PLoS ONE: Abnormiteter i osteoklastogenese og Nedsat tumorigenese i mus mangelfuld for kræft i æggestokkene G-protein-koblede receptorer 1

Abstrakt

Ovariecancer G-protein-koblede receptorer 1 (OGR1) har vist sig at være en proton sensing receptor

in vitro

. Vi har vist, at OGR1 fungerer som en tumor metastase-gen, når det er over-udtrykt i humane prostata kræftceller

in vivo

. For at undersøge de fysiologiske funktioner OGR1, genereret vi betinget OGR1 mangelfuld mus ved homolog rekombination. OGR1 manglende mus var levedygtige og ved grov-inspektion viste normal. I overensstemmelse med

in vitro

undersøgelser viser, at OGR1 er involveret i osteoklastogenese, reducerede osteoklaster blev påvist i OGR1 manglende mus. En pH-afhængig osteoklaster overlevelse effekt blev også observeret. Imidlertid blev samlet abnormitet i knoglerne i disse dyr ikke observeret. Desuden blev melanoma celle tumorigenese signifikant inhiberet i OGR1 manglende mus. OGR1 mangel mus i den blandede baggrund producerede signifikant mindre peritoneale makrofager, når de stimuleres med thioglycolat. Disse makrofager viste også ændret ekstracellulær

signal

-regulated kinaser (ERK) aktivering og nitrogenoxid (NO) produktion som reaktion på lipopolysaccharid. OGR1-afhængige pH responser vurderes af cAMP-produktion og celleoverlevelse i makrofager eller brune fedtceller blev ikke observeret, formentlig på grund af tilstedeværelsen af ​​andre proton sensing receptorer i disse celler. Vores resultater viser, at OGR1 rolle i osteoklastogenese er ikke stærk nok til at påvirke den samlede knogle udvikling og dens rolle i tumorigenese berettiger yderligere undersøgelser. Musene genererede kan potentielt anvendes til flere sygdomsmodeller, herunder cancere eller osteoklastlignende sygdomme

Henvisning:. Li H, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z et al. (2009) abnormaliteter i osteoklastogenese og Nedsat tumorigenese i mus Mangelfuld for kræft i æggestokkene G-protein-koblede receptorer 1. PLoS ONE 4 (5): e5705. doi: 10,1371 /journal.pone.0005705

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: April 2, 2009; Accepteret: 5 maj 2009; Udgivet: 28. maj 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. RO1 HL68804 , RO1-CA89228 og en Ralph C. Wilson, Sr. og Ralph C. Wilson, Jr. Medical Research Foundation tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vi har tidligere klonet OGR1 fra en æggestokkræft cellelinje HEY [1]. For nylig har vi vist OGR1 er en hidtil ukendt metastase suppressor gen for prostatacancer [2]. OGR1 og dets underfamilie G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er), GPR4, G2A og T-celledød-associeret gen 8 (TDAG8), har vist sig at have proton-sensing evne [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Mange af disse proton sensing aktiviteter er blevet identificeret i celler overudtrykker en eller flere af disse GPCR’er. For nylig er der fundet proton sensing aktiviteter i celler fra GPR4- og TDAG8-, men ikke G2A-mangel mus [8], [10], [11].

Mus mangelfuld i G2A, TDAG8, eller GPR4 er blevet genereret. Disse knockout (KO) mus er levedygtige og udvise forskellige fænotyper. G2A KO mus demonstrerer en normal mønster af T og B-celle afstamning differentiering gennem voksenlivet. Men alderen G2A-mangel dyr ( 1 år) udvikle sekundære lymfoide orgel udvidelsen forbundet med unormal udvidelse af både T og B-lymfocytter [12]. Desuden kan andre fænotyper relateret til knoglemarvafledte celler, herunder, monocytter /endotelceller og makrofager samt hepatiske celler er blevet rapporteret [8], [13], [14], [15], [16], [17]. TDAG8 er transkriptionelt opreguleret af glucocorticoider (GCS) og impliceret ved overekspression studier i psychosine-medieret hæmning af cytokinese [18], [19]. Selvom TDAG8 ekspression ligner den dynamiske regulering beskrevet for kendte modulatorer af GC-induceret apoptose under thymocytudvikling, er undværlig for psychosine-induceret dannelse af flerkernede celler. Desuden thymocytter i TDAG8 KO mus viser normale apoptose efter

in vivo

in vitro

GC behandling [11]. Desuden indeholder sure ekstracellulære pH ikke differentielt modulere modtagelighed TDAG8 vildtype (WT) og KO thymocytter GC-induceret apoptose [11]. Men i thymocytter og splenocytter eksplanteret fra receptor-deficiente mus, TDAG8, men ikke G2A, viser sig at være kritisk for pH-afhængige cAMP-produktion [8]. Mens dette manuskript var under udarbejdelse, Mogi

et al

har vist, at TDAG8, men ikke OGR1 er involveret i pH-inducerede inhibitorisk virkning på tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) produktion i makrofager [20]. GPR4 udtrykkes i de fleste endotelceller og medierer sphingosylphosphorylcholine (SPC) -induceret angiogene aktiviteter (11). GPR4 mangel fører til delvist trængt vaskulære abnormiteter under udvikling og at denne receptor funktioner i blodkar pH sensing i en

ex vivo

aorta ring assay [10].

OGR1 er blevet identificeret som en stærkt opreguleret gen under osteoklastogenese i

CSF1

tl /CSF1

tl

rotter (CSF-deficient rotte) behandlet med makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF eller CSF-1) og i receptor aktivator af nuklear faktor κ B ligand (RANKL, eller TRANCE, TNFSF11) -induceret osteoklastdifferentiering

in vitro

[21]. Den potentielle funktionelle inddragelse af OGR1 i osteoklastogenese er blevet påvist ved anvendelse af et anti-OGR1 antistof og ved at hæmme OGR1 med lille inhiberende RNA (siRNA) [21]. Desuden systemisk acidose har skadelige virkninger på skelettet og lokal acidose er forbundet med knoglenedbrydning i inflammatoriske og neoplastiske sygdomme. Overlevelse og calcium signalering af osteoklaster er signifikant forbedret ved forsuring af mediet i en OGR1-depedent måde [22]. Den funktionelle inddragelse af OGR1 har primært blevet undersøgt under anvendelse af enten OGR1 antistof eller en uspecifik OGR1 antagonist Cu

2+ eller siRNA’er mod OGR1. Da alle disse reagenser alle potentielt kan have off-target effekter, er der behov for en mere specifik system til at vurdere de fysiologiske roller OGR1.

mesenkymstamceller (MSC) og bloddannende stamceller fra knoglemarven er i stand til at differentiere i monocytter, osteoklaster, osteoblaster og adipocyter, blandt andre cellefænotyper. Disse celletyper er vigtige for mange biologiske funktioner. Under normale fysiologiske betingelser, er de differentiationsprocesser tæt kontrolleret. Ubalanceret differentiering og /eller aktivering processer føre til patologiske tilstande og sygdomme.

basis af blod monocytter, er makrofager relativt længe levet phagocytotic celler i pattedyr væv. Makrofager er involveret i en række processer, herunder patogen ødelæggelse, inflammation, væv reparation og remodeling. De har en meget plastisk fænotype og deres funktionelle polarisering bestemmes af cytokiner og faktorer inden lokale mikromiljøer [23]. En af funktionerne af makrofager er at tilvejebringe en forsvarsmekanisme mod tumorceller. Imidlertid er tumorassocierede makrofager (TAM’er), som er den største inflammatoriske komponent af stroma af mange faste tumorer, der er forbundet med tumorudvikling og metastase [23].

brun og hvid fedtvæv (BAT og WAT ) er vigtige aktører i fedme og relaterede med helbredsproblemer, såsom type-2-diabetes og hjerte-kar-sygdomme. BAT-afhængige ikke-shivering termogenese væsentligt påvirker kroppens energibalance. Ud over sin energilagring funktion, fedtvæv også secernerer en række hormoner og cytokiner, og er involveret i kontrollen af ​​kroppens metabolisme og energibalance flere steder [24], [25]. BAT er af særlig betydning hos nyfødte, små pattedyr (såsom mus) i kolde omgivelser, og dyr, der dvale, fordi dens vigtigste fysiologiske funktion er at sprede lagret energi som varme. I humane spædbørn BAT omfatter op til 5% af den samlede kropsvægt, som derefter aftager med alderen til næsten ikke-eksisterende niveauer ved voksenalderen.

Gennem et dyrs liv, knoglevæv er i en konstant tilstand af omsætningen som følge af kombinationen af ​​sekventiel fjernelse af knoglevæv ved osteoklaster og ny knogle aflejring af osteoblaster. Osteoklaster knogleresorberende multinukleære kæmpeceller, som er afledt af hæmatopoietiske mononukleære precursorceller under kontrol af både M-CSF og RANKL [21]. . Disse celler støtte absorbere og fjerne overskydende knogle væv i ombygning af voksende knogler, eller beskadiget knogle i reparation af frakturer

Vi har genereret og karakteriseret OGR1-mangel mus til at løse en række kritiske spørgsmål: 1) fysiologiske funktioner OGR1 i mus; 2) rolle OGR1 i osteoklastogenese; 3) OGR1-afhængig pH reaktionsevne hjælp OGR1-deficiente celler; og 4) funktioner OGR1 i andre knogle biologiske processer, når mus udfordret af udefrakommende stimuli, såsom tumorceller. Vi har fundet, at i konsistens med offentliggjorte data, OGR1 vil sandsynligvis blive involveret i osteoklastogenese. I vores hænder, observerede vi reduceret osteoklaster afledt af knoglemarvsceller fra OGR1 manglende mus. En svag pH-afhængig osteoklaster overlevelse effekt blev også observeret. Imidlertid blev de samlede knoglestrukturer fra musene ikke påvirkes og en signifikant pH-reguleret og OGR1-afhængig biologisk virkning blev ikke generelt dokumenteret i OGR1-udtrykkende celler [herunder makrofager og brune adipøst afledte celler (BADCs)], hvilket tyder på en redundant virkning af andre OGR1 underfamilie- GPCR

in vivo

. Desuden er effekten og inddragelse af værtscelle OGR1 i tumorigenese af melanomceller er af stor interesse og berettiger til yderligere undersøgelse. To yderligere abnormiteter relateret til peritoneale makrofager og BAT blev observeret i en mus baggrund-afhængig måde, hvilket tyder på involvering af modificere gener i forskellige mus baggrunde.

Materialer og metoder

Reagenser

Sphingosylphosphorylcholine (SPC) og lysophosphatidylcholin (LPC) var fra Aventi Polar Lipids (Birmingham, AL) eller Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada). M-CSF og RANKL var fra Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anti-FLAG M2, H

2O

2, thioglycolat (TG), lipopolysacchride (LPS), latexperler, natriumnitrit, Griess reagens, tartrat-resistent syrephosphatase (TRAP) farvningsreagenser og Massons trichromfarvning reagenser var købt hos Sigma (St. Louis, MO). Anti-phospho-ERK, anti-ERK, anti-phospho-p38, anti-p38 var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Gede-anti-iNOS, TRITC-anti-kanin var fra BD (San Jose, CA). Anti-F4 /80, anti-PCNA, kanin anit-arginase og anti-cyclooxygenase-2 (COX-2) var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-CD31 var fra RDI (Fitzgerald, Concord, USA). Citrat buffer, universal hesteserum, VECTOR NovaRED, og ​​hæmatoxylin QS var fra VECTOR (Burlingame, CA).

Generation of OGR1 knockout (KO) mus Salg

OGR1 målretning konstrukt er blevet genereret gennem en kontrakt med AntEQ transgene mus (Australien). Kort fortalt blev en 13,2 kb Bam HI genomisk fragment indeholdende OGR1 gen subklonet fra en bakteriel kunstigt kromosom (BAC) klon (en slags gave fra Dr. Owen Witte laboratorium på UCLA) i en PBS (KS) II vektor (plasmid # 182) . 5’homologi region af OGR1 locus blev PCR-amplificeret under anvendelse OGR1 primerne # 1 og # 2 og plasmid # 182 som skabelon. Primer # 2 oprettet et nyt Nco1-sted ved begyndelsen af ​​OGR1 (skiftes den første fra ATG til CTC). PCR-fragmentet blev subklonet ind pCR2.1.TOPO (Invitrogen), hvilket gav plasmid # 183. Exon 1 i OGR1 blev PCR-amplificeret under anvendelse af primerne # 7 og # 8, mens primer # 7 indførte et Xbal site for yderligere kloningstrin. PCR-fragmentet blev subklonet ind pCR2.1.TOPO hvilket gav plasmid # 188. Denne komplette OGR1 sekvens blev bekræftet ved sekventering analyser. En 6,2 kb genomisk fragment af den 3′-utranslaterede region af OGR1 locus blev subklonet ind i plasmid # 182, hvilket gav plasmid # 189. Et 1,4 kb floxet-neo-kassetten blev derefter klonet ind i plasmid # 189 lineariseret med Stul til opnåelse af plasmid # 208. Stu I skærer ved 5′-enden af ​​3’HindIII OGR1 region. De 3xFLAG område-kodende tre tilstødende FLAG-epitoper blev PCR-amplificeret fra plasmid p3xFLAG CMV-19 under anvendelse af primere # 3 og # 4, og sidstnævnte primer inkluderet et Xho I-sted til yderligere kloning. PCR-produktet 353 bp blev subklonet ind pCR2.1.TOPO (plasmid # 185). En 400 bp Ken og Xhol-fragment fra # 185 blev yderligere subklonet i pBS (KS) II at få plasmid # 196. En 2,6 kb Kpnl-NcoI-fragment (5 ‘homoloy område) fra plasmid # 183 blev derefter subklonet ind i plasmid # 196 foran 3 × FLAG region (plasmid # 199). Den loxP-sted i 5’-området af exon 1 blev klonet under anvendelse af annealede primere # 5 og # 6 og ligeret ind i plasmid # 199 ved Xho I og Xba I-steder. Dette gav anledning til plasmid # 204, som blev sekventeret for at bekræfte integriteten af ​​3xFLAG-LoxP-exon 1 junction. En 1,8 kb Xbal-Sacl fragment indbefattende OGR1 exon 1 og ‘3’ utranslaterede region fra plasmid # 188 blev subklonet ind i plasmid # 203 for at generere plasmid # 209. En 7,7 kb Hind III fragment af plasmid # 208 huser neo-kassetten flankeret af loxP-steder, og 3’OGR1 homologi region blev subklonet ind i plasmid # 209 for at give OGR1 targeting vektor # 218. Funktionaliteten af ​​LoxP sites blev bekræftet i en

E. coli

stamme BNN123 konstitutivt udtrykker rekombinant Cre. Sekvenserne for de anvendte primere var:

# 1: 5 ‘GGT ACC GGA GGA CGT GAG CAA CAA CT

# 2: 5′ ATG TTC CCC ATG GTT GGG CCA GAA

# 3: 5 ‘TCC TAC TTG GCA GTA CAT CT

# 4: 5′ ATC TCG AGC TTG TAC TCG TCA TCC TTG

# 5: 5 ‘TCG AGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT

# 6: 5 ‘CTA GAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATC

# 7: 5′ TCT AGA GGG AAC ATC ACT ACA GAA AAC TC

# 8: 5 ‘AGG AAC TTG GCT AAG GAC

de målretning konstruktioner OGR1 blev injiceret ind i ES-celler på transgene mus Core Facility ved Case Western Research University (Cleveland, OH). Kimære mus med kim line FLAG-mærket OGR1 gener flankeret af to loxP-sites blev dannet. Gennem avl til C57 /BL6-mus, blev disse mus anvendt til at generere heterozygote mus med en kopi af FLAG-mærket OGR1. Efterfølgende avl af heterozygote OGR1

fl /+ mus genereret homozygote OGR1

fl /fl mus. Alle afkom fra avl af heterozygote OGR1

fl /+ mus blev genotype ved DNA-analyse af hale klip. Oprindeligt både Southern blot og PCR analyser blev udført for at bekræfte genotypen. Efterfølgende genotypebestemmelse blev hovedsageligt udført under anvendelse af PCR-analyser. Homozygote mus med OGR1 floxet (OGR1

fl /fl) blev avlet til at kimcelletransformanter Cre mus Zp-3 (en transgen mus linje til inaktivering af loxP-flankeret målgener specifikt i den kvindelige kønsceller [26]; Jackson Labs , Bar Harbor, Maine). Derudover blev de avlet til bevægelseshæmmede (Protamin-Cre, en transgen mus linje til inaktivering af loxP-flankeret målgener specifikt i den mandlige kimlinie mus [27] venligt leveret af Dr. Guangbin Luo, Case Western Reserve University ) for at generere OGR1

+/- Cre mus, som blev opdrættet yderligere at generere OGR1

– /- (KO eller mangelfulde) mus. Den OGR1

fl /fl mus blev betegnet OGR1 FL. OGR1

– /-. Mus i blandede baggrunden er blevet tilbagekrydset til C57 /BL6 i 10 generationer, den OGR1

+ /+ 10

th generation mus blev betegnet OGR1 vildtype (OGR1 WT)

Fænotype analyser

OGR1 KO mus var levedygtige og fertile. En komplet mus fænotype analyse blev gennemført i to par OGR1 KO og FL mus (8 uger gammel, en han og en hun i hver gruppe) på musen fænotyper Shared Resource, Ohio State University, Columbus, OH. Til bestemmelse af fedme-indekset blev en tidligere publiceret metode [28].

Vævsdistributions analyser

Organer blev udtaget fra mus og faste i zink (BD, Franklin Lakes, NJ) i 12 -24 time, derefter holdt i 70% ethanol forud for at blive indlejret i paraffin og derefter sektioneret på 5 um. Indlæg afparaffinering og rehydrering blev objektglassene behandlet med citratbuffer i 20 minutter og med H

2O

2 (0,3%) i ethanol i 15 min. Universal hesteserum anvendtes til at blokere vævet efterfulgt af anti-FLAG-antistof (1:200 fortyndinger) behandling. VECTOR NovaRED blev anvendt som substratet og hæmatoxylin QS som en tæller plet.

RNA-isolering, revers transkription-PCR (RT-PCR)

Væv blev udskåret fra musene og pulveriseres efter lynfrysning i flydende nitrogen. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy mini kit (Qiangen, Maryland) og revers transskriberet af M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Afledte cDNA’er blev amplificeret under anvendelse af PCR Master Mix (Promega, Madison, WI). Primersekvenser for OGR1 var som følger: 5′-CTCAATGACCTCCTTGTGATTG-3 ‘og 5′-CTACCAGAAAACTCCTCACTATC-3’. β-actin blev amplificeret som en husholdning gen med primere 5′-ACCGCTCGTTGCCATTAGTGATGA 3 ‘og 5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC-3’.

brunt fedtvæv isolation og proliferation af brune adipøst afledte celler (BADCs)

brunt fedt blev dissekeret fra det dorsale aspekt af thorax mellem skulderbladene, og formalin (10%) fast derefter paraffinindlejret, efterfulgt af H 1 × 10

6 celler) blev udpladet i lav M-CSF [3% L 929 celle-konditioneret medium (L-CM) som en kilde til M-CSF] i RPMI indeholdende 20% FBS. L-CM blev fremstillet ved at pode 2,5 x 10

5-celler i en 175-cm

2 vævskulturkolbe med 50 ml basisk medium, indtil cellerne var sammenflydende. Supernatanten blev derefter opsamlet, filtreret gennem et 0,2-um filter, og nedfrosset i portioner ved -80 ° C. Efter at have ladet stromaceller at adhærere natten over blev ikke-adhærente celler opsamlet og udpladet i høj M-CSF (30% L-CM). Efter tre dage blev mediet fjernet sammen med ikke-vedhæftede celler og nye medium indeholdende 30% L-CM blev tilsat. Vedhængende makrofager var homogene populationer efter 7 dages dyrkning. Cellerne blev farvet med Diff-Quick og talt. For at differentiere makrofager i osteoklaster, frisk medium med RANKL (50 ng /ml) tilsat på den tredje dag og scorede tre dage senere ved at tælle TRAP-positive celler.

fagocytose og nitrogenoxid (NO) produktions- analyser

peritoneale makrofager (1 x 10

4 celler /300 pi) blev inkuberet i 48-brønds plader og behandlet med latexperler (1 × 10

6) i 3 timer. Assayene blev afsluttet ved vask af cellerne med iskold PBS. Cellerne blev derefter fikseret i methanol i 30 min. Fagocytose blev kvantificeret under et fluorescensmikroskop ved at tælle antallet af internaliserede perler i mindst 200 celler, som blev registreret som phagocytotic indeks ved formlen: 100 x (celleantal med en kanttråd + 3,5 × celleantal med 2-5 kugler + 8 × celle nummer med 6-10 perler + 20 × celle nummer med over 10 perler) /samlede celle numre. For NO-produktion, peritoneale makrofager (5 x 10

5) i 100 pi RPMI indeholdende 10% FBS blev dyrket i 96-brønds plade i 2 timer ved 37 ° C. Cellerne blev behandlet ved at erstatte med medium (0,5% FBS i 100 pi) og LPS (50 pi 1 ug /ml) i 18 timer. Niveauerne af NO i supernatanten blev analyseret ved at blande det samme volumen af ​​supernatanter (100 pi) og Griess reagens i en ny plade med 96-. Pladerne blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur og aflæses ved 570 nm ved anvendelse af en pladelæser. Koncentrationen af ​​nitrit i kultursupernatanten blev beregnet ud fra en standardkurve genereret fra fortynde natriumnitrit i vand ved et koncentrationsinterval på 0,01-100 uM.

prostaglandinproduktion og COX-2-ekspression

95% konfluerende celler i plader med 24 brønde blev behandlet med forskellige pH buffere til 9 timer eller 25 timer [31], [32]. Supernatanterne blev indsamlet til prostaglandin-analyse under anvendelse af HPLC-massespektrometri (API-4000, Applied Biosystems). Kort fortalt blev prostaglandiner ekstraheret fra cellesupernatanter (500 pi i hver prøve) i nærvær af 14:00 lysophosphatidsyre (LPA, 10 pmol) som en intern standard under anvendelse af chloroform (2 ml), methanol (2 ml), og HCI (6 N, 10 pi). Ionerne med m /z på 351 (moderselskabet ion) og 271 (datter ion) blev anvendt til identifikation af prostaglandiner. En TARGA C18 5 uM, 2,1 mm ID x 10 mm TR-0121-C185 (Higgins Analytical, Southborough, MA USA) HPLC-søjle blev anvendt, og den mobile fase var MeOH /vand /NH

4OH (90:10: 0,1, vol /vol /vol), 6 min /prøve. Cellepellets blev opsamlet til analyse COX-2-ekspression.

Western blot-analyser

makrofager (10

6) dyrket i 6-brønds plade blev skyllet med PBS og stimuleret med LPS ( 100 ng /ml), SPC eller LPC (2,5 uM) i 30 minutter. Celler blev lyseret i 100 pi Laemmli prøvebuffer (BIO-RAD, Hercules, CA), blev ekstrakten opløst på en 10% SDS-polyacrylamidgel og overført til polyvinylidendifluoridmembran. Membraner blev blokeret i 5% skummetmælk i 2 timer og derefter inkuberet med angivne primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter inkubering med tilsvarende sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur blev membranerne udviklet under anvendelse af en ECL plus western blotting detection system (GE Healthcare, Buckinghamshire UK). Protein lastning blev bekræftet ved stripning og Fornyet probing blots med antistoffer mod β-actin

.

Cyklisk AMP (cAMP) produktion og celle overlevelse ved forskellige pH

peritoneale makrofager blev udsået i 24 Tja plader, der er behandlet med forskellige pH-puffere indeholdende phosphodiesterase inhibitor isobutylmethylxanthin (IBMX, 1 mM) i 30 min, og derefter lyseret med 0,1 M HCI (60 pi). Cellelysater blev anvendt til cAMP assay ifølge kittets instruktioner (Cyklisk AMP EIA Kit, fra Cayman, Cat # 581.001). For overlevelse assays, makrofager eller knoglemarv-afledte osteoklaster blev udpladet i plader med 96 brønde i 2 timer ved 37 ° C med 5% CO

2 og derefter dyrket i medium ved forskellige pH-værdier ved 37 ° C med 0% CO

2 for 20 timer.

Bone histomorphometrical og immunhistokemiske analyser

Bone prøver fra 8 uger gamle dyr blev fikseret i Bouins løsning natten, afkalket i EDTA (14%) for 12 dage, og indlejret i paraffin. Snit blev derefter farvet med Masson Trichrome Stain Kit til morfologisk observation.

melanom tumorigenese

B16-F10-celler blev dyrket i RPMI med 10% FBS. 1 × 10

7 og 5 × 10

5 celler i 100 pi PBS blev subkutant injiceret i flankerne af den blandede baggrund og de rene C57 /BL6 baggrund mus hhv. Musene blev aflivet, når de optrådte moribunde (9-14 dage efter injektion). Dyret forskning overholdt alle relevante føderale retningslinjer og politikker Laboratory Animal Resource Center på Indiana University School of Medicine.

statistiske analyser

Alle data i denne undersøgelse blev udtrykt som middelværdi ± SD af tre eller flere uafhængige forsøg i tre eksemplarer. Forskelle mellem behandlingsgrupper blev analyseret ved hjælp af Students

t

test og tosidede fordeling i Microsoft Excel.

Resultater

Generering af OGR1 manglende mus og OGR1 udtryk i væv

for at undersøge fysiologiske rolle OGR1, har vi etableret en OGR1 mangelfuld mus stamme. Frembringelse af OGR1 deficiente mus blev beskrevet detaljeret i Materialer og Metoder. Den overordnede strategi for at konstruere vektoren OGR1 målrette blev vist i figur 1A. Resultaterne fra OGR1 genotypebestemmelse blev vist i figur 1B. OGR1 blev udtrykt i lungevævet, testikel, hjerte, hjerne, milt, thymus, brunt fedt, tyndtarm, colon, perifere blodleukocytter (PBL), makrofager, mave, ovarie, og hvid fedt, men ikke i lever, nyre, og skeletmuskel af OGR1 FL mus som påvist ved RT-PCR. OGR1 ekspression i prostata var svag, men påviselig (figur 2A). Den fuldstændige mangel på OGR1 ekspression i OGR1 KO-mus blev bekræftet i alle undersøgte væv. Vi indsatte en tre-FLAG-mærke foran OGR1 i knock-in-konstruktionen så kan detekteres det endogene OGR1 ekspression på proteinniveauet i væv under anvendelse af anti-FLAG-M2-antistoffet. Immunhistokemisk farvning af lungen af ​​OGR1 FL mus viste, at OGR1 blev udtrykt i terningformet /columar epitelceller dækker de store luftveje i lungerne og i de vaskulære glatte muskelceller omgiver et stort blodkar (figur 2B). Denne vævsekspressionsmønstret af OGR1 var den samme som observeret i humane væv som demonstreret tidligere [1], [33].

(A) Strategi for konstruktion af vektoren OGR1 målretning. (B) Genotypebestemmelse blev udført for at identificere floxet (FL), – /- (KO) og + /+ (WT) mus

(A) OGR1 ekspression i forskellige væv fra FL og KO-mus. detekteret ved RT-PCR. PCR-programmet var 94 ° C, 2 min; 25 cykler til actin og 35 cykler for OGR1 (94 ° C, 30 s; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min); 72 ° C, 10 min, undtagen både actin og OGR1 i makrofager blev amplificeret ved 30 cykler. BAT, brunt fedtvæv; BM, knoglemarv; PBL, blodleukocytter perifere. Pilene angiver DNA stiger med 500 bp. (B) OGR1 distribution i lungevæv fra FL og C57 /BL6-mus. Anti-FLAG-M2-antistoffet (1:200) anvendt. Repræsentative positivt farvede celler er vist med pile. Scale bar = 100 um.

Generelle fysiologiske analyser af OGR1 KO mus og brunt fedtvæv (BAT) abnormitet i den blandede baggrund

OGR1 KO mus var levedygtige og fertile. En komplet mus fænotype analyse blev gennemført i to par OGR1 KO og OGR1 FL mus (8 uger gamle, en han og en kvindelig i hver gruppe). Legemsvægte afveg ikke væsentligt blandt de undersøgte mus. I disse to par mus, milt fra OGR1 KO-mus viste sig at være noget mindre end for de FL mus, hvorimod lever og hjerter af KO-mus var noget større end for de FL mus. Men yderligere analyse i flere mus ikke påvise statistiske forskelle i disse organvægt (data ikke vist). Histologiske analyser i FL og KO afslørede ikke signifikante forskelle i de fleste væv, og repræsentative data er vist i figur 3.

Repræsentanten H E-farvning af lever, nyre, testikel, prostata, ovarie og uterus blev præsenteret. Scale bar = 100 um.

Den indledende analyser viste også, at intrascapular BAT deponering var tungere i KO (0,35 og 0,28 g) end FL (0,10 og 0,11 g) mus, som kan være relateret til ændret adipositas i KO-mus. Konsistente forskelle i BAT vægt og størrelser blev observeret i yderligere par af FL og KO-mus (figur 4A). H 0,05 og *** repræsenterer et

P

værdi 0,001. Scale bar = 100 um.

OGR1 har vist sig at have proton-sensing aktivitet i forskellige celler [3], [6], [9], [34]. Derudover kan SPC modulere OGR1 handlinger [6], [9]. SPC er blevet vist at inducere proliferation af humane fedtvæv-afledte mesenchymal-stamceller via aktivering af c-Jun N-terminal kinase (JNK) [35]. For at teste, om BAT fra FL og KO mus reagerer forskelligt til pH og /eller SPC, vi isoleret BADCs og testet effekten af ​​SPC eller pH-ændringer på celleproliferation. SPC (2,5 uM) beskedent stimuleret celleproliferation ved 24 timer, og denne virkning var ikke signifikant forskellig i BADCs fra FL versus KO-mus (figur 5A). Sur pH inducerede lavere proliferation end den fysiologiske pH (7,4), og igen ingen statistisk forskel blev observeret i BADCs fra FL

vs.

KO-mus (figur 5B). Vi har tilbagekrydses OGR1 deficiente mus i C57 /BL6 baggrund (10 generationer). Da vi undersøgte BAT i WT og KO mus i C57 /BL6 baggrund blev ingen forskel observeret (data ikke vist), hvilket antyder, at BAT abnormitet er relateret til musen baggrund.

(A) SPC stimuleret proliferation var ikke signifikant forskellig i BAT fra FL

vs.

KO mus. SPC (2,5 uM) eller LPC (2,5 uM) blev anvendt. (B) Virkningen af ​​pH på spredning var ikke signifikant forskellig i FL

vs.

KO. Resultaterne i denne figur er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg. * Repræsenterer et

P

værdi. 0,05

OGR1 mangel reduceret makrofag produktion i mus af den blandede baggrund

Mikroskopisk undersøgelse af væv afslørede ikke