i 96-brønds plader ved 2000 celler per brønd i tre eksemplarer for hver cellelinie. Efter 24 timer blev cellerne i hver brønd behandlet i 24 timer med en PARP-inhibitor (talazoparib) og /eller PI3K-inhibitor (BKM-120, Selleck Chemicals, Houston TX) eller med vehikelkontrol. Fire dage senere, proliferation blev analyseret ved Cell Titer Glo (Promega, Fitchburg, WI). For single-medicinsk behandling, median hæmmende koncentration (IC

50) værdier blev estimeret af drexplorer software [20]. Specifikt for hver kombination lægemiddel (på hvert dosisniveau), den observerede (eller eksperimentel) virkning af kombinationen blev sammenlignet med den forudsagte additive effekt. Dataene blev efterfølgende præsenteret som en procentdel af den eksperimentelle virkning i forhold til den forudsagte additive effekt (1,1 = + 10%; 1 = 0%, 0,9 = -10%). For eksempel, hvis medikament A reducerer den relative spredning til 0,8 og medikament B til 0,7, derefter den forudsagte additive effekt ville være 1 – ((1-0.8) + (1-0.7)) = 0,5. Hvis det observerede (eksperimentel) virkning af kombinationen på relative proliferation er derefter 0,3, så den observerede virkning er større end den forudsagte virkning af kombinationen [(1-0.3) /(1-0.5) = 1,4]. Brug 10% over eller under den forudsagte additive virkning som en cut-off, vi derefter tildelt følgende grupper: Observeret /forudsagt 1,1 = større end additiv; Observeret /forudsagde 0,9 = mindre end additiv; Observeret /forudsagde ≤1.1 og ≥0.9 = additiv. For lægemiddelkombinationer, den MacSynergy II tilgang [21] baseret på Bliss Uafhængighed modellen [22] blev gennemført for at beregne forskellige målinger, herunder synergistisk volumen, antagonistisk volumen, samlet volumen, og ekstra dræbe procent [23].

Gene knockdown

for stabil protein knockdown, lentivirale partikler koder to forskellige korte-hårnålen RNA (shRNAs) rettet mod PARP1 og scramble kontrol shRNA (pGIPZ lentiviral vektor, Open Biosystems en division af Dharmacon /GE Healthcare, Lafayette CO) blev udvalgt og betegnet som PARP1-shRNA-1, PARP1-shRNA2, og SCR-shRNA hhv. De PARP1 shRNA sekvenser var som følger:

PARP1

-shRNA1: 5′-TAGTTGAACACACTTTCTT-3 ‘; PARP1-shRNA2: 5’-TGATGTTCCAGATCAGGTC-3 ‘.

STK11

(LKB1) shRNA sekvenser var som følger LKB1-shRNA1: 5′-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘; LKB1-shRNA2: 5 ‘ATTTATTGCCAAATTTGGG-3’. De shRNA lentiviral partikler blev inkuberet med målceller i 24 timer, og cellerne blev derefter udvalgt i passende dyrkningsmedium indeholdende puromycin (2 ug /ml) i 3 uger. De resistente kolonier blev udvidet, og knockdown effektivitet blev valideret af QRT-PCR og western blotting.

ATP kvantificering

For at vurdere tilgængeligheden af ​​ATP, blev globale ATP-koncentrationer målt i celler behandlet eller ej behandlet med en PARP-inhibitor. ATP-koncentrationer blev analyseret ved ATPLite Luminescence System ifølge producentens instruktioner (PerkinElmer, Inc., Waltham MA).

Poly ADP-ribose (PAR) assay

For at vurdere virkningen af ​​PARP /PI3K hæmning på PARP1 aktivitet

in vivo

, lysater blev fremstillet af xenografter 2 timer efter lægemiddeladministration på dag 3 i behandling. Xenotransplantater blev fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet i næste afsnit metode. PAR-niveauer blev analyseret ved ELISA ifølge producentens instruktioner (Trevigen, Inc., Gaithersburg, MD).

Dyremodeller

Balb /c nøgne mus blev opnået fra Shanghai Lingchang Biotechnology Co LTD (Shanghai, Kina) eller Harlan Laboratories (Houston, TX). Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Alle procedurer i forbindelse med håndtering af dyr, pleje og behandling i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Shanghai Chempartner (protokol nummer A998HL0001) eller ved University of Texas MD Anderson Cancer Center IACUC (protokol nummer RM00001191-RN01). blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser. Humane NCI-H209 SCLC-celler (5 x 10

6 celler) eller NCI-H1048-tumorceller (3 × 10

6 celler) i 0,2 ml af en 1: 1 blanding af medium og matrigel blev injiceret subkutant i højre flanke af hver mus (36 dyr pr cellelinie). Når tumorerne nåede ~ 150 mm

3 gennemsnitlige mængde, dyr (6 pr gruppe) blev behandlet oralt med bærer, talazoparib (0,25 mg /kg), eller BKM-120 (25 mg /kg) dagligt i 28 dage. Tumorvolumen og dyrs vægt blev målt hver 2. til 3. dag. Yderligere 3 dyr i hver gruppe blev behandlet i 3 dage; xenotransplantattumorer blev høstet fra og lynfrosset 2-3 timer efter behandling på dag 3 for yderligere analyse. Behandlingseffekt blev bestemt ved at sammenligne tumorvolumen fra lægemiddelbehandlede mus (AT) med det fra mus behandlet med vehikel (ΔC) anvendelse af forholdet (AT /ΔC) på dag 19 til NCI-H1048 og dag 25 for NCI-H209 [ ,,,0],24] (sidste måling af køretøjer behandlede tumorer).

Resultater

PARP hæmning

in vitro

øger PI3K signalering i SCLC

for at identificere veje moduleret af PARP-inhibering, udførte vi revers fase-protein array (RPPA), som målte ændringer i 137 total og phosphorylerede proteiner i vigtige onkogene pathways herunder PI3K, MEK og DNA-reparation i et panel af SCLC-cellelinier behandlet med enten vehikel eller én af PARP-inhibitorer olaparib ( AZD2281), rucaparib (CO-338, AG 014.699), eller talazoparib (BMN 673) i 24 timer. Analyse af cellelysater indsamlet før og efter behandling viste, at phosphorylering (aktivering) af proteiner i PI3K /mTOR pathway blev forøget i behandlede cellelinier. RPPA analyse viste, at ud af 137 totale og phosphorylerede proteiner målt, seks af de otte proteiner, der blev mest markant opreguleret i respons på PARP-inhibering (FDR ≤0.1) var i PI3K /mTOR pathway (herunder p-mTOR, p-AKT, og p-S6 [p≤0.02] (fig 1A og 1B) totale protein niveauer var uændrede ved RPPA (p≥0.27)). Talazoparib, der har en ca 10 gange lavere IC

50 i SCLC end olaparib eller rucaparib, inducerede en lignende reaktion i H69 celler, som udvises af øget p-AKT T673 og p-S6 S240,244 efter behandling (S1 Fig ).

(A) Hierarkisk klyngedannelse af proteiner identificeret i lysater fra SCLC-cellelinier (H69, H82, H841) behandlet med vehikel eller olaparib i 24 timer afslørede forøget aktivitet af PI3K /mTOR pathway følgende PARP-inhibering ( FDR≤0.1, ækvivalent p-value≤0.037). (B) Individuelle phosphorylerede proteiner i PI3K /mTOR pathway (p-mTOR, p-AKT og p-S6 kinase) forhøjes efter behandling med enten olaparib eller rucaparib (p≤0.02). (C) Lysater fra cellelinjer behandlet med olaparib eller rucaparib versus køretøj i 24 timer viser inaktivering af LKB1 vejen (LKB1, pAMPKα, og pTSC2, p≤0.042).

PARP hæmning driver PI3K /mTOR aktivering via ATP /LKB1

Vores tidligere undersøgelser viste, at der ud over PARP, SCLC-cellelinier overekspression også liver kinase B1 (LKB1) [4]. Den LBK1 pathway er et stress-respons mekanisme, der aktiveres som reaktion på metaboliske belastninger såsom ATP depletion at beskytte cellen [25]. En konsekvens af LKB1 aktivitet er undertrykkelse af mTOR pathway [25]. RPPA analyse af SCLC celler behandlet med olaparib afslørede et fald i aktiviteten af ​​LKB1 pathway (Fig 1A). Yderligere analyse (Fig 1C) viste, at behandling med enten olaparib eller rucaparib signifikant reduceret LKB1 ekspression (p 0,001). Phosphorylering af LKB1 s downstream mål, pAMPKα og pTSC2, blev også signifikant reduceret efter behandling med PARP hæmmere (p = 0,022 og p = 0,042 med olaparib; p = 0,013 og p = 0,034 med rucaparib for pAMPKα og pTSC2 henholdsvis, total AMPK og TSC proteinniveauer var uændrede som målt ved RPPA, p≥0.81).

PARP-inhibitorer arbejde gennem både den katalytiske inhibering af PARP og et fænomen kaldet PARP-DNA trapping hvor PARP er fanget ved stedet for et dobbeltstrenget brud (DSB) at forhindre, at DSB fra at blive repareret og forårsager direkte cytotoksicitet [26]. Derfor, for at se på effekten af ​​PARP katalytisk hæmning specifikt vi bankede ned

PARP1

genet ved lentiviral shRNA transduktion i et panel af SCLC cellelinjer, herunder en repræsentant cellelinje fra in vitro-farmakokinetiske analyse og cellelinjer anvendt i dyreforsøg (beskrevet nedenfor). PARP knockdown gav os mulighed for ikke kun se direkte på den katalytiske hæmning af PARP1, men også at undgå potentielle off-target effekter af farmakologiske hæmmere. Som vist i figur 2A, denne knockdown signifikant reduceret PARP1 ekspression sammenlignet med scramble shRNA (kontrol). Yderligere western blot analyse af

PARP1

shRNA knockdown cellelinjer viste øget mTOR, AKT, og S6 aktivitet i forhold til scramble shRNA kontrol i alle testede cellelinier, trods H69 og H1048 have aktiverende mutationer i

PIK3CA

. Vi bekræftede vores observationer i H69 knockdown celler ved hjælp af en begrænset RPPA panel analysere udvalgte proteiner (S2 Fig). I denne analyse, andet og tredje mest markante forskelle mellem scramble- og

PARP1

shRNA-transducerede celler blev nedsat PARP1 og øget p-S6 (35 hits i

PARP1

KD1 og 52 i KD2 på FDR≤0.05). Den observerede forøgede i PI3K /mTOR signalering med kortsigtet farmakologiske og langsigtet genetiske tab af PARP1 funktion forstærker forestillingen om, at PI3K /mTOR aktivering er en effekt, der er relateret til den katalytiske inhibering af PARP stedet PARP-DNA trapping. Romanen observation, at PARP hæmning eller knockdown aktiverer PI3K /mTOR pathway i SCLC (figur 1) er i overensstemmelse med vores tidligere offentliggjorte rapport, at denne vej er den stærkeste markør for baseline modstand mod PARP hæmning [5].

(A) Lysater fra PARP1 knockdown af shRNA i SCLC cellelinjer (H69, H1048, H209) resulterer i øget aktivitet af PI3K /mTOR pathway i forhold til scramble (Scr) shRNA, bestemt ved western blot. (B)

PARP1

Knockdown shRNA celler (KD1 og KD2) havde lavere LKB1 og pAMPKα udtryk end kapløbet shRNA celler. (C) H69 og H1048-celler behandlet med olaparib viste øget [ATP] som målt ved ATPLite assay. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM; ** P 0,02, *** p 0,01. (D) En foreslået model af PI3K-aktivering efter PARP-inhibering.

Yderligere analyse af PARP1 aktivitet på LKB1 vej hos SCLC-cellelinier viste, at LKB1 ekspression og phosphorylering af AMPKα var begge lavere i

PARP1

knockdown celler end i celler behandlet med scramble shRNA (fig 2B).

PARP katalyserer polymerisationen af ​​ADP-ribose fra NAD + til at fastgøre poly ADP-ribose (PAR) til donor-proteiner i en proces kaldet PARylation [27]. Som PARylation ved PARP er en ATP-intensive begivenhed, vi hypotese, at PARP inhibering resulterer i forøgelse af tilgængelige ATP, hvilket igen resulterer i nedsat LKB1 pathway aktivitet og derfor et tab af PI3K /mTOR suppression. Ved hjælp af en luminescens-assay målte vi globale ATP i SCLC celler før og efter behandling med en PARP-inhibitor. Som vist i fig 2C, blev ATP-koncentrationer øget efter behandling med olaparib (1 uM, s 0,001 til 1 time). Den foreslåede mekanisme for, hvordan PARP hæmning kan stimulere PI3K /mTOR pathway via øget ATP tilgængelighed og undertrykkelse af LKB1 vej er vist som fig 2D. Disse observationer er enig med en nylig rapport, at PARP1-medieret ioniserende stråling-induceret autofagi sker gennem aktivering af LKB1 /AMPK /mTOR pathway [28] samt rapporter, der viser, at aktiveringen af ​​PARP1 efter alkylerende DNA skader aktiverer LKB1 vej til at undertrykke PI3K signalering via nedbrydningen af ​​ATP-en effekt, der er tabt efter PARP1 hæmning [29, 30].

Talazoparib og en PI3K-inhibitor kombinere additivt i SCLC

Udvidelse på vores tidligere observationer, at en ) følsomhed over for PARP-inhibering er relateret omvendt til PI3K /mTOR pathway aktivitet [5] og 2) PARP-inhibering øget PI3K /mTOR signalering, testede vi anti-spredning effektiviteten af ​​en PI3Kα inhibitor (BKM-120) i vores panel af 50 SCLC cellelinier. BKM-120 (en pan-klasse-1 P110α /β /γ /δ inhibitor) blev valgt, fordi det blev brugt i en undersøgelse af en PARP /PI3K inhibitor kombination i bryst /ovariecancer (ClinicalTrial.gov Identifier: NCT01623349), og fordi en anden P110-specifik inhibitor (PIK75) har vist sig at have single-agent aktivitet i nogle SCLC cellelinjer [12]. Som vist i fig 3A, IC

50 blev nået i et flertal af cellelinier testes (44/50), 35 af dem på en klinisk opnåelig dosis mindre end den rapporterede dag 1 C

max 2.3μM [31 ].

(a) Proliferationsassay viste en række følsomheder til BKM-120 på tværs af SCLC cellelinje panel. Cellelinjer med

PTEN

mutationer /sletninger er farvet rød og dem med

PIK3CA

mutationer grøn; klinisk C

max er angivet med en stiplet vandret linie. # Indikerer IC

50 ikke nået på testede doser. (B) Oversigt over

PI3K /mTOR

mutation og

MYC

forstærkning status cellelinjer (se S3 Fig for cellelinje navne). (C) cellelinier med enten en mutation i PI3K /mTOR pathway (MT) eller en

MYC

amplifikation (AMP) var mere følsomme over for BKM-120 end celler uden en mutation eller amplifikation (WT og ikke- AMP; ** p. 0,02). (D) biomarkører hjælp af RPPA profiler af 47 SCLC-cellelinier korreleret proteinekspression med BKM-120 IC

50 at identificere markører prædiktive for respons. Spredning data præsenteres som gennemsnit ± SEM.

For at fastlægge den rolle, at PI3K /mTOR pathway mutationer kan spille i følsomhed over for BKM-120, vi identificeret cellelinjer med sådanne mutationer. Celler med

PIK3CA

mutationer (n = 3, er angivet med grønt i figur 3A) var forbundet med lavere IC

50-værdier, hvilket indikerer, som man ville forvente, at celler, der er mere afhængige af PI3K /mTOR signalering for overlevelse er mere følsomme over en PI3K-inhibitor. Vi identificerede også

AKT2

,

Rictor

, og

mTOR

mutationer i cellelinjer, der var følsomme over for BKM-120. Celler med

PTEN

ændringer (n = 7, angivet med rødt i figur 3A) blev fordelt over forskellige følsomheder, hvilket indebærer, at

PTEN

ændringer ikke korrelerer med følsomhed. Hyppigheden af ​​mutationer i disse fem gener (sammenfattet i fig 3B og S3 Fig) ligner dem offentliggjort i en nylig undersøgelse af SCLC biopsiprøver [10]. Når samles, cellelinjer med PI3K /mTOR pathway mutationer havde signifikant lavere IC

50 værdier til BKM-120 end ikke-muterede celler (Fig 3C, p = 0,01).

For at identificere potentielle proteom markører af reaktionen på BKM-120 analyserede vi korrelationen mellem IC

50 til BKM-120 og basale ekspressionsniveauer af 146 total eller phosphorylerede proteiner ved RPPA. Som vist i fig 3D, Spearman korrelation identificeres cMyc proteinekspression som den øverste markør for følsomhed over for BKM-120 (p 0,001); andre signifikant (p 0,05) markører for følsomhed inkluderet p-cMyc, p-AMPKα, og p-ACC1. Yderligere analyse af BKM-120 følsomhed data viste, at cellelinier med kendt

MYC

forstærkning havde en signifikant lavere IC

50 (p = 0,01, figur 3C), validering af proteomik markør. Blandt de stærkeste markører for resistens over for BKM-120 var proteiner implicerer den MAPK /ERK-vejen (pErk1 /2 (T202, Y204) Rho = 0,358, p = 0,014; pGSK3α /β (S21,9) Rho = 0,318, p = 0,032 ; pMAPK (T202, Y204) Rho = 0,317, p = 0,032). Aktivering af MAPK /ERK-vejen efter inhibering af PI3K er blevet observeret i en række cancere [32], herunder NSCLC [33] og brystkræft [32, 34]; denne virkning kan medieres gennem tab af AKT hæmmende virkning på Raf [35]. Ud over MAPK /ERK-vejen, de stærkeste markører for resistens over for BKM-120 var AKT og p-BAD (p 0,001) Interessant BKM-120 IC

50 værdier ikke viser en stærk korrelation med vores tidligere offentliggjorte PI3K score [5] (Rho = 0,101, p = 0,51), hvilket er i overensstemmelse med offentliggjorte iagttagelser, at følsomheden over for pictilisib (GDC0941, en PI3Kα /δ inhibitor) viste ingen korrelation med PI3K score i et panel af 60 hoved og hals pladecellecarcinom cellelinier [36]. Disse observationer viser, at aktiveringen af ​​MEK (eller andre kompenserende /escape veje) kan være vigtigere end basal PI3K pathway aktivitet ved bestemmelse følsomhed for PI3K inhibering.

Kombinationen af ​​PARP og PI3K-inhibitorer er blevet rapporteret at være meget aktive i prækliniske modeller (patient-afledte xenotransplantater og en

BRCA1 /Trp53

knockout spontan gensplejset musemodel) af brystkræft [13, 14]. Baseret på disse resultater, et klinisk forsøg, der tester kombinationen af ​​PARP-inhibitoren olaparib og en PI3K-inhibitor (pan-P110 BKM-120 eller P110α specifik BYL719) blev indledt for bryst- og ovariecancer (NCT01623349). Foreløbige data viser tolerabiliteten af ​​kombinationen [37] og kliniske fordele ved alle dosisniveauer i mindst olaparib + BKM-120 kohorte [38]. Vi har derfor testet virkningerne af en kombination af talazoparib (PARP-inhibitor) og BKM-120 (PI3K inhibitor) ved klinisk opnåelige doser i et panel af SCLC-cellelinier med en række følsomheder (følsomt, mellemliggende og modstandsdygtig) til både BKM-120 og talazoparib (følsomhed til talazoparib vist i S4 fig). Seks doser talazoparib (interval 0,1-30 nM) og tre doser af BKM-120 (interval 0,1-1 uM) blev testet i hver cellelinie. Ved hvert dosisniveau, sammenlignede vi effekten på proliferation med den forudsagte additive effekt. Opformeringsrater, der var inden for 10% af den forventede additive effekt hvor betragtes som “additiv”, mens hvis med spredning satser mere end 10% over eller under den forventede additive virkning blev betragtet som “mindre end additiv” eller “større end additiv” (Fig 4A ). Som et eksempel, fig 4A viser repræsentative cellelinier med en “additiv” respons (H211, DMS-79) eller en “større end additiv” respons (h1930). Under anvendelse af denne fremgangsmåde, demonstrerede vi en additiv vekselvirkning i 49 af de testede 50 SCLC-cellelinier.

(A) Proliferation assays under anvendelse klinisk opnåelige doser af talazoparib (6 doser, interval 0,1-30 nM) og BKM-120 (3 doser, interval 0,1-1 uM) viste en additiv interaktion i de fleste af de testede 50 SCLC-cellelinier. Eksempler viser additiv responser (H211, DMS-79), og en større-end-additiv respons (h1930). (B) grad (i procent) af inhibering ovenfor (grøn) eller under (lyserød) den forudsagte additive effekt (lilla) for hver cellelinje tværs af alle klinisk opnåelige doser. (C) Observeret spredning i forhold til forudsagt additiv effekt på de enkelte doser af BKM-120.

For at tage et samlet overblik over samspillet mellem de to lægemidler for hver cellelinje på tværs af alle doser, vi udførte en yderligere analyse, der kombinerede graden (i procent) af inhibering over eller under den forudsagte additive effekt fra alle mulige kombinationer. Ved hjælp af arealet under kurven (volumen), sammenlignede vi observerede og forudsagte additive værdier (i procent i forhold til den forventede) ved for hver kombination (med en enhed af uM

2%) positive og negative værdier blev derefter separat summeret for hver cellelinje (figur 4B). For alle men tre cellelinjer, den samlede effekt af talazoparib + BKM120 kombination var inden et volumen på ± 10%, som faldt inden for den forventede additive effekt, yderligere underbygger den konklusion, at disse stoffer var primært additiv

in vitro

Drs.