PLoS ONE: Kras Gene Mutation og RASSF1A, FHIT og MGMT Gene Promoter Hypermethylering: Indikatorer for Tumor Iscenesættelse og Metastase i Adenocarcinomatous Sporadisk Kolorektal Cancer i Indian Population

Abstrakt

Målsætning

Tyktarmskræft ( CRC) udvikling indebærer underliggende ændringer på genetiske /epigenetisk niveau. Denne undersøgelse evaluerede rolle Kras genmutation og RASSF1A, FHIT og MGMT gen promoter hypermethylering sammen /selvstændigt i sporadisk CRC i indiske befolkning og korrelation med klinisk-patologiske variabler af sygdommen.

Metoder

Én hundrede og tyve fire på hinanden følgende kirurgisk resektion væv (62 tumor og lige antal normale tilstødende kontroller) af primær sporadisk CRC blev medtaget og patient detaljer herunder demografiske karakteristika, livsstil /fødevarer eller drikkevaner, kliniske og histopatologiske profiler blev registreret. Polymerase kædereaktion -. Begrænsning polymorfisme og direkte sekventering for Kras genmutation og Methylering Specific-PCR for RASSF1A blev FHIT og MGMT gener udført

Resultater

Kras genmutation ved codon 12 13 og methylerede RASSF1A blev FHIT og MGMT gen observeret i 47%, 19%, 47%, 37% og 47% tilfælde, hhv. Alkohol indtag og rygning var signifikant associeret med tilstedeværelse af Kras mutation (kodon 12) og MGMT methylering (p-værdi 0,049). Tumor stadium og metastase korreleret med tilstedeværelsen af ​​mutant Kras codon 12 (p-værdier 0,018, 0,044) og methyleret RASSF1A (p-værdier 0,034, 0,044), FHIT (p-værdier 0,001, 0,047) og MGMT (p-værdier 0,018, 0,044 ) gener. Kombinatorisk effekt af genmutation /methylering blev også observeret (p-værdi 0,025). Samlet set tumor stadie 3, moderat differentierede tumorer, tilstedeværelsen af ​​lymfatisk invasion og fravær af metastaser blev observeret hyppigere i tumorer med muteret Kras og /eller denatureret RASSF1A, FHIT og MGMT gener.

Konklusion

synergistisk indbyrdes forbindelse mellem disse gener i sporadisk CRC kan anvendes som diagnostiske /prognostiske markører i vurderingen af ​​den samlede patologiske status CRC

Henvisning:. Sinha R, Hussain S, Mehrotra R, Kumar RS, Kumar K, Pande P, et al. (2013) Kras Gene Mutation og RASSF1A, FHIT og MGMT Gene Promoter Hypermethylering: Indikatorer for Tumor Staging og Metastase i Adenocarcinomatous Sporadisk Kolorektal Cancer i indiske Befolkning. PLoS ONE 8 (4): e60142. doi: 10,1371 /journal.pone.0060142

Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA

Modtaget: 15 oktober, 2012; Accepteret: 21 februar 2013; Udgivet: April 3, 2013 |

Copyright: © 2013 Sinha et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige. kræft hos mænd (663000 tilfælde) og den anden hos kvinder (571000 tilfælde) med omkring 608 tusind dødsfald estimeret på verdensplan, hvilket gør det den fjerde mest almindelige dødsårsag af kræft. I Indien, den estimerede forekomst og dødelighed fra CRC er 36476 tilfælde og 25690 sager henholdsvis [1]. CRC satser er omkring 2 til 5 gange højere i de udviklede lande i forhold til de udviklingslande, der kan tilskrives en række variationer i en uensartet sæt af risikofaktorer og diagnostiske praksis [2], [3]. Livsstil relateret prædisponerende modificerbare risikofaktorer for CRC omfatter fysisk inaktivitet, overvægt og fedme, rødt og forarbejdet kød forbrug, rygning og alkoholmisbrug [3].

CRC er en heterogen sygdom med komplekse ætiologi og kan være forårsaget, delvis ved genetiske og epigenetiske ændringer, som kan virke synergistisk og omdanne epitelcellerne i adenocarcinomer [4]. En genetisk ændring, der forekommer i adenomer (10%) samt karcinomer (40%) i colon og rektal cancer er den onkogene aktivering af KRAS-genet ved mutationer [5]. Kras protoonkogen koder for et protein (p21-ras) tilhører familien af ​​GTP /GDP-bindende proteiner med GTPase aktivitet og er involveret i transduktionen af ​​mutagene signaler [6].

epigenetisk inaktivering af gener også spiller en vigtig rolle i inaktivering af tumorsuppressorgener i carcinogenese [7]. Aberrant DNA-methylering i CpG-øer i promotorregionen begynder tidligt i tumorigenese og er et vigtigt epigenetisk mekanisme ligger til grund for inaktivering af tumorsuppressorgener [8]. RASSF1 genet er et formodet tumorsuppressorgen virker ved G1 /S fase af cellecyklus-progression [9]. Gene silencing som følge af afvigende promotor methylering i RASSF1A kan være en vigtig sygdomsfremkaldende begivenhed i tumorigenese og er blevet anerkendt som et alternativ markør at nedregulere Ras vej [10].

Den menneskelige FHIT gen et tumorsuppressorgen , er et medlem af histidintriade genfamilien [11]. Methylering af FHIT genet er blevet bemærket i flere faste tumorer og en forkortet eller fuldstændigt tab af ekspression af FHIT protein har vist sig at skyldes gen methylering fører til dens transkriptionelle inaktivering og sygdomsprogression [12].

O

6-methylguanin-DNA-methyltransferase (MGMT) er et DNA-reparation enzym fjerner alkylgrupper fra O

6-stillingen i guanin [13]. MGMT promotor hypermethylering og epigenetisk inaktivering udløser ofte forekomme som tidlige begivenheder i carcinogenese [14].

Den foreliggende undersøgelse blev således udført for at undersøge den rolle af genetisk mutation i Kras genet og epigenetisk modifikation i RASSF1A, FHIT og MGMT gener enten sammen eller uafhængigt i adenocarcinomatous sporadisk CRC i den indiske befolkning og deres sammenhæng med de klinisk-patologiske variabler af CRC.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

i alt af 124 træk kirurgisk resektion friske vævsprøver bestående af 62 tumorvæv og 62 tilstødende normale regioner kontrol (normal ikke tumorform sund mucosa på 2 cm afstand fra tumor) [15] af primær sporadisk CRC blev indsamlet til analyse i nærværende undersøgelse . Kun de sager, der opfylder vores inklusionskriterier såsom hinanden følgende tilfælde med en primær diagnose af kolorektal cancer undergår upfront kirurgi blev taget op i forbindelse med denne undersøgelse. Ingen af ​​disse patienter havde modtaget nogen præoperative behandling i form af stråling eller kemoterapi. Alle vævsprøver blev indsamlet inden for 10 minutter resektion. Vævsprøver blev delt i to dele; den ene del blev sendt til histopatologisk diagnose og iscenesættelse og den anden halvdel blev opbevaret ved -80 ° C i molekylær analyse. Histopatologiske kvaliteter og klinisk iscenesættelse blev evalueret i henhold til standard kriterier [16] med to uafhængige patologer med 5 tilfælde sorteres samt differentieret adenocarcinom, 41 som moderat differentieret adenocarcinom, 15 som dårligt differentieret adenocarcinom og en patient som udifferentieret adenocarcinom mens 8, 25, 25 og 4 patienter blev scoret som etape 1, 2, 3 og 4, hhv. Kun histopatologisk bekræftede tilfælde blev inkluderet til yderligere molekylær analyse. Nærmere oplysninger om hver patient relateret til deres demografiske profil, vaner, tegn og symptomer, personlige historie, undersøgelser, tumor profil herunder metastase og histopatologi rapporter, yderligere behandling og opfølgning oplysninger blev også registreret. Med hensyn til kostvaner, blev krydret mad klassificeret som brugen af ​​krydderier, især varme krydderier og chili i kosten i hvert måltid regelmæssigt (3-5 gram per måltid), ikke vegetarisk kost blev betragtet som indtagelse af rødt kød (mindst tre gange om ugen) og fede kost blev bedømt efter indtag af højt fedtindhold kost af enhver type med øget brug af madolier i hvert måltid ( 10 ml sennepsolie per måltid). Alle de deltagende patienter i undersøgelsen var kroniske alkoholikere (gennemsnitlig brug af alkohol 100-150 ml pr dag mindst 3-4 gange om ugen), rygere (mindst en pakke med 10 cigaretter om dagen) og tobak chewers (4-6 pakker om dagen). Undersøgelsen blev godkendt af de etiske udvalg i de deltagende institutioner og forudgående skriftligt informeret samtykke blev taget fra patienterne inden indskrivning i undersøgelsen. Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsingfors-erklæringen [17].

DNA Extraction

Høj molekylvægt genomisk DNA blev ekstraheret fra ~300 mg tumor og normale tilstødende vævsprøver ved standardmetoden med proteinase K-fordøjelse efterfulgt af phenol-chloroformekstraktion [18]. DNA mængde /kvalitet blev kontrolleret spektrofotometrisk (NanoDrop ND-1000-version 3.6.0, Thermoscientific, Willington DE USA) /1% agarosegelelektroforese og opbevares til senere brug ved -20 ° C.

Kras Mutation analyse

DNA blev amplificeret i en reaktionsblanding 25 pi indeholdende 25 pmol af både fremadrettet og revers primere, 25 mM af hver dNTP og 0,2 U Taq DNA-polymerase. Primersekvenserne er blevet beskrevet andetsteds [19]. Oligonukleotidprimerne blev syntetiseret på et automatiseret Applied Biosystems DNA-synteseapparat (Model 381A; Applied Bio-systems, Foster City, CA, USA) under anvendelse af phosphoramidit-metoden og renset i højtydende væskekromatografi (HPLC). Endvidere blev restriktionsfragmentlængde-polymorfisme analyse udført med MvaI og Bgll til kontrol af tilstedeværelse af mutationer i kodon 12 og 13 i KRAS-genet. Fordøjelsesprodukteme blev derefter visualiseret ved ethidiumbromidfarvning under UV lys efter elektroforese på 4% agarosegel. Resultaterne blev bekræftet ved sekventering.

Methylering Specifik Polymerase Chain Reaction (MSP)

Genomisk DNA blev modificeret ved hjælp af EZ DNA-methylering Gold Kit (Pro Lab Marketing, Delhi, Indien), som pr instruktionerne rådighed efterfulgt af PCR med methylerede og ikke-methylerede primere til at definere mønstre for methylering. Primersekvenserne af hver genpromotor for både methylerede og ikke-methylerede former er tidligere blevet beskrevet [7], [20]. Hot start PCR blev udført, og produkterne blev underkastet elektroforese på en 2,5% agarosegel og visualiseret under UV-belysning efter farvning med ethidiumbromid.

Statistical Analysis

Alle statistiske analyser blev udført ved standardmetoder ved anvendelse af SPSS software (Version 16, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Fischers eksakte test eller Chi Square Test blev anvendt som gældende. Resultaterne blev betragtet som statistisk signifikant ved p-værdier for 0,05. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet af Kaplan Meier overlevelse metode [21]

Resultater

Samlet analyse baseret på demografiske Klinisk profil og overlevelse af CRC Patienter

Af de 62 analyserede sager, tumor blev placeret i tyktarm, endetarm og rectosigmoid regioner i 66%, 24% og 10% tilfælde, hhv. Størstedelen af ​​patienterne (76%) var mænd. Gennemsnitsalderen for de tilfælde inkluderet i undersøgelsen var 55 år på tidspunktet for diagnosen. Co følgesygdomme, herunder diabetes, forhøjet blodtryk, tuberkulose mm blev rapporteret i 27% tilfælde og 16% tilfælde havde en familie historie af kræft, mens ingen af ​​tilfældene havde en familie historie CRC. Vægttabet var den mest almindelige tegn (63%, gennemsnitlig varighed 6 måneder), efterfulgt af mavesmerter (57%, gennemsnitlig varighed 1 år) og blødning pr rectum (50%, gennemsnitlig varighed 3 måneder). Blandt de livsstilsfaktorer, blev højt indtag af fede kost hyppigst observerede (52%) efterfulgt af ikke-vegetarisk diæt (48%) og fødevarer rig på krydderier (47%) (tabel 1). Alkoholindtag og rygevaner blev observeret i 45% og 42% af patienterne, henholdsvis i vores undersøgelse. Foreningen blev yderligere tydeligt i tilfælde af mandlige patienter, hvor 60% og 53% af patienterne havde de ovennævnte vaner (p-værdier 0,001 0,001, henholdsvis). Den biokemiske profil af alle patienter er inkluderet i tabel S1. Den samlede overlevelse af patienterne var 94% efter 1 år med en median opfølgning på 2 måneder (interval 1-19 måneder).

Analyse af Kras mutationer ved codon 12 og 13 i CRC

i betragtning af den vigtige rolle, som RAS proteiner, især Kras i carcinogenese, Kras genmutation blev analyseret og observeret i 47% (29/62) tilfælde ved codon 12 og i 19% (12/62) tilfælde i codon 13 i tumor region. Mutationen blev også observeret i 29% og 18% tilstødende kontrolregioner ved kodon 12 og 13, henholdsvis. Alkoholindtag, rygning og indtagelse af krydret mad blev observeret hyppigere hos patienter med mutante Kras codon 12 sammenlignet med dem med vildtype Kras (59%, 69%, 55% vs. 33%, 18% og 39%, henholdsvis) og var statistisk signifikant i forhold til alkoholforbrug og rygevaner (p-værdier 0,047, 0,001) (tabel 2). De fleste af de tilfælde med Kras genmutation codon 12 var karakteristisk for tumor stadie 3 (52%) og histologisk moderat differentieret kvalitet (66%). Tumor stadium og metastase viste sig også at være signifikant associeret med tilstedeværelsen af ​​mutant Kras codon 12 (p-værdier 0,018, 0,044). Men sammenslutning af tumor kvalitet og lymfe invasion med mutant Kras var ikke statistisk signifikant (tabel 3).

Analyse af RASSF1A Promotor Methylering i CRC

Promotor hypermethylering i RASSF1A genet blev observeret i 47% (29/62) tilfælde af CRC i tumoren regionen og i 13% af tilstødende kontroller. Blandt de livsstilsfaktorer, hyppigheden af ​​alkoholforbrug, fede kost og rygning var mere i tilfælde af patienter med methyleret RASSF1A sammenlignet med dem med umethyleret RASSF1A (55%, 55% og 55% vs. 36%, 49% og 30% henholdsvis) (tabel 2). Et betydeligt antal sager med denatureret RASSF1A gen havde tumor stadie 3 (45%) og moderat differentieret bedømmelse (59%). Tumor fase, metastaser og lymfe invasion korreleret signifikant med tilstedeværelsen af ​​methylerede RASSF1A (p-værdier 0,034, 0,044 og 0,048 henholdsvis), men der var ingen sammenhæng tumor kvalitet med methylerede RASSF1A (tabel 3).

Analyse af FHIT Promotor Methylering i CRC

Methyleret FHIT genet blev observeret i 37% (23/62) tilfælde af CRC. FHIT methylering blev også observeret i 13% tilfælde i den tilstødende kontrolregion. Patienter med methylerede FHIT gen havde en højere forekomst af ikke-vegetarisk og fede kost sammenlignet med umethylerede gruppe (61% og 52% vs. 41% og 51%, henholdsvis). Der blev imidlertid ikke statistisk sammenhæng observeret (Tabel 2). Flertal af tilfældene med denatureret FHIT gen var tumor stadie 3 (70%) og moderat differentieret histologisk bedømmelse (65%). Tumor stadium, metastase og tilstedeværelse af lymfatisk invasion var signifikant forbundet med tilstedeværelsen af ​​methyleret FHIT (p-værdier 0,001, 0,047 og 0,004, henholdsvis). Men vi kunne ikke observere nogen sammenhæng mellem tumor kvalitet og methylerede FHIT (tabel 3).

Analyse af MGMT Promotor Methylering i CRC

Methyleret MGMT genet blev observeret i 47% (29/62 ) tilfælde af CRC i tumoren regionen og i 13% tilfælde i de tilstødende kontrolregioner. Desuden blev rygning og alkoholindtag mere almindeligt rapporteret af patienter med methyleret MGMT gen sammenlignet med ikke-methyleret gruppe (66% og 62% vs. 21% og 30%, henholdsvis). Korrelationen var særlig tydelig og afgørende i tilfælde af alkoholindtag og rygning og tilstedeværelsen af ​​MGMT methylering (p-værdier 0,013, 0,001) (Tabel 2). Højere antal sager med denatureret MGMT gen var tumor stadie 3 (52%) og moderat differentieret bedømmelse (66%). Tumor stadium, metastase og lymfe invasion fandtes at være signifikant korreleret med tilstedeværelsen af ​​methyleret MGMT-genet (p-værdier 0,018, 0,044 og 0,048, henholdsvis). Men sammenslutning af tumor kvalitet med methylerede MGMT gen var ikke statistisk signifikant (tabel 3).

Kombinatorisk Effekt af genetisk mutation i Kras Gene og Epigenetisk Ændring i RASSF1A, FHIT og MGMT Gener i CRC

til sammenligning af forekomsten af ​​mutation /methylering af ét gen i nærvær af mutation /methylering af et andet gen, blev det observeret, at generne havde den kombinerede tilstedeværelse af mutation /methylering i størstedelen af ​​tilfældene og resultaterne viste sig at være statistisk signifikante (p-værdier 0,025, 0,005) (tabel 4). Kun 15% (9/62) patienter viste ikke tilstedeværelsen af ​​Kras mutation eller RASSF1A, FHIT og MGMT methylering. Interessant, Kras mutation /RASSF1A, FHIT og MGMT methylering var mere almindelige hos patienter med en tidligere historie af alkoholforbrug 89% (25/28), tobak tygge 86% (12/14), rygning 96% (25/26), fede kost 78% (25/32), uregelmæssig indtagelse af frugt 100% (18/18), indtagelse af krydret mad 79% (23/29) og ikke-vegetarisk kost 87% (26/30). Herudover er ingen af ​​tilfældene havde tilstedeværelsen af ​​mutation /methylering i den tilstødende kontrolregion kun og ikke i tumoren region. Endvidere blev en sammenligning af den kliniske profil med den kombinatoriske virkning af variationer i gener i 62 patienter med sporadisk CRC udført, og det blev observeret, at de kliniske træk blev mere almindeligt observeret hos patienter med stigende antal variation i generne med hensyn til genetiske mutation i KRAS-genet og /eller promotor hypermethylering i MGMT, FHIT og RASSF1A gener i sporadisk CRC (tabel 5). Generelt blev fremskreden tumor stadium (97%), metastatisk sygdom (100%), moderat til dårligt differentieret tumorer (84%) og tilstedeværelse af lymfatisk invasion (92%) observeret hyppigere i tumorer med muteret Kras (kodon 12) og methylerede RASSF1A, FHIT og MGMT gener. Også promotor hypermethylering i RASSF1A, FHIT og MGMT gener korreleret signifikant med tilstedeværelsen af ​​lymfatisk invasion i modsætning til mutation i Kras genet.

Diskussion

Udviklingen af CRC er en flertrinsproces og bredt undersøgt model i tumorigenese. Underliggende ændringer på genetiske og /eller epigenetisk niveau kan være involveret i den overordnede udvikling af CRC [4], [22]. Nylige undersøgelser har fokuseret på de mutationer og mønstre for methylering af adskillige gener impliceret i udviklingen af ​​CRC. CpG ø promoter methylering for transkriptionel inaktivering kan forekomme på forskellige stadier af colon tumorigenese, der påvirker forskellige typer af CRC i forskellig grad [23]. Identifikation af samspillet mellem genetiske og epigenetiske ændringer kan støtte i at konstruere personlige og specialiserede diagnostiske molekylære profiler og udvikling af nyere terapeutiske strategier [4]. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at belyse den rolle, genetisk mutation i Kras genet og epigenetisk modifikation i RASSF1A, FHIT og MGMT gener i udviklingen af ​​adenocarcinomatous sporadisk CRC i den indiske befolkning.

af de 62 patienter, der indgår i undersøgelsen, de mest almindelige tegn og symptomer rapporteret var vægttab (63%), mavesmerter (57%) og blødning pr rectum (50%). Andre undersøgelser har også rapporteret blødning i afføring, mavesmerter, diarré eller forstoppelse som vigtige tegn og symptomer på CRC [24].

Den samlede hyppighed af Kras mutation codon 12 og 13 var 47% og 19%, henholdsvis. Mutationen blev også observeret i 29% og 18% tilstødende kontrolregioner ved kodon 12 og 13, henholdsvis. Dette fund sandsynligvis peger ud mod det faktum, at selv om den tilstødende slimhinde var normal og ikke tumorform på patologi, de molekylære forandringer i form af mutation måske allerede er iværksat i denne region også. Dette kunne derfor være involveret i spredningen af ​​sygdommen og dermed Kras mutation kan betragtes som en tidlig markør for at identificere spredning af sygdommen i de tilstødende områder. Undersøgelser på verdensplan har rapporteret hyppigheden af ​​Kras mutation i CRC til at ligge mellem 25-60% [25], og den hyppigst forekommende typer af mutationer er G A overgange og G T transversioner [6]. Kras mutation analyse er blevet stadig vigtigere i CRC til angivelse anti-EGFR-antistof terapi som en prædiktiv markør i CRC [26]. Kliniske forsøg specifikt fokus på denne gruppe er det emergente behov for time.

Forskellige undersøgelser har impliceret de underliggende faktorer og mekanismer i kolorektal carcinogenese og rapporteret inddragelse af livsstilsfaktorer herunder indtagelse af fedt, kost, kosten folat og alkohol indtag i udviklingen af ​​CRC [5], [27], [28], [29]. Højt indtag af fedt er også forbundet med en øget risiko for muterede Kras colontumorer [5]. I den foreliggende undersøgelse blev der imidlertid ingen statistisk sammenhæng observeret, og disse resultater understøttes af andre [30], [31]. Eksperimentelle undersøgelser antyder, at biprodukter såsom malondialdehyd (MDA) og 4-hydroxynonenal (4-HNE) kan opbygges og gemmes på grund af peroxidation af v-6 polyumættede fedtsyrer (PUFA), som igen vil kunne reagere med DNA til dannelse af addukter ligesom pyrimidopurinone addukt af deoxyguanosin (M1G), yderligere resulterer i hovedsagelig G A og G T transversioner i bakterier [5]. Det er bemærkelsesværdigt at nævne her, at forekomsten af ​​CRC er alarmerende stigende i Indien hovedsageligt skyldes ændringer i livsstilsmønstre. Urban livsstil har været vidne tilsætning af forskellige modifikationer i kostvaner involverer øget indtag af junk fødevarer. Hjemmelavet mad er gradvist bliver erstattet af lette at forberede readymade fødevarer. Frugt, grøntsager og krydderier indeholder forøgede mængder af salicylsyre er blevet vist at have en anticancervirkning ved sensibilisering de normale celler til at unddrage tumordannelse [32]. Imidlertid har forfalskning i krydderier og øget brug af kemikalier i kunstig modning og vækst af frugt og grøntsager faldt anticancer potentiale af disse fødevarer. Magalhaes et al [33] har rapporteret, at risikoen for tyktarmskræft blev forøget med højt indtag af rødt og forarbejdet kød, men ikke signifikant sammenhæng blev observeret med rektal cancer. Det er blevet foreslået, at G4a overgange ved den anden base af kodon 12 eller 13 i KRAS-genet i det humane colon kunne skyldes de N-nitrosoforbindelser, til stede i forarbejdet kød eller endogent dannet [34]. Heterocykliske aromatiske aminer (HAA) kunne dannes på grund af høj temperatur kogning af kødproteinerne mens grilning og rygning af kød genererer polycykliske aromatiske hydrocarboner (PAH) som følge af fedt slippe på åben ild [28]. Shin et al har foreslået rolle cigaretrygning og alkohol i colorektal carcinogenese. Cigaretrygning blev fundet for at indebære en højere risiko for avancerede adenomer og 3 eller flere adenomer end for enkelt risiko eller enkelt adenomer [35]. Potentielle biologiske mekanismer for denne forening omfatter kræftfremkaldende virkning af polycykliske aromatiske hydrocarboner (PAH), nitrosaminer og aromatiske aminer, enten til stede i eller er fremstillet af, brændende tobak [36]. Flere måder er blevet foreslået til virkningen af ​​alkohol på risikoen for CRC herunder acetaldehyd, et oxidationsprodukt af alkohol [37]. Det er også blevet observeret, at mikrobielt produceret acetaldehyd fra ethanol kan øge risikoen for tyktarmskræft via folatmangel [38]. Alkohol er en antagonist af methyl-gruppe metabolisme og kan bidrage til unormal DNA-methylering eller kan øge risikoen for CRC indirekte gennem immunsuppression, forhaling af DNA-reparation, aktivering af lever procarcinogens ved induktion af cytochrom P-450 enzymer, eller ændringer i galde syresammensætning [39]. I nærværende undersøgelse blev rapporteret alkoholindtag og rygevaner i 45% (28/62) og 42% (26/62) tilfælde, hhv. Foreningen var særlig tydeligt i forbindelse med mandlige patienter, hvor 60% og 53% af patienterne havde disse vaner og er i overensstemmelse med resultaterne af Cho et al [40].

De promotorområder af flere tumorsuppressorgener indeholde CpG øer og kan være involveret i gendæmpning ved methylering [22]. RASSF1A promotor methylering blev observeret i 47% tilfælde. Andre forfattere har rapporteret frekvensen af ​​RASSF1A mehylation mellem 16-81% tilfælde i CRC [41], [42]. Det har potentiale til at være en ideel cancer biomarkør, forekommer i en lang række tumortyper og forholdsvis ikke bredt observeret i de normale væv [10]. RASSF1A methylering blev også observeret i kun 8 sager i den normale slimhinde tyder på, at methylering begivenhed kan sandsynligvis er blevet indledt i den tilstødende region også. Aktuelle og formere rygere har vist sig at have en højere forekomst af RASSF1A methylering og forekomsten er endnu højere i tumorer af en højere kvalitet, senere og mere invasive eller metastatiske tumorer [10]. I den foreliggende undersøgelse, 42% af patienterne havde en historie af rygning. Nogle undersøgelser har antydet en omvendt korrelation mellem RASSF1A methylering og Kras mutation i CRC [43]. Det er ikke sikkert, hvordan RASSF1A påvirker dens biologiske adfærd på trods af deres direkte /indirekte interaktion med aktiverede Ras. Imidlertid har vores undersøgelse vist en synergi mellem disse to gener, som kan simpelthen understreger vigtigheden af ​​et væld af gener involveret i signalvejen.

FHIT promotor methylering blev observeret i 37% tilfælde. FHIT promotor hypermehylation er blevet påvist i 20-71% tilfælde i CRC ved kun to forfattere [44], [45]. Sultana et al har foreslået, at FHIT genet kan være involveret i ætiologien af ​​andre end livmoderhalskræft forskellige kræftformer, dog understøttende data er knappe [46]. Selv alternativ splejsning af humane FHIT ikke er direkte forbundet med carcinogenese, kan FHIT inaktiveres hyppigt af exon skipping, intron fastholdelse og aktivering af kryptiske splejsningssites i exon 6 i CRC [47]. Unormal ekspression af FHIT kandidat tumorsuppressorgen er blevet observeret i en række humane tumorer, men kun lidt om dets ekspression under kolorektal tumorigenese. En undersøgelse fra Storbritannien har vist reduceret ekspression af FHIT i en lille del af colon forstadier til kræft og i øget omfang af primære og metastatiske kolorektal kræft tyder på, at FHIT spiller en rolle i udviklingen og progressionen af ​​nogle tyktarmskarcinomer [48]. Vores seneste undersøgelse har vist roman missense mutation i FHIT genet og fortolkede effekt i HPV-medieret livmoderhalskræft i indiske kvinder [49].

MGMT promotor methylering blev observeret i 47% tilfælde i nærværende undersøgelse. MGMT promotor hypermehylation er blevet påvist i 20-41% tilfælde i CRC [8], [25], [50]. Har også vist sig, MGMT tab at være forbundet med mutationer i Kras [14]. Sidhu et al [13] har vist, at forekomsten af ​​MGMT hypermethylering er betydeligt højere blandt forsøgspersoner med historie af rygning, alkoholisme og indtagelse af ikke-vegetarisk mad blandt prostatakræft sager, kontroller og patienter med benign prostatahyperplasi. Vi observerede, at rygning (66%) og alkohol indtag (62%) var de mest almindelige livsstilsfaktorer observeret hos patienter med MGMT hypermethylering. MGMT hypermethylering har vist sig at være nyttige prædiktorer for prognose og lydhørhed i gastrisk kræft og maligne gliomer [51], [52].

Brink et al [6] og Cejas et al [53] har ikke vist nogen statistisk sammenhæng mellem tumor scenen og metastase med Kras mutation. Men vores resultater er overensstemmende med den observeret ved Mannan A [54], hvor de fandt, at KRAS-mutationer er signifikant associeret med lymfeknudemetastaser og tumor stadium, men ikke med væksten mønster af colon carcinomer. KRAS-mutationer kan være signifikant involveret i den biologiske udvikling af sygdommen, dermed påvirke dens generelle opførsel og reaktionsevne.

Baseret på resultaterne, det kombinatoriske tilstedeværelse af muterede Kras (kodon 12) og methyleret RASSF1A, FHIT og MGMT gener bedre karakterisere avanceret tumor stadie, metastatisk sygdom, højere lønklasse tumorer og tilstedeværelse af lymfatisk invasion end når de betragtes hver for sig. Den conjunctional forekomst af mere end én variant kan virke synergistisk i at påvirke aggressivitet af denne sygdom og initiere tumordannelse på disse steder. Disse genetiske og epigenetiske variationer arbejde i fællesskab at beslutte den overordnede skæbne af sygdommen. Det er ikke klart, hvilke indtræffer først, DNA hypermethylering eller genetisk mutation. I kræft, er barrieren kontrollere spredningen af ​​DNA-methylering fra promotorregionen til transkriptionen stedet forkortede, derfor spiller en kritisk rolle i tumorudvikling, initiering og progression.

Sammenligninger i overlevelse mellem vildtype /umethyleret gruppen versus mutant /methyleret gruppe blev udført, men var ikke statistisk signifikante (p-værdi 0,05). Dette kan skyldes, at de kortere opfølgning data og det faktum, at kun en begivenhed (død) indtraf blandt kohorte af patienter inkluderet i undersøgelsen.

Tilsammen data viste, at tumor stadie 3, moderat differentieret tumorer, tilstedeværelse af lymfatisk invasion og fravær af metastaser blev observeret hyppigere i tumorer med muteret Kras og methylerede RASSF1A, FHIT og MGMT gener. Derfor kan disse markører anvendes til at vurdere den overordnede patologiske status af sygdommen bedre målrette denne heterogen gruppe af kræftsygdomme. Konklusionen er, genetisk mutation i Kras genet og epigenetisk modifikation RASSF1A, FHIT og MGMT gener i sporadisk CRC er forbundet med den overordnede udvikling af sygdommen og kan anvendes som diagnostiske eller prognostiske markører i denne gruppe af kræftsygdomme. Den synergistiske indbyrdes forhold mellem de genetiske og epigenetiske faktorer i kolorektal tumorigenese kan hjælpe med at forbedre den overordnede tilgang til denne sygdom.

Støtte oplysninger

tabel S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0060142.s001

(DOC)

Tak

Forfatterne vil gerne takke alle de patienter og deres pårørende for støtte og samarbejde . Desuden vil vi gerne anerkende Rajiv Gandhi Cancer Institute Forskningscenter, Delhi, Indien for at give de biologiske prøver og kliniske oplysninger og indiske Råd for Medicinsk Forskning, New Delhi, Indien og Institut for Cytologi Forebyggende Oncology (ICMR), Indien for at levere de centrale infrastrukturelle faciliteter og institutionel finansiering.