PLoS ONE: Bidrag fra Multiparameter flowcytometri Immunfænotypebestemmelse til diagnostisk screening og klassifikation af Pediatric Cancer

Abstrakt

Pediatric kræft er en relativt sjælden og heterogen gruppe af hæmatologiske og ikke-hæmatologiske maligniteter, som kræver flere procedurer for dens diagnostisk screening og klassificering. Indtil nu, flowcytometri (FC) er ikke blevet systematisk anvendt på det diagnostiske oparbejdning af sådanne maligniteter, især for faste tumorer. Her evalueres vi en FC panel af markører for diagnostisk screening af pædiatrisk cancer og yderligere klassificering af pædiatriske solide tumorer. Den foreslåede strategi sigter mod differentialdiagnose mellem tumoral

vs

. reaktive prøver og hæmatologiske

vs

. ikke-hæmatologiske maligniteter, og underklassificering af faste tumorer. I alt blev 52 prøver fra 40 patienter mistænkelige af indeholder tumorceller analyseret af FC parallelt med konventionelle diagnostiske procedurer. Den samlede konkordans rate mellem begge tilgange var på 96% (50/52 diagnostiske prøver), med 100% overensstemmelse for alle reaktive /inflammatoriske og ikke-infiltrerede prøver og for dem, der svarer til faste tumorer (n = 35), med kun to falske negative sager diagnosticeret med Hodgkins lymfom og anaplastisk lymfom, hhv. Desuden klar forskelsbehandling mellem prøver infiltreret af hæmatopoietisk

vs.

, Ikke-hæmatopoietiske tumorceller systematisk opnået. Tydelige undertyper af solide tumorer viste forskellige protein udtryk profiler, der giver mulighed for den differentielle diagnose af neuroblastom (CD56

hi /GD2

+ /CD81

hi), primitive neuroektodermale tumorer (CD271

hi /CD99

+), Wilms tumorer ( 1 celle populationen), rhabdomyosarcom (

nuMYOD1

+ /

numyogenin

+), karcinomer (CD45

– /EpCAM

+) , kimcelletumorer (CD56

+ /CD45

– /NG2

+ /CD10

+) og til sidst også hemangiopericytomas (CD45

– /CD34

+). Sammenfattende vores resultater viser, at multiparameter FC giver hurtige og nyttige supplerende data til rutine histopatologi for diagnostisk screening og klassificering af pædiatriske kræft

Henvisning:. Ferreira-Facio CS, Milito C, Botafogo V, Fontana M, Thiago LS, Oliveira E, et al. (2013) bidrag Multiparameter flowcytometri Immunfænotypebestemmelse til diagnostisk screening og klassifikation af Pediatric Cancer. PLoS ONE 8 (3): e55534. doi: 10,1371 /journal.pone.0055534

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: September 20, 2012; Accepteret: December 27, 2012; Udgivet: 5 mar 2013

Copyright: © 2013 Ferreira-Facio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er blevet delvist støttet af følgende tilskud: EO blev delvist støttet af bevilling fra CNPq- Brazilian National Research Council (Brasília, Brasilien). MF blev delvist støttet af en bevilling fra FAPERJ- Research støtte grundlaget for Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasilien) og nu er hun er delvist støttet af en bevilling fra CAPES /Ministério da Educação (Brasília, Brasilien). VB blev delvist støttet af FAPERJ- Research støtte grundlaget for Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasilien). ESC blev delvist støttet af bevilling fra CNPq- Brazilian National Research Council (Brasília, Brasilien) og FAPERJ- Research støtte grundlaget for Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasilien). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mere end 200.000 pædiatriske patienter ( 15.. år) er diagnosticeret med kræft hvert år [1]. Trods kræft er den hyppigste årsag til sygdom dødsfald hos børn i de fleste lande [2], individuelle resultater i høj grad er afhængige af hurtig tumor diagnose, klassificering og iscenesættelse, for passende terapi udvælgelse og maksimeret helbrede satser [3]. Da en betydelig del af pædiatriske tumorer mangler morfologisk tegn på differentiering og histologisk oprindelse, et batteri af immuncytokemiske markører og in situ-hybridisering, ultrastrukturelle og molekylære diagnostiske procedurer, der typisk kræves til diagnostisk klassifikation af sygdommen [3] – [7].

i flere årtier, multiparameter flowcytometri (MFC) immunofænotypebestemmelse har vist sig at være afgørende for hurtig diagnose, klassificering og monitorering af behandlingen af ​​de fleste blodkræftsygdomme, herunder pædiatriske leukæmier og lymfomer. Omvendt er det fortsat et forskningsværktøj til pædiatriske faste tumorer [8] – [15]. En sådan begrænset brug af MFC i diagnosticering af pædiatriske solide tumorer sandsynligvis vedrører behovet for enlige celle suspensioner og tilgængeligheden af ​​relativt begrænsede paneler af pålidelige og validerede markører, blandt andre faktorer [16] – [18]. Således brug af flowcytometri hos pædiatriske faste tumorer er blevet næsten begrænset til evalueringen af ​​tumor celle DNA indhold i begge paraffinindlejrede og frosne vævsprøver, i kombination eller ikke med samtidig farvning for en eller nogle få fænotypiske markører [19] – [24]. Derfor mens immunfænotypiske undersøgelser rutinemæssigt anvendes i de fleste pædiatriske lymfomer for differentialdiagnose mellem B- og T-celle prækursorer lymfoblastiske lymfomer og Burkitts lymfom 25-28, få undersøgelser er blevet rapporteret hidtil, hvor MFC systematisk anvendt på studiet af de fænotypiske karakteristika af pædiatriske faste tumorer [29] – [31]. Derudover få rapporterede studier har hovedsageligt fokuseret på beskrivende analyser af farvningsmønstrene for en eller nogle få markører, som regel i en enkelt diagnostisk undertype af sygdommen.

Trods alle de ovennævnte, foreløbige undersøgelser har vist, at neuroendokrine tumorer vise et CD45

– /CD56

+ fænotype [32] – [35]; til gengæld tumorceller fra neuroblastom co-udtrykke GD2 [35], og primitive neuroektodermale tumorer (PNET) co-udtrykke CD57 og CD99, samt CD56 [31], [34], [36] – [38], og rhabdomyosarcom tumorceller er myogenin

+ [31], [39] – [41]. På trods af dette, specificiteten af ​​disse fænotyper blandt de forskellige undertyper af pædiatriske solide tumorer stadig at blive etableret, og ingen undersøgelse er blevet rapporteret indtil videre, hvor en omfattende panel af markører rettet mod diagnostisk screening, differential diagnose og klassifikation af forskellige typer af pædiatriske tumorer, er blevet foreslået og evalueret.

Her har vi evalueret en ny omfattende MFC panel af markører for diagnostisk screening af pædiatrisk cancer og korrekt tildeling af pædiatriske solide tumorer til specifikke sygdom enheder.

Materialer og metoder

patienter og prøver

i alt 52 prøver fra 40 patienter mistænkelige af pædiatrisk cancer -21 mænd (52,5%) og 19 kvinder (47,5%) – blev indsamlet i perioden fra november 2009 og december 2011 ved tre forskellige centre: Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira /Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPPMG /UFRJ) og Hospital serverlist do Estado (HSE), begge fra Rio de Janeiro (Brasilien), og Hospital de Clínicas /Universidade Federal do Paraná (HC /UFPR) i Curitiba (Brasilien). Median patientens alder var 5 år (spændvidde: 1-14 år). De fleste prøver (48/52; 92,3%) blev analyseret ved diagnose

I alle tilfælde endelige diagnose og klassifikation blev etableret på grundlag af morfologiske og immunhistokemiske analyser udføres på et referencelaboratorium, efter World Health Organization (WHO. ) kriterier [42] – [44] Enogtredive patienter (78%) havde kræft, 17 hvoraf (55%) viste metastatisk sygdom; de resterende 9 børn (23%) havde inflammatoriske /reaktive sygdomme. Ifølge histopatologisk /immunhistokemisk diagnose, 11 patienter (12 prøver) havde neuroblastom, 3 (4 prøver) havde rabdomyosarkom, 2 (2 prøver) en primitiv neuroektodermal tumor (PNET), 8 (9 prøver) havde lymfom, 2 (2 prøver) Wilms tumorer, 2 (3 prøver) kimcelletumorer, og en patient havde en adrenal carcinoma, en en nasopharyngeal carcinom og én en hemangioperycitoma; de andre 17 enheder svarede til 9 reaktive prøver og 8 prøver fra patienter med neoplastiske sygdomme, som viste ingen tumor infiltration. Den særlige oprindelse af prøverne er detaljeret beskrevet i tabel S1.

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af IPPMG og HSE hospitaler og prøver blev opnået efter informeret samtykke blev givet af børnene og deres forældre eller værger, ifølge Helsingfors-erklæringen protokollen. Forældre /værger, forudsat at deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og dette skriftligt informeret samtykke blev godkendt af de lokale etiske råd.

Forberedelse af vævsprøver og kropsvæsker

Vævsprøver fri fra fedt og nekrotisk væv (gennemsnitlig vægt: 144 mg; område: 3 til 3600 mg) blev indsamlet på den kirurgiske enhed. De var direkte evalueret af en erfaren patolog, og opdelt i to sammenhængende blokke. En blok blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin og behandlet til rutinemæssig histopatologi, mens den anden blev anbragt i kold (4 ° C) phosphatbufret saltvand (PBS; pH = 7,4) for yderligere flowcytometrisk analyse. Den senere prøve blev vejet, anbragt i en petriskål med PBS indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA; Calbiochem, La Jolla, CA), hakket i små stykker (2-4 mm) med en skalpel og mekanisk disaggregerede med to sterile nåle; Bagefter blev den filtreret gennem et sterilt Filcon sprøjte (100 um porestørrelse) for at udelukke celleklumper og debris, centrifugeret (10 min ved 540 g) og resuspenderet i PBS indeholdende 1% BSA i en slutkoncentration på 10

6 celler /mL. Bagefter blev prøven straks farves for MFC immunofænotypebestemmelse. Knoglemarv (BM) og andre prøver kropsvæsker blev farvet enten direkte eller efter et centrifugeringstrin (f.eks urin), som beskrevet nedenfor.

Multiparameter Flowcytometri immunfænotypisk Studies

Hver prøve blev farvet med følgende kombinationer af fluorochrom-konjugerede monoklonale antistoffer (mAb’er) – fluoresceinisothiocyanat (FITC) /phycoerythrin (PE) /PE-cyanin7 (PECy7) /peridinin klorofyl-protein-Cy5.5 (PerCP-Cy5.5) /allophycocyanin (APC) /APC-Hilite7 (APC-H7) /Pacific blue (PacB) /pacific orange (paco) – helliget samtidig identifikation af tumorceller og normale /reaktive B- og T-lymfocytter, monocytter og neutrofiler: i) cytoplasmatisk (Cy) MPO /

CyCD79a /CD19 /CD34 /CD7 /overflade membran (Sm) CD3 /

CyCD3 /CD45 [45]; ii) CD8-overflade membran immunglobulin (

SmIg) λ /CD56-sIgκ /- /CD19 + CD4 /CD3 /- /CD20 /CD45 (orientering panel i tabel S2). Når mistænkelige tumorceller blev påvist efter gating strategi er illustreret i figur 1, blev yderligere fænotypisk karakterisering af sådanne mistænkelige tumorceller udført med distinkte karakterisering paneler afhængigt af naturen af ​​cellerne: ikke-hæmatopoietisk vs B vs T vs andre hæmatopoietiske celler (tabel S2). Farvning af celler fra faste væv eller BM, perifert blod (PB) og andre kropsvæsker blev udført som tidligere beskrevet detaljeret [46], [47]. Kort beskrevet blev prøverne (50 pi pr rør) inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke, i nærvær af 3-20 pi af hver af de ovennævnte monoklonale antistoffer (Mab), i overensstemmelse med anbefalingerne fra fabrikanten. Bagefter 2 ml FACS lyseringsopløsning (Becton Dickinson) fortyndet 1:10 (v /v) i destilleret vand blev tilsat, og prøverne blev inkuberet i andre 10 minutter under de samme betingelser som de ovenfor nævnte, for at lysere non -nucleated røde blodlegemer. Derefter blev celler centrifugeret (5 minutter ved 540 g), og cellepellet blev vasket to gange med 4 ml PBS. Endelig blev celler resuspenderet i 0,5 ml PBS. Til vurdering af cytoplasmatiske (Cy) eller nukleare (NU) antigener blev celler fikseret, umiddelbart efter de blev inkuberet med MAb rettet mod celleoverflade membranmarkører (se ovenfor); derefter blev de permeabiliseret og farvet med MAb rettet mod de cytoplasmatiske og /eller nukleare antigener, ved hjælp af Fix Perm reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), nøje at følge fabrikantens anbefalinger. For ukonjugeret MAb, efter inkubation med de specifikke MAb’er, et vasketrin efterfulgt af et andet inkubationstrin med et FITC-konjugeret anti-muse-IgG-reagens (Cytognos SL, Salamanca, Spanien), blev udført (15 min) i mørke. For at bekræfte specificiteten af ​​de Skiltemalerer blev en negativ kontrol med en umærket prøve systematisk parallelt. Farvede celler blev erhvervet ved lav hastighed i en FACSCanto II flowcytometer -Becton /Dickinson Biosciences (BD), San José, CA, USA, – ved hjælp af FACSDiVa software (BD). Alle undtagen to prøver blev behandlet inden for de første 4 timer efter operationen. Til analyse af data blev INFINICYT ™ program (Cytognos SL), der anvendes. Antigen udtryk blev brugt til at identificere de forskellige typer af celler til stede i prøven, og hver celle population identificerede blev klassificeret som værende negative (-), dim positive (+ lo), mellemliggende positive (+) og stærkt positiv (+ hi) ved hjælp af vilkårlig relativ lineær betyder fluorescensintensitet (MFI) værdier på 10

0-10

2, 10

2-10

3, 10

3-10

4, 10

4, henholdsvis, afhængigt af de MFI-værdier observeret vs baseline autofluorescens niveauer, der findes i kontrolgruppen rør; antigenekspression for en given markør blev beskrevet som værende heterogen, når variable ekspressionsniveauer blev påvist for denne markør i en celle population.

I felt A, et illustrerer eksempel på gating strategi og bivariate dot plot kombinationer anvendes til identifikationen af ​​CD45- tumorceller, CD45- resterende stromaceller (f.eks endotelceller og mesenquimal celler) og infiltrerende hæmatopoietiske celler (f.eks neutrofiler, B- og T-celler) er vist. Til gengæld, i paneler B til J den immunfænotypisk profil CD45- tumorceller fra en neuroblastom (paneler B og H), en PNET (paneler C og I) og en rhabdomyossarcoma (paneler D og J) tumor er vist sammen med repræsentative billeder de histophathological og immunohistokemiske profiler af de samme tumorer farvet med hematoxilin eosin plus cromogranin (neuroblastomceller i panel E), CD99 (PNET celler i panel F) og

(nu) myogenin (rhabdomyossarcoma celler i panel G).

udelukkelse af ikke-levedygtige tumor celler var baseret på deres nedre fremad (FSC) og sidelæns (SSC) light scatter funktioner; median cellelevedygtighed af vævsprøver var på 75%. I 19/33 (57,5%) af vævsprøver faste, parallelle farvning med propidiumiodid (PI, Sigma, St. Louis, MO, USA) blev udført for at vurdere cellernes levedygtighed, 90% af PI-farvede døde celler systematisk tilsvarende til begivenheder, som blev udelukket som ikke-levedygtige celler i FSC /SSC gate

histologiske og Immunohistokemiske Analyser

Histophatological undersøgelse blev udført på hematoxilin /eosin (H prøver med tilstedeværelsen af ​​en tumor cellepopulation som påvist ved både konventionelle diagnostiske teknikker og flowcytometri), sand-negativ (TN; prøver uden tumorcellepopulation som målt ved konventionelle metoder og flowcytometri) , falske positive (FP, prøver med tilstedeværelsen af ​​en tumor celle population ved flowcytometri ikke opdaget af de referencemetoder) og falsk negative sager (FN, prøver med målbart tumorceller ved flowcytometri, men positive med reference- tilgange), var beregnet. Følsomhed og specificitet blev defineret som TP /TP + FN og TN /TN + FP, hvorimod den positive (PPV) og negative prædiktive værdier (NPV) blev beregnet som TP /TP + FP og TN /TN + FN hhv.

Resultater

Differentialdiagnosen mellem reaktiv /ikke-infiltreret og Tumor /infiltreret prøver

på baggrund af screeningen panel (panel 1 i tabel S2), 9/52 prøver (17 %) svarede til reaktive prøver; anden 8 (15%) prøver fra kræftpatienter sygdom mellemstationer eller overvågningsformål for, var også negative for malignitet. Alle andre prøver (n = 35; 68%) viste infiltration af tumorceller. Den samlede konkordans rate mellem MFC og konventionel histopatologisk, immunhistokemisk og /eller cytologiske diagnostiske procedurer var på 96% (50/52 prøver). I detaljer blev en aftale 100% opnået for de 17 reaktive /inflammatoriske og ikke-infiltrerede prøver, mens en 94% konkordans rate (33/35 prøver) blev opnået ved MFC for infiltrerede tumor prøver. De to tumorprøver som blev fejlklassificeres af MFC svarede til prøver infiltreret af Hodgkins lymfom celler og et anaplastisk lymfom, hhv. Alle prøver infiltreret af faste tumorer og B- eller T-celle lymfomer blev identificeret korrekt (tabel 1). Derfor blev en samlet effektivitet på 96% (100% specificitet og 94% følsomhed) nået (PPV 100% og NPV på 90%). Den cellulære sammensætning af både reaktive /inflammatoriske og andre ikke-infiltreret prøver er vist i tabel S3, medens fordelingen af ​​stromaceller (inflammatoriske, endotel- og fibroblaster /mesenkymale celler) i 14/26 prøver, der indeholdt ikke-hæmatopoietiske faste tumorer er vist i tabel S4.

Identifikation af lymfom

Versus

Ikke-hæmatopoietisk tumorceller

i alt 35 prøver (fra 31 patienter) indeholdt tumorceller baseret på screening panel (panel 1 i tabel S2) og karakterisering paneler (paneler 2 til 5 i tabel S2). Fra dem, 9 svarede til maligne hæmatopoietiske celler og 26 til ikke-hæmatopoietiske solide tumorer. I de to falske negative lymfom tilfælde blev en rig polyklonalt lymfocyt infiltrat observeret af MFC, uden et klart defineret tumor celle population. Til gengæld kunne alle B-celle lymfom tilfælde (5/5) let skelnes fra pædiatriske solide tumorer med screening panel 1 (tabel S2) ved ekspression af B-celle-markører (CD19

+, cyCD79a

+ , CD22

+) i forbindelse med CD45

+ lo eller CD45

+, mens disse markører var systematisk fraværende i alle 26 pædiatriske solide tumorer. Med B-celle karakterisering panel (panel 3 i tabel S2) viste tre B-celle lymfom prøver overflademembranen

(Sm) Ig let kæde begrænsning (2 tilfælde

SmIgλ

+ og en

SmIgκ

+) sammen med en Tdt

+, CD20

+ hi, CD38

+ hi, CD10

+ hi, cyBcl2

– immunofænotype som er meget karakteristisk for barndom Burkitts lymfom, undtagen for TdT ekspression. De andre to B-celle tumorer præsenteret med en CD45

+ lo, CD19

+, CD20

-, CD22

+, CD10

-, CD38

+, CD58

+, CD81

+, CD9

+

SmIg

–

CyIgμ

– fænotype kompatibel med B-celle forløber akut lymfoblastær lymfom (BCP-ALL) af både MFC og histopatologi. Til gengæld kunne 2 T-celle lymfom prøver let at skelne fra både pædiatriske solide tumorer og B-celle lymfomer med screening panel (panel 1 i tabel S2) baseret på deres CD45

+ lo,

SmCD3

+ lo og

CyCD3

+ fænotype; Desuden har disse celler viste også en CD4

+, CD8

-, CD1a

+, CD99

+, CD2

+, CD5

+, CD27

+, CD71

+ og CD81

+ fænotypisk profil, mangler CD7

-, CD117

– og B-celle-markører, når de passende screening og karakterisering paneler (paneler 1 og 4 i tabel S2 henholdsvis) var anvendes. Alle 26 ikke-hæmatopoietiske solide tumorer analyserede var negative for alle B og T-celle antigener undersøgte med screening panel (panel 1 i tabel S2), og de var CD45

-. Tyve-to af disse senere sager (84%) udtrykte CD56

+, sammen med variable mønstre af ekspressionen af ​​andre markører forbundet med forskellige ikke-hæmatopoietiske væv, som indgik i karakterisering panel til solide tumorer (panel 2 Tabel S2) som beskrevet nedenfor

immunfænotypisk karakterisering af ikke-hæmatopoietiske tumorceller

Næsten halvdelen af ​​de ikke-hæmatopoietiske tumorer svarede til neuroblastom. (12/26, 46%). De viste en ensartet population af CD45

-, CD56

+, CD9

+, CD81

hej, GD2

+ tumorceller med heterogen udtryk for CD57

– /+ og CD58

+ /++; CD90 var positiv i alle undtagen én tumor, hvorimod CD271 delvist blev udtrykt i kun én tumor (tabel 2). Interessant nok kun ganglioneuroblastom tumor analyseret viste to klart forskellige populationer af tumorceller: 39% havde en immunofænotype identisk med de andre neuroblastomer, medens de resterende celler (61%) viste højere lysspredning (FSC og SSC) og større ekspression af CD56, CD81 og CD57. Ingen af ​​de andre testede markører (fx CD99, CD38, CD19, CD20,

CyCD79a, CD34,

numyogenin,

nuMYOD1) blev udtrykt af neuroblastomceller. Fra alle tumorer, neuroblastom var den eneste GD2

+ hi neoplasi, på samme tid, det også viste højere CD56-niveauer per celle (tabel 2; figur 1 og 2). Selvom PNET tumorer viste en fænotype, der lignede neuroblastom (CD45

-, CD56

hej, CD90

+, CD9

+, CD81

+

nuMYOD1

– ,

numyogenin

– i fravær af B-, T- og myeloide-associerede markører), de var negative for GD2, undtagen for én med lav ekspression på en lille tumor population 48%, og viste stærkere ekspression af CD99

hi og CD271

hi (tabel 2; figur 1 og 2)

Panel A:. Heat map opsummerer intensiteten og mønsteret for ekspressionen af ​​forskellige markører i distinkte diagnostiske undertyper af pædiatriske solide tumorer baseret på gennemsnitlige fluorescensintensitet pr /celleniveau. Panel B: Sammenligning af den gennemsnitlige fluorescensintensitet ekspression af individuelle markører pr /celle i forskellige WHO undertyper af pædiatriske faste tumorer. Kasser strækker sig fra den 25. til 75. fraktiler, linjerne i midten repræsenterer medianværdier mens vandrette linjer svarer til 95% konfidensintervaller. |

Baseret på de samme screening og karakterisering paneler (paneler 1 og 2 i tabel S2 henholdsvis), alle fire rhabdomyosarcomer (RMS) viste en specifik

nuMYOD1

hej,

numyogenin

hi fænotype. Desuden RMS tilfælde var også CD45

-, CD56

+ lo, CD90

+ og CD57

-; to udtrykte CD81

+, CD9

+ og CD58

+ og et var delvist positive for CD99 (40% af tumorcellerne), et fænotypisk mønster, som var specifik for denne tumor subtype (tabel 2; fig 1 og 2)

De resterende 8 tumorprøver svarede til 5 forskellige tumor undertyper (Wilms tumor, 2 tilfælde. kønsceller tumor, 3, binyre carcinom, nasopharyngeal carcinom og hæmangiopericytom, en case hver). Stærk EpCAM udtryk var begrænset til de to kræftsvulster, mens hæmangiopericytom celler var de eneste vise CD34

+ hi udtryk; begge grupper af tumorer manglede systematisk CD45, B- og T-celle-markører (tabel 2; figur 1 og 2). Til gengæld alle kimcelletumorer præsenteret med en tydelig CD45

-, CD56

+, CD10

+, CD38

-, CD19

-, CD22

-, NG2

+ fænotype, undtagen for CD10 og NG2 der var negative i 1/3 tilfælde (tabel 2 og figur 2). Omvendt viste de to Wilms tumorer to klart adskilte (sameksisterende) tumor cellepopulationer med en fælles CD56

+ og CD58

+, CD45

-, CD99

-, GD2

–

nuMYOD1

-,

numyogenin

-, CD10

– og NG2

– fænotype, men distinkt reaktivitet (negativ versus positiv udtryk) for CD90, EpCAM og CD57 (tabel 2; Tal 1 og 2).

Samlet viser disse resultater, at distinkte pædiatriske tumor undertyper var forbundet med unikke og specifikke fænotyper.

NuMYOD1 og

numyogenin udtryk var begrænset til RMS (figur 1J, Figur 2), CD99 blev udtrykt på signifikante højere niveauer i PNET og en subpopulation af (embryonale) RMS (Figur 1I, figur 2), mens stærk reaktivitet for GD2 var specifik for neuroblastom (Figur 1H; figur 2), og en CD34

hi CD45

– fænotype var begrænset til hæmangiopericytom sag undersøgt (figur 2). Andre mindre specifikke markører såsom CD56, CD9, CD57, CD81, CD99 bidrog også til nogle differentialdiagnoser, f.eks sondringen mellem neuroblastom og RMS (CD56, CD57, CD81) og mellem PNET og begge RMS (CD9) og neuroblastom (CD99, CD56, CD81 og CD57) (Figur 1I-J; figur 2)

Diskussion.

Pediatric kræft stammer primært fra tidlige lymfoide prækursorer og embryonale mesenkymale og neuroektodermale forstadier, som kan vise lignende morfologiske og histopatologiske mønstre [3], [5] – [7]. Derfor diagnose af de fleste pædiatriske tumorer kræver ofte yderligere karakterisering af de neoplastiske celler på f.eks immunophenotypical /immuncytokemiske grunde. Til gengæld hurtig diagnose af disse tilfælde er afgørende, da det direkte påvirker beslutningsprocessen behandling og patient resultat [2], [3]. Derfor tilgængeligheden af ​​hurtige teknikker til præcist screene for tumorcellen afstamning og udarbejder et tilsvarende differentierede diagnoser, er for det meste velkommen.

Indtil nu, er der rapporteret få undersøgelser, der evaluerer anvendeligheden af ​​MFC immunofænotypebestemmelse for diagnostisk screening og underklassificering af pædiatriske solide tumorer [11] – [13], [27] – [28], [31], [35] – [39], [41], [48] – [51] bemærkelsesværdige, en relativt lav (59%) konkordans på mellem immunofænotypebestemmelse af fine-nål aspirerede prøver ved flow-cytometri og konventionelle cytologiske analyser er blevet rapporteret, på grund af lav prøve cellularitet [36]. Interessant her opnåede vi nok levedygtige celler i hver analyseret ved anvendelse af mekaniske fremgangsmåder frisk opnåede og behandlede prøver disaggregeringsaktiviteter, støtter opfattelsen af, at mekaniske opdeling holder antigenekspression sammen med en acceptabel cellelevedygtighed prøven [16] – [18], [52 ].

af note, ingen af ​​prøverne er klassificeret som reaktiv /inflammatoriske af cytologiske /histopatologiske kriterier blev fejldiagnosticeret som kræft ved MFC. Til gengæld alle tumorprøver men to temmelig usædvanligt lymfom prøver, blev identificeret som indeholdende tumoren ved MFC. De to falske negative tilfælde observerede kan skyldes manglen på specifikke markører for Reed-Stenberg og anaplastiske lymfom celler (f.eks CD30) i vores screening panel (panel 1 i tabel S2) og den relativt lave frekvens og /eller levedygtighed af disse celler i enkelte cellesuspensioner. Fremadrettet medtagelse af yderligere markører (f.eks CD30) i panelet screening til identifikation af disse celler kan potentielt overvinde denne begrænsning [53], [54].

I pædiatriske patienter, MFC er primært anvendt til undersøgelsen af PB og BM prøver fra patienter mistænkelige for at lide af akut leukæmi. På trods af dette, allerede viste tidlige studier i neuroblastompatienter BM infiltration af CD45

– /CD56

+ tumorceller, i mangel af proteiner betegner hæmatopoietisk engagement [29], [33]. På grund af den relativt høje frekvens af metastatisk BM involvering i neuroblastom, dette er langt den ikke-hæmatopoietisk pædiatrisk tumor meste studeret af MFC. Faktisk har fænotypen af ​​neuroblastomceller været tilbagevendende evalueret i enkelt eller flerfarvet (3- eller 4-farve) antistof-kombinationer både i BM og tumor vævsprøver [35], [48] – [51], [55]. Men de fleste af disse undersøgelser havde til formål at vurdere minimal tilbageværende sygdom niveauer i BM af neuroblastompatienter, uden at udforske anvendeligheden af ​​immunofænotypebestemmelse for diagnostisk screening og differentialdiagnose af neuroblastom

vs.

Andre pædiatriske tumorer, som udført her

Fra alle markører evalueret hidtil i pædiatriske solide tumorer, CD56 (NCAM) er blevet hyppigst undersøgt [31] -. [34]. Interessant, er CD56 udtrykt af de fleste pædiatriske solide tumorer [37] – [39], [51], som også findes i vores tilfælde. Men mængden af ​​CD56-ekspression stort set varierede mellem forskellige tumor undertyper. Neuroblastom og PNET var de tumorer, der viste de højeste CD56 niveauer, støtte nytten af ​​CD56 både at diskriminere ikke-hæmatopoietisk vs. hæmatopoietiske neoplasmer [31], [34], og for differentialdiagnosen mellem distinkte undertyper af CD45

– ikke-hæmatopoietiske pædiatriske faste tumorer. Ligeledes har flere undersøgelser vurderet anvendeligheden af ​​CD81 og CD9 (sammen med CD45

– og CD56

+), for forskelsbehandling mellem neuroblastomceller og BM hæmatopoietiske celler, for mellemstationer formål [13], [48] – [49], [55], uden at udvide en sådan analyse til andre undertyper af pædiatriske solide tumorer. Blandt vores tilfælde, CD81 og CD9 viste en variabel og uensartet mønster af udtryk med begrænset anvendelighed som individuelle markører, som differentialdiagnose mellem neuroblastom og andre pædiatriske tumorer. Men når de kombineres med andre molekyler, CD81 bidrog til diskrimination af neuroblastom og PNET. På trods af dette, GD2 og CD271 var de to mest nyttige markører til at skelne mellem neuroblastom (GD2

+ hi CD271

– /lo) og PNET (GD2

– /lo CD271

+ hi). Samlet set disse resultater understøtter forestillingen om, at CD271

hi udtryk identificeret på PNET kan være forbundet med den mesenkymale stamcelle oprindelse af disse tumorer [56]. Interessant nok i den eneste neuroblastom patient, der viste CD271

– /+ lo tumorceller, CD271 ekspression var begrænset til den primære tumor, mens negativ i metastatiske BM-celler; dette kunne potentielt skyldes en forskellig grad af tumor celle modning begge steder, idet fravær af CD271 associeret med et mere umodne og aggressiv tumor adfærd [57] – [58]. Af note, CD99 blev også stærkt udtrykt i PNET, mens typisk negativ i de andre tumorer, hvilket antyder, at ud over CD271, kan CD99 også bidrage til diagnosticering af PNET. Salg

Få MFC immunfænotypiske studier af RMS har blevet rapporteret hidtil. I tråd med vores observationer viste sådanne undersøgelser, der RMS celler typisk vise en CD45

-, CD56

+, CD90

+

numyogenin

+ fænotype med variabel udtryk for CD57, desmin, vimentin og CD99 [31], [36], [39], [41].