PLoS ONE: Fetal stråling Eksponering inducerer testikelkræft i genetisk modtagelige Mice

Abstrakt

Forekomsten af ​​testikelkræft kimcelletumorer (TGCT), en fælles fast væv malignitet hos unge mænd, har været årligt stigende med en alarmerende sats på 3%. Da hovedparten af ​​testikelcancere er afledt af kønsceller på tidspunktet for omdannelsen af ​​oprindelige kønsceller (PGC) i gonocytes, har stigningen været tilskrevet moderen /føtale eksponering for miljøfaktorer. Vi undersøgte virkningerne af en østrogen (diethylstilbestrol, DES), et antiandrogen (flutamid) eller stråling på forekomsten af ​​testikelkræft kønsceller tumorer i genetisk disponerede 129.MOLF-L1 (L1) kongene mus ved at udsætte dem for disse midler på dage 10.5 og 11.5 af graviditeten. Hverken flutamid eller DES produceret mærkbare stigninger i testis cancer forekomst på 4 ugers alderen. I modsætning hertil to doser 0,8-Gy stråling øget forekomst af TGCT fra 45% til 100% i afkommet. Procentdelen af ​​mus med bilaterale tumorer, vægte af testikler med TGCT, og procentdelen af ​​tumorer, der var klart teratomer var højere i de bestrålede mus end i kontroller, hvilket indikerer, at bestråling induceret mere aggressive tumorer og /eller flere foci af initieringssteder i hvert testis. Denne strålingsdosis ikke forstyrrede spermatogenese, som var kvalitativt normalt i tumor-fri testikler selv om de blev reduceret i størrelse. Dette er den første bevis på induktion af testikelkræft af en miljømæssig middel og foreslår, at den mandlige foster kvinder udsat for stråling ved ca. 5-6 uger af graviditeten kan have en øget risiko for udvikling testikelkræft. Desuden giver en roman redskab til at studere de molekylære og cellulære begivenheder i testikelkræft patogenese

Henvisning:. Shetty G, Comish PB, Weng CCY, Matin A, Meistrich ML (2012) Føtal stråling Eksponering Fremkalde testikelkræft i genetisk disponerede mus. PLoS ONE 7 (2): e32064. doi: 10,1371 /journal.pone.0032064

Redaktør: Austin John Cooney, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: 28 oktober, 2011; Accepteret: 19 januar 2012; Publiceret: 13. februar 2012 |

Copyright: © 2012 Shetty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Firenze M. Thomas Professorat i Cancer Research (til Marvin L Meistrich) og Cancer center Support Grant CA 16672 fra National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Testikel kønsceller tumorer (TGCT) er den mest almindelige ondartet svulst i kaukasiske mænd i alderen mellem 15 og 40 år. Humane TGCTs hovedsageligt klassificeres histologisk ind seminomer, som ligner de primordiale kønsceller (PGC’er), og ikke-seminomer, som enten udifferentieret (embryonal carcinom) eller differentieret viser embryoniske (teratoma) eller ekstra-embryonale (blommesæk) mønsterdannelse [1 ]. Teratomer er kendetegnet ved differentieringen til en bred vifte af celle- og vævstyper. Den mediane alder for debut af forskellige tumor typer adskiller med seminomer opstår på omkring 35 år, de fleste ikke-seminomer på 25 år, og de fleste teratomer og blommesækken tumorer på omkring 1,5 år. Ud fra følgende betragtninger tumorer forekommer hos voksne der forud for carcinoma in situ (CIS), der indeholder celler tæt op ad gonocytes, er dem, der fremgår i børn ikke forud for CIS [2]. På trods af disse forskelle understøtter beviser en fælles underliggende patogenese af disse tumorer såsom lignende kromosomafvigelser, forstærkede kromosomale regioner og udtryk for pluripotens gener [3]. Alle disse tumorer er afledt af celler med karakteristika af primordiale kønsceller (PGC) eller gonocytes, om end på forskellige udviklingstrin vurderet af omfanget af sletning af den oprindelige biparentale prægning eller senere etablering af faderlig prægning.

Der har været en årlig stigning på 3% i forekomsten af ​​TGCTs hos unge kaukasiske mænd i hele verden i de sidste 50 år [4], men årsagerne er undvigende. Belysning af årsagen til denne stigning er vigtig for mulig forebyggelse eller tilbageførsel af denne stigning.

Da testikelkræft celler stammer fra primordiale kønsceller (PGC’er) eller gonocytes [2] stigningen er blevet tilskrevet mødres og føtale eksponering for miljøfaktorer, med mest opmærksomhed givet til hormonforstyrrende stoffer såsom østrogener og antiandrogener [5], [6], [7]. Ioniserende stråling, et kendt kræftfremkaldende stof [8], der øger forekomsten af ​​barndommen og andre voksne kræft hos personer udsat under fosterudviklingen [9], [10], har fået lidt undersøgelse. En case-kontrol undersøgelse viste, at eksponering for ioniserende stråling under graviditeten øgede risikoen for testikelkræft i mandlige afkom [11].

Den eneste murine model for TGCT er de spontane teratomer, der oprindeligt blev observeret i 129 /Sv mus [12]. De synes mest ligner de infantile TGCTs i human fordi kønsceller hurtigt udvikle sig til tumorer efter fødslen. Men ligesom alle menneskelige TGCT typer, musen teratomer også stammer fra PGC’er eller gonocytes. Hertil kommer, defekter i de samme gener, kit-ligand (KITL) og Dmrt1, dramatisk øge forekomsten af ​​teratom i mus [13], [14] og er forbundet med eller prædisponere mennesker til de voksne TGCTs [15], [16 ]. Disse eksempler viser, at denne mus teratom model kan være relevant for de voksne former for menneskelig testikelkræft så godt, selv om der er betænkeligheder ved en sådan ekstrapolation [1].

I de 129 /Sv mus, omkring 3- 10% udvikler spontane TGCTs. Kongene mus på en 129 baggrund er udviklet; de, der indeholder alle af kromosom 19 afledt af Molf-stammen har en 80% forekomst af TGCTs [17] og de transporterer dele af kromosom 19 display varierende niveauer af tumorincidensen [18], [19]. I den aktuelle undersøgelse anvendte vi den 129.MOLF-L1 (L1) kongene stamme, med en rapporteret 30% incidens af TGCTs, at maksimere kraften i undersøgelsen. Vi brugte denne musemodel for at teste effekten af ​​østrogen, antiandrogen og ioniserende stråling eksponering på TGCT forekomst. Engagementer blev gjort på E10.5 og 11,5, som er lige efter de primordiale kønsceller (PGC’er) kolonisere fosterets gonade, og undergår omfattende epigenetiske forandringer, der undertrykker deres potentiale til at vende tilbage til en pluripotent tilstand og forpligte dem til at kønsceller udvikling [20 ].

Resultater

Vi undersøgte effekten af ​​behandlingerne med et østrogen (diethylstilbestrol, DES), et antiandrogen (flutamid) eller bestråling på forekomsten af ​​TGCT i en dyremodel. Vi udsatte gravide L1 hunner til agenterne på dagen 10.5 og 11.5 af graviditeten.

Der var ingen effekt af flutamid, DES eller bestråling på reproduktive evne til dæmninger (tabel 1). Dette blev bekræftet af de tilsvarende procenter af mus, der producerer afkom efter vellykket parring og de sammenlignelige kuldstørrelse i de behandlede og de respektive kontrol- dæmninger.

Testikler blev høstet fra den mandlige afkom og mange af dem indeholdt synlige tumorer (figur 1A og B). Histologisk undersøgelse bekræftede, at de fleste af disse var teratomer med væv fra flere dermale oprindelser, men nogle kun indeholdt neuroepitelceller (figur 1C og D). Flutamid ikke signifikant øge forekomsten af ​​samlede TGCTs (30% af testikler havde tumorer vs. 21% i kontrol). Men det lidt øge forekomsten af ​​TGCTs der blev bekræftet at være teratomer ved tilstedeværelsen af ​​flere dermal oprindelse celletyper (24% af testikler vs. 14% i kontrol,

P

= 0,04) (Tabel 2 ).

testikelkræft morfologi viser bilateral (A) og ensidige (B) TGCTs fra bestrålede mus. Bemærk, at testiklerne uden TGCT efter

i livmoderen

stråling (B) er mindre end den normale ubehandlet testis fra en 4 uger gammel mus (indsæt i B). Testikel sektioner viser teratoma med væv tilsyneladende fra flere dermale oprindelser identificeret ved morfologi (C) og TGCT der kun indeholder neuroepitelceller (NE) (D). CA: brusk; BM: knoglemarv; MS: muskel, EEP: endodermal epitel. ST: sædkanalerne; BV: blodkar. Sektioner fra testikler af 4 uger gamle bestrålet (E) og contol (F) mus uden TGCT viser kvalitativt normal spermatogenese. Bar: 0,5 cm i A B, og 50 um i C-F. Vejviser

Dosis af DES givet var effektiv i at handle på embryoet som det forårsagede kryptorkisme i 16% af testiklerne. Men der var ingen tegn på, at det fremkaldt kræft (kun 3 af 24 testikler analyserede indeholdt TGCTs). Ligeledes i en undersøgelse med behandling af gravide 129 mus, havde en dosis ethinyløstradiol at øget kryptorkisme hos afkommet ikke medføre en betydelig ændring i forekomsten af ​​teratomer [21].

I modsætning hertil bestråling af hannerne under fosterudviklingen med to doser på hver 0,8 Gy førte til TGCTs i 80% af testiklerne (sammenlignet med 28% i kontrol) og i 100% af den mandlige afkom (tabel 2). Antallet af mus med unilaterale og bilaterale tumorer i alle grupper var binomialfordelt, bekræfter en tidligere rapport, at forekomsten af ​​en tumor i hver testikel var en uafhængig begivenhed [18]. Vægtene af testikler med TGCTs og procentdelen af ​​tumorer, der blev bekræftet teratomer var højere i de bestrålede mus end i kontroller, hvilket indikerer, at bestråling induceret mere aggressive tumorer og /eller flere foci af initieringssteder i hvert testikel.

de to strålingsdoser på 0,8 Gy ikke forstyrrede spermatogenese, som var kvalitativt normalt i testikler, som ikke indeholdt teratom (figur 1 E og F). disse tumor-fri testikler fra bestrålede mus, havde imidlertid reduceret vægte i forhold til dem fra kontroller (tabel 2), hvilket tyder på, at bestråling havde forårsaget nogle tab eller hæmning af spredning af PGC’er og /eller somatiske celler.

Diskussion

i den foreliggende undersøgelse utvetydigt viste vi, at føtal eksponering stråling under E10.5-E11.5 inducerer testikelkræft kønsceller kræft, hvoraf de fleste viser de mange dermale oprindelser typiske for teratomer, i en genetisk modtagelige musemodel. Dette er den første demonstration af induktion af testikelkræft af et miljømæssigt middel, når det udsættes under embryonisk periode. Yderligere karakterisering af modellen til at bestemme den optimale eksponeringstid eller intervaller, dosis-respons, og virkningerne på mindre modtagelige musestammer er nødvendig for at igangsætte mekanistiske undersøgelser og risikovurdering.

konstateringen af, at strålingen dramatisk forøget forekomst af testikelkræft hos mus tilbyder et nyt værktøj til at undersøge den mekanisme, hvorved de PGC’er tilbage til pluripotente embryonale celler. Når mus PGC’er ankommer i gonaderne ved E10.5, er de potentielt pluripotente. Men ved dag 15,5, de er gonocytes og har undertrykt udtryk for pluripotens gener (

Oct4, Nanog

,

Sox2

), undergået cellecyklusstop, udtrykker kønsceller gener (

Nanos3, Dazl, Dnd1, Mvh

) [22], [23], og er forpligtet til kimcellens selvfornyelse og differentiering vej [12]. Mellem dag E10.5 11.5 de undergår epigenetiske ændringer, der omfatter både den globale DNA demethylering som indebærer enkeltstrengede pauser (SSB’er) og aktivering af base-excision reparationsvej med kromatin lokalisering af de involverede proteiner, samt kromatin remodeling involverer tab og udskiftning af histoner og ændringer i deres modifikationer [24]. Ioniserende stråling selv inducerer større antal SSB’er og producerer beskadigede baser. Denne stråling-induceret skade kan forstyrre signalveje, der omfatter endogene SSB’er og base- excision reparation regulerer denne epigenetiske transformation og lade cellerne bevarer pluripotens som embryonale stamceller-lignende celler, der efterfølgende danner TGCTs.

Tidligere genetiske ændringer i kønsceller, herunder

ter

mutation i

Dnd1

gen [25], tab af

Dmrt1

[14], eller tab af

PTEN

[26] fremstillet en høj forekomst af TGCTs (især teratomer) i mus. Analyse af ændringer i ekspressionen af ​​disse gener eller genprodukter i PGC’er og gonocytes embryoner af bestrålede mus kunne belyse den mekanisme, som stråling virker til at fremkalde tumorer.

Selv om ekstrapolering af teratomer i mus til sporadiske testikeltumorer hos unge menneskelige hanner voksne er stadig diskuteres, de nuværende resultater på

i utero

bestråling af mus tyder på, at den mandlige foster af kvinder udsat for stråling på omkring 5-6 uger af graviditeten kan være en øget risiko for at udvikle testikelkræft. Kohorteundersøgelser sandsynligvis ikke vil være i stand til at teste, om der er en sammenhæng mellem en sådan eksponering og testikel kræft siden X-ray doser i diagnostiske procedurer er faldende [9], at antallet af gravide kvinder i populationer udsat for stråling er små [10] , er der sandsynligvis en begrænset udviklingsmæssige vindue af følsomhed, forekomsten af ​​testis cancer i human er lav, og flere årtier forløbe mellem eksponering og udseende af tumorer. Der er dog én rapport for en sammenhæng mellem moderens ioniserende stråling under graviditet og testikelkræft i deres afkom [11]. Den opnåede viden om mekanismerne for ioniserende stråling-induceret testikelkræft hos mus kan bruges til at identificere andre miljømæssige eller livsstilsfaktorer, der kan forårsage lignende skader på føtale kønsceller og være ansvarlige for de nuværende stigninger i testikelkræft forekomst hos mænd.

Materialer og metoder

mus og avl

En nyligt beskrevet indavlet, kongene musestamme, 129.MOLF-L1 [19], benævnt L1 blev anvendt. Disse blev stammede fra krydsninger mellem 129 (129S1 /SvImJ) stamme og Molf /Ei indavlede mus af

Mus m. molossinus

mus underarter. At skabe L1 mus 129 consomic mus med Molf-CHR19 mus blev tilbagekrydset til 129, vælge en 7,6 Mb region fra Molf kromosom 19, og derefter gjort homozygote for Molf-afledt region ved Krydsning afkommet. Omkring 30% af L1 hanner blev rapporteret til at udvikle spontane testikeltumorer og Molf gener, der bidrager til dette høje tumorincidensen er endnu ikke kendt [19].

Tidsstyrede parringer blev udført med par af L1 mus. Drægtige hunner på dagen 10.5 og 11.5 i deres graviditet blev behandlet med to daglige doser af kemiske og fysiske agens som beskrevet nedenfor. I nogle tilfælde hundyr blev brugt til en anden eller tredje runde af behandlinger under konsekutive graviditeter med en venteperiode på et par uger mellem graviditeter. I sådanne tilfælde af flere behandlinger, gravide kvinder modtog enten den samme agent eller de fik kontrol behandling i hvert graviditeten.

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg med godkendte protokol numre 110712631 og 110712632. Alle faciliteter til boliger dyr registreres af USDA og akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care.

Behandlinger

Flutamid.

Flutamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), opløst i sesamolie /absolut ethanol (01:01), blev givet subkutant som 2 doser på 40 mg /kg. Denne dosis er blevet vist at blokere androgen virkning hos hanmus [27] og er højere end den humane daglige kliniske oral dosis på ~ 10 mg /kg.

Diethylstilbestrol (DES).

DES (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløst i majsolie, blev givet subkutant som to doser på 5 ug /kg. Kontrol- drægtige mus modtog kun vehikel. Baseret på en tidligere rapport [28], vi udførte indledende forsøg med to doser på 20 mg /kg, men reducerede dosis efter mange af de drægtige hunner undladt at levere afkom.

Stråling.

Gravide kvinder L1 mus blev bestrålet med Co

60-gammastråling (Eldorado 8 stråling enhed, Atomic Energy of Canada Ltd., Ottawa, Canada). Højst 3 ikke-bedøvede mus ad gangen blev anbragt i en ventileret methacrylat boks (4,1 cm x 11,7 cm x 8,2 cm) på et underlag af mindst 13 cm af presset træ, i en afstand på 80 cm fra strålingskilden. Med et felt størrelse på 20 x 20 cm, en dosis på 0,8 Gy hele kroppen stråling blev indgivet ved 10-11 AM på dag 10,5 og 11,5 af graviditeten i en dosis på ca. 70 cGy /min. De kontrol L1 dæmninger fra samme ynglekoloni ikke modtog nogen af ​​disse behandlinger eller manipulationer og den mandlige afkom fra disse mus blev analyseret i takt med de af de behandlede dem.

Analyse

i livmoderen

udsatte og styre mandlige afkom i flutamid arm blev aflivet i en alder af 4-5 uger; eksponerede og kontrol mænd i stråling og DES arme blev aflivet i en alder af 4 uger. Denne gang blev valgt, da tumorer i L1 mus visuelt observeres ved disse aldre [19]. Testiklerne blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​tumorer ved visuel observation og derefter fikseret i Bouins opløsning til histologisk undersøgelse. Da nogle små tumorer ikke var tydelige ved visuel undersøgelse alle tumorer blev identificeret ved analyse af hematoxylin og eosin-farvet 5-um snit. Tumorer med væv fra flere dermale typer blev anerkendt som teratomer. Når den indledende testis sektion indeholdt kun kræft neuroepitelceller, blokkene blev re-delt til at identificere eller udelukke tilstedeværelsen af ​​andre ondartede vævstyper andre steder.

Statistisk analyse

data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. Betydningen af ​​forskelle mellem testiklerne vægte fra mus af samme alder blev evalueret af en Students

t

-test. Betydningen af ​​forskellene i frekvensen af ​​TGCTs mellem behandlede og kontrol mus blev bestemt ved anvendelse af Chi-square test.

Tak

Vi takker Walter Pagel (MD Anderson Cancer Center) til redaktionel bistand .