PLoS ONE: MIR-29a Hæmmer Cell Proliferation og inducerer cellecyklusstop gennem nedregulering af p42.3 i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Som et nyligt identificeret og karakteriseret gen, p42.3 er associeret med celledeling og tumorgenicitet. Udtrykket af p42.3 opreguleres i human gastrisk cancer (GC), men dens underliggende virkningsmekanismer er ikke godt forstået. MikroRNA’er (miRNA) vides at spille vigtige regulatoriske roller i mange cellulære processer. Her udnyttede vi bioinformatik og eksperimentelle metoder til at undersøge de lovgivningsmæssige forhold mellem miRNA og p42.3 genet. Vi viste, at MIR-29a kunne undertrykke p42.3 ekspression på både mRNA og protein niveauer via direkte binding til dets 3’UTR. Desuden blev der observeret et omvendt forhold mellem miR-29a og p42.3 udtryk i gastrisk cancer cellelinjer og prøver GC væv, især i tilfælde, hvor p42.3 blev nedreguleret. Tilsammen har vi belyst tidligere indregnede roller miR-29a og indikerede, at miR-29a kan fungere, i det mindste delvist, ved at målrette p42.3 genet i human GC

Henvisning:. Cui Y, Su WY , Xing J, Wang YC, Wang P, Chen XY, et al. (2011) MIR-29a Hæmmer Cell Proliferation og inducerer cellecyklusstop gennem nedregulering af p42.3 i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 6 (10): e25872. doi: 10,1371 /journal.pone.0025872

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Februar 28, 2011; Accepteret: September 13, 2011; Udgivet: 5 oktober 2011

Copyright: © 2011 Cui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research program of China 973-programmet (2010CB5293, National High Technology Research and Development program Kina (863 program) (2006AA02A402, National Natural Science Foundation of Key program (nr 30.830.055) og ministeriet . for Folkesundhedsvidenskab, Kina (nr 200.802.094) til FJY de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

p42.3 er et nyt gen, der for nylig er blevet isoleret og identificeret af mRNA differential display (mRNADD) teknik. den fulde længde cDNA af p42 .3 er cirka 4,0 kb, og genet koder for et 389 aminosyre (aa) protein, der skønnes at have en molekylmasse på 42,3 kDa. Yderligere forskning har vist, at dets ekspression er cellecyklus-afhængig i gastrisk cancer (GC) cellelinier. Dens proteinekspressionsplasmider toppe under M-fasen af ​​cellens cyklus, før den gradvist aftagende efter celledeling; dette indikerer, at p42.3 kan være involveret i cellecyklusregulering. Endvidere silencing af p42.3 ved små interfererende RNA (siRNA) resulterer i opregulering af CHK2 og nedregulering af cyclin B1, der er to vigtige proteiner involveret i cellecyklusregulering [1], [2]. Mens RT-PCR og immunhistokemiske analyser har vist, at p42.3 er opreguleret i GC sammenlignet med normale vævsprøver, har funktionel forskning foreslået, at udtømningen af ​​p42.3 ikke kun kan resultere i inhibering af GC celleproliferation og kolonidannelse

in vitro

, men kan også reducere tumorigenicitet i nøgne mus [3]. Selvom tidligere undersøgelser har antydet en afgørende rolle for p42.3 gen i patologi GC, de specifikke underliggende mekanismer i søgsmålet mangler at blive afklaret.

MikroRNA’er (miRNA) består af en klasse af små (~ 22 nukleotider), endogene, ikke-kodende RNA’er, der er kendt for at spille vigtige regulatoriske roller i genekspression [4]. Den primære miRNA transkript kaldes PRI-miRNA [5], som transkriberes ved hjælp af RNA-polymerase II eller III [6], [7]. Pri-miRNA derefter spaltes af drosha-DGCR8 mikroprocessor komplicerede at frembringe precursor hårnålemolekyle (pre-miRNA), der derefter eksporteres fra kernen til cytoplasmaet ved exportin-5 /Ran-GTP. Med hjælp fra en kompleks, der indeholder RNase Dicer og det dobbeltstrengede RNA-bindende protein, TRBP er -70-nukleotid pre-miRNA forarbejdet til modne miRNA [8]. Den funktionelle streng af det modne miRNA indlæses i RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), som indeholder proteinerne, Argonaute (siden) og Tnrc6, medens den anden streng normalt nedbrydes [9]. Den modne miRNA guider RISC til de ufuldkomne komplementære sekvenser i target mRNA at undertrykke det beslægtede mRNA oversættelse, fremme udskrift forfald, eller begge [10]. Det vurderes, at de fleste kodning gener sandsynligvis er reguleret af miRNA, og mens en miRNA kan regulere mere end en målgener, kan visse gener reguleres af flere miRNA [11].

Voksende tyder på, at miRNA er involveret i en lang række fysiologiske og patologiske processer, herunder udvikling, differentiering, proliferation og apoptose [12.13,14,15]. Selvom abnormaliteter af miRNA udtryk er blevet bestemt i mange humane tumorer, herunder kolorektal, mave- og brystkræft [16], [17], er antallet af sådanne tumorer stadig voksende. Men de detaljerede funktioner miRNA i tumorer stadig, ikke belyst.

Nylige undersøgelser har antydet, at MIR-29 har komplekse funktioner i forskellige sygdomme. MIR-29a kan opføre sig som en tumorsuppressor i både lunge og pancreatiske cancercellelinjer, og dermed den exogene overekspression af MIR-29a resulterer i en betydelig reduktion i den invasive potentiale og proliferation af disse cellelinier [18]. Tumor suppressor rolle MIR-29a understøttes også af dens observerede nedregulering i et bredt spektrum af faste tumorer, herunder neuroblastom, sarcomer og hjernetumorer [19]. I modsætning hertil er MIR-29a opreguleret i indolent human kronisk lymfatisk leukæmi (B-CLL) [20] og akut myeloid leukæmi (AML) [21], hvilket tyder på en mulig tumor promotor rolle. Desuden kan den afvigende ekspression af MIR-29a findes i mange ikke-maligne sygdomme, herunder leverfibrose [22], diabetes [23] og Alzheimers sygdom [24]. Selv om mange gener allerede er blevet bekræftet til at være de direkte mål for miR-29a, såsom PPM1D [25], PI3K [26] og neuron navigator 3 [24], at de udgør en meget lille brøkdel af de samlede gener, miR-29a mål.

i denne rapport, viser vi, at p42.3 ekspression blev kontrolleret på niveauerne af både mRNA og protein ved miR-29a via direkte målretning af 3’UTR af p42.3. MIR-29a kunne undertrykke celleproliferation og inducere standsning af cellens cyklus, i det mindste delvist, via nedregulering af p42.3 ekspression. Desuden fandt vi, at ekspressionen af ​​p42.3 protein omvendt var korreleret med miR-29a udtryk i humane GC væv.

Resultater

p42.3-3’UTR er formodentlig målrettet efter miR -29a

Formodede miRNA, der blev forudsagt at målrette p42.3 genet ved mere end en database blev analyseret. De to øverste miRNA, som blev forudsagt for tre gange blev udvalgt til yderligere bekræftelse og de andre tre miRNA, herunder miR-29a, hvis formodede bindingssteder var tæt på dem af de øverste to blev også udvalgt som kandidater til validering. MIR-29a blev forudsagt af Targetscan og miRGEN databaser, som indikerede, at dets formodede bindingssted var på positionerne 213-219 af p42.3-3’UTR (figur 1A). De andre kandidater er ikke anført her.

A. Sekvensen af ​​MIR-29a med det formodede bindingssted i den humane p42.3 gen. Det formodede bindingssted med mutanten er vist i det nederste panel. B. Regulering af reportergenekspression ved MIR-29a i MKN-45-celler cotransficeret med PRI-MIR-29a og reportergen indeholdende det formodede bindingssted. **:

P

0,01

Direkte rettet mod p42.3-3’UTR af miR-29a

reportergenassay var ansat til. validere, om p42.3 var et direkte mål for miR-29a. Vildtype og mutant p42.3-3’UTR indeholdende det formodede bindingssted MIR-29a blev klonet i individuelle plasmider og fusioneres med reportergenet. Fluorescensintensiteten af ​​reportergenet blev signifikant reduceret i den gruppe, der blev co-transficeret med WTpcDNA3 /EGFP /p42.3 og pcDNA3.1 /PRI-MIR-29a sammenlignet med kontrollen. Desuden var der ingen signifikant nedgang i den fluorescerende intensitet i den gruppe, der var co-transficeret med MUTpcDNA3 /EGFP /p42.3 (figur 1B), hvilket yderligere bekræfter, at MIR-29a inducerede nedregulering af p42.3 genekspression via specifik binding af den formodede stedet for p42.3-3’UTR.

Angivelse af miR-29a og p42.3 er omvendt relateret i GC cellelinjer

for at sikre sammenhængen mellem p42 0,3 og miR-29a, studerede vi den endogene udtryk for miR-29a og p42.3 i seks humane GC cellelinier (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 og AGS) og én normal gastrisk epitel cellelinie (GES 1; Figur 2A-C). Vi fandt, at niveauet af p42.3 mRNA var signifikant højere end den normale kontrol i alle GC cellelinjer med undtagelse af SGC-7901, hvor forskellen ikke var statistisk signifikant. Ekspressionsniveauet af p42.3 var variabel på proteinniveauet, men var signifikant højere i alle de GC cellelinjer sammenlignet med GES-1. Vi viste også, at MIR-29a-ekspression var lav i fire af de GC-cellelinier ( SGC-7901, MKN-45, MGC-803 og AGS), som afslørede et omvendt forhold til p42.3 udtryk. Selvom ekspression af miR-29a var høj i SNU-1, dette ikke var statistisk signifikant. Det er værd at nævne, at høj ekspression af miR-29a i MKN-28 var en undtagelse.

A. Angivelse af p42.3 mRNA og modne miR-29a i seks GC cellelinier (SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1, og AGS) normaliseret til den normale gastriske epitel celle linje (GES -1) ved brug af kvantitativ real-time RT-PCR. Endogene referencer var GAPDH og U6 små nukleare RNA hhv. *:

P

0,05, **:

P

0,01. B og C. Ekspression af p42.3 protein i GC og normale gastriske epiteliale cellelinjer analyseret ved western blotting (B) og vist som gennemsnit ± SD (normaliseret; C). *:

P

0,05, **:.

P

0,01

MIR-29a regulerer p42.3 udtryk

at evaluere, om p42.3 blev undertrykt af mIR-29a, behandlede vi MKN-45 celler med de efterligner og inhibitorer af mIR-29a i 48 h for at exogent op- og nedregulere ekspressionen af ​​mIR-29a specifikt; ekspressionen af ​​p42.3 blev derefter bestemt. Efter transfektion af MKN-45 celler med de efterligner, den MIR-29a-ekspression øget med cirka 10 gange, medens behandlingen med inhibitorerne reducerede MIR-29a niveau med mere end 50% (figur 3A-B). Dette antydede, at både de efterligner og inhibitorer af MIR-29a arbejdet effektivt i vores eksperimenter. Overekspression af miR-29a i væsentlig grad kan undertrykke udtryk for p42.3 på både mRNA og protein niveauer, som var en lignende effekt til undertrykkelse af p42.3 ved p42.3 siRNA (si-p42.3). Vi har detekteret også, at CHK2 blev opreguleret og cyclinB1 blev nedreguleret efter lyddæmpning af p42.3 ved p42.3 siRNA. Interessant nok blev lignende virkninger udøves på CHK2 og cyclinB1 ved overekspression af MIR-29a i MKN-45-celler (figur 3C-D). Hertil kommer, transfektion af miR-29a hæmmere faldt dramatisk CHK2 udtryk og øget p42.3 og cyclinB1 udtryk (figur 3E-F). Dette antydede, at MIR-29a kan regulere ekspressionen af ​​p42.3 genet i MKN-45-celler.

A. Virkning af MIR-29a efterligner på den endogene ekspression af p42.3 mRNA. Modent MIR-29a blev eksogent opreguleret mens den endogene ekspression af p42.3 mRNA var signifikant nedreguleret i MKN-45-celler. **:

P

0,01. B. Virkning af MIR-29a inhibitorer på den endogene ekspression af p42.3 mRNA. Modent MIR-29a blev eksogent nedreguleret, mens den endogene ekspression af p42.3 mRNA blev markant opreguleret i MKN-45-celler. *:

P

0,05, **:

P

0,01. C og D. Virkning af MIR-29a efterligner på den endogene ekspression af p42.3, cyclin B1 og Chk2 proteiner svarede til dem af si-p42.3. Ekspressionsniveauerne af p42.3 og cyclin B1 protein faldt betydeligt efter MKN-45-celler blev behandlet med si-p42.3 eller MIR-29a efterligner mens niveauet af CHK2 protein steget dramatisk. Data er vist som middelværdi ± SD (normaliseret; D). *:

P

0,05. E og F. Effekt af MIR-29a inhibitorer på den endogene ekspression af p42.3, cyclin B1 og CHK2 protein. MIR-29a hæmmere vendt udtrykket ændringer ses i C og D. *:

P

0,05, **:.

P

0,01

MIR-29a inhiberer celleproliferation in vitro

Ifølge dataene fra celleproliferationsassay, vi trak absorptionsevne kurver ved bølgelængden 450 nm efter transfektion for forskellige varigheder. Vi fandt, at celleproliferation blev signifikant inhiberet efter transfektion af MKN-45-celler med p42.3 siRNA i 48 timer og 72 timer, og et lignende mønster blev bemærket efter celler blev transficeret med efterligninger af MIR-29a. Den grad af undertrykkelse opnås ved MIR-29a efterligner var større end p42.3 siRNA-induceret nedregulering (figur 4A). Tværtimod blev cellevækst fremmes med ca. 10%, sammenlignet med den negative kontrol ved transfektion med inhibitorer af MIR-29a i 48 timer, men der var et fald på 72 timer (figur 4B). Dette indikerede, at miR-29a kunne hæmme celledeling via undertrykke udtryk for p42.3.

A. MIR-29a efterligner inhiberede celleproliferation og inhibering hastighed ved 48 timer var ca. 20% og ca. 40% efter 72 timer, mens p42.3 siRNA inhiberede celleproliferation med ca. 15% efter 48 timer og 72 timer. **:

P

0,01. B. MIR-29a inhibitorer fremmet cellevækst med omtrent 10% ved 48 timer, men effekten svækket ved 72 timer. *:.

P

0,05

MIR-29a blokerer cellecyklusprogression

Silencing af p42.3 ved p42.3 siRNA kan resultere i cellecyklus arrestere; Derfor undersøgte vi, om miR-29a kan påvirke cellecyklusprogression via målrette p42.3 genet. Efter MKN-45 celler blev transficeret med p42.3 siRNA i 48 timer, fandt vi, at cellecyklussen blev blokeret ved G1 fase (75,93%,

P

0,05), sammenlignet med den negative kontrol ( 66,18%). Vi fandt, at efterligninger af miR-29a også kunne fremkalde G1 fase anholdelse i MKN-45 celler, når de behandles i 48 h (75,56%,

P

0,05, figur 5).

Flow cytometrisk analyse bekræftede, at både p42.3 siRNA og miR-29a efterligner induceret G1 fasen anholdelse i MKN-45 cellelinje.

Angivelse af miR-29a og p42.3 protein i GC og deres korrelation med klinisk-patologiske karakteristika

Brug en kvantitativ real-time PCR-teknikken blev mIR-29a påvist i 60 par af GC væv og deres matchede ikke-cancer tilstødende væv, mens p42.3 proteinniveau også blev evalueret i disse væv ved Western blotting. Ud af 60 GC væv prøver, p42.3 udtryk var høj i 35 tilfælde (35/60, 58,33%) i forhold til deres matchede ikke-kræft tilstødende væv. I de 25 sager, hvor p42.3 ekspression blev nedreguleret, miR-29a udtryk var høj i 21 sager. MIR-29a udtryk var lav i 27 tilfælde (27/60, 45%). Ovenstående data antyder et omvendt forhold mellem MIR-29a og p42.3 proteinekspression i vævsprøver (

P

= 0,000, tabel 1 og figur 6), men korrelationskoefficienten var ikke god (r = -0,316 .)

Der var et omvendt forhold mellem ekspression af p42.3 protein og miR-29a og ligningen af ​​deres forhold var y = -0.3458x + 2,8126 (y: udtryk for miR-29a, x :. ekspressionen af ​​p42.3 protein)

Desuden mIR-29a og p42.3 proteinekspression blev evalueret med hensyn til de klinisk-patologiske karakteristika for de 60 patienter, fra hvem vævsprøver blev taget. Vores resultater viste, at der ikke var nogen indlysende sammenhænge mellem p42.3 protein og miR-29a udtryk, henholdsvis med klinisk-patologiske træk (tabel 2).

Diskussion

p42.3 genet er stærkt konserveret i pattedyr, og som et onkogen, kan det spille en vigtig rolle i den progressive transformation af normale gastriske epitelceller til cancerceller. Dens forskellen udtryk i de faser cellecyklus afslører, at p42.3 kan være involveret i cellecyklus regulering. Dette blev yderligere bekræftet af vores resultater, som viste, at p42.3 lyddæmpning kunne ændre udtryk for to centrale proteiner, CHK2 og cyklin B1, som er involveret i cellecyklus regulering. Brug af tab-af-funktion eksperimenter demonstrerede vi, at p42.3 kan stimulere cellulær proliferation og som rapporteret, viste vores resultater, at p42.3 blev overudtrykt i GC væv sammenlignet med det tilgrænsende ikke-cancer mucosa [3]. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der resulterer i denne afvigende ekspression af p42.3 gen i GC dårligt forstået, så fremgår den manglende tilgængelige litteratur. MiRNA kan regulere genekspression ved at målrette de bindingssteder i målet mRNA [27], og i humane kræftformer, mange miRNA er allerede blevet impliceret. Imidlertid har den funktion at kun få blevet forstået til dato, især i GC [28].

I denne rapport, udvalgte vi miR-29a til yderligere undersøgelse af et reporter gen-system og i sidste ende identificeret, at p42. 3 var en direkte målgen af ​​mIR-29a. Vores data foreslog, at de fire databaser (Targetscan, microRNA.org, mikrokosmos Mål Version 5 og miRGen), der anvendes blev effektiv, men ikke perfekt, værktøjer til forudsigelse af miRNA mål og forudsat eksperimentelt bevis for forbedringer af den underliggende algoritme.

Vi viste, at p42.3 ekspression omvendt var relateret med mIR-29a-ekspression i fire GC cellelinier. I tre af disse, MKN-45, MGC-803 og AGS, dette var tydelig på både mRNA og proteinniveauet, men dette var ikke tilfældet i SGC-7901 cellelinie. Desuden MIR-29a-ekspression var ikke lav i MKN-28 og SNU-1 cellelinier. Tilsammen disse observationer tilladt os at hypotesen, at den regulerende rolle miR-29a er kompliceret i GC cellelinier og at miR-29a kan spille forskellige roller i forskellige cellulære baggrunde. Men de detaljerede mekanismer i miR-29a funktioner i GC cellelinjer kræver yderligere undersøgelser.

I vores undersøgelse, miR-29a overekspression kunne fremkalde lignende virkninger til dem, der opnås ved undertrykkelse af p42.3 ved p42.3 siRNA. Begge p42.3 mRNA og protein blev nedreguleret efter celler blev transficeret med p42.3 siRNA eller MIR-29a efterligner og celleproliferation og cellecyklus blev undertrykt, når cellerne undergik samme interferens. Det foreslås, at miR-29a kan være involveret i patogenesen af ​​GC via undertrykkelsen af ​​p42.3 genekspression. Men vi fandt fra vækstkurverne, at graden af ​​undertrykkelse af miR-29a efterligner var større end ved p42.3 siRNA. Det er vores opfattelse, kan den væsentligste årsag til dette være, at specifikke miRNA kunne regulere hundredvis af gener til at styre cellulære funktion. I den foreliggende undersøgelse kan MIR-29a inhibere celleproliferation, i det mindste delvist, ved at målrette p42.3.

Vores data viste, at selv hastigheden for høj ekspression af MIR-29a var 55% (33 /60) i GC, p42.3 udtryk var lav i 21 af disse sager. Dette antydede, at miR-29a kan have en afgørende rolle i GC væv med lave ekspressionsniveauer af p42.3.

I den foreliggende undersøgelse, vi valideret at p42.3 er et direkte mål for miR-29a. Vi har også påvist, at MIR-29a kan inhibere celleproliferation og blokere cellecyklussen, i det mindste delvist, via undertrykkelsen af ​​p42.3 ekspression i GC. Vi konkluderer, at MIR-29a kan spille en kritisk rolle ved regulering af ekspressionen af ​​p42.3 i GC. Interessant fandt vi, at p42.3 gen også kunne regulere ekspressionen af ​​miR-29a (data er ikke vist her), men den underliggende reguleringsmekanisme vil blive undersøgt i fremtiden.

Materialer og metoder

Bioinformatik

Fire effektive beregningsmæssige metoder, der udnytter forskellige evaluere systemer [29] – [32] blev anvendt til forudsigelse af de regulatoriske miRNA, der er målrettet den p42.3 genet, herunder Targetscan (http: //www.targetscan.org/), microRNA.org (https://www.microrna.org/microrna/getGeneForm.do/), mikrokosmos Mål Version 5 (https://www.ebi.ac.uk/enright-srv /mikrokosmos /htdocs /mål /v5 /) og miRGen (https://www.diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/miRGen/v3/Targets.cgi#Results). Mål blev udvalgt til yderligere bekræftelse fra gruppen af ​​miRNA, der var fælles for resultaterne fra mere end én søgning.

Vævsprøver

Sixty par histopatologisk bekræftet GC og tilstødende ikke-kræftvæv prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion på Renji Hospital tilknyttet Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Kina mellem juli 2007 og januar 2009. den matchede ikke-cancer tilstødende væv blev opnået mindst 5 cm fra tumor. Undersøgelsen blev godkendt af Research Ethics Committee of Shanghai Jiaotong Universitet og informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, mens skriftlig tilladelse blev opnået fra hver patient.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Menneskelig GC cellelinjer, SGC-7901, MKN-28, MKN-45, MGC-803, SNU-1 og AGS og GES-1 normal gastrisk epitel cellelinie, som blev indkøbt fra ATCC (USA), blev opretholdt i RPMI 1640 medium (Gibco, Gaithersburg, MD, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 incubator. En opløsning af trypsin (0,25%) blev anvendt til at frigøre cellerne fra kulturen kolben.

vektor konstruktion

For at konstruere ekspressionsvektorer PRI-MIR-29a blev først amplificeret med primere designet ved primer Premier 5.0 software (tabel 3) og derefter klonet ind pcDNA3.1 (Invitrogen). At producere de plasmider, som indeholdt det formodede bindingssted MIR-29a, både vildtype og mutant sekvenser fra position 111 til 380 i p42.3-3’UTR blev kemisk syntetiseret (figur 1A) og derefter blev klonet til den nedstrøms af EGFP-genet ved

Bam

HI og

Eco

RI steder i pcDNA3 /EGFP vektor (Saierbio, Tianjin, Kina).

reportergenassay

MKN-45-celler blev podet i tredobbelte brønde i en 24-brønds plade dagen inden transfektion. PcDNA3.1 (+) /primær-miR-29a blev cotransficeret med vildtype og mut-pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR hhv. Derefter blev 0,5 ug pcDNA3.1 (+) /primær-MIR-29a og 0,5 ug pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR blev tilsat til hver af brøndene, mens 0,1 ug vektor pDsRed-C1 (Clontech ), som udtrykte RFP, blev tilsat til hver brønd som en endogen reference. Celler, der kun var transficeret med pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR eller pcDNA3 /EGFP /p42.3-3’UTR + pcDNA3.1 (+) blev anvendt som kontroller. Celler blev opsamlet 48 timer efter transfektion og analyseret ud fra intensiteten af ​​EGFP og RFP fluorescens detekteres ved anvendelse fluorescensspektrofotometer F-4500 (Hitachi, Japan).

Cell transfektion

Transfektion af MKN-45 celler blev udført ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge protokollen fra producenten. MKN-45-celler blev podet i plader med 6 brønde eller plader med 96 brønde ved 30% konfluens på dagen forud for transfektion. Efterligner (100 nm, GenePharma) og hæmmere (200 nM, RIBOBIO) af miR-29a blev brugt til eksogent op- og nedregulere ekspressionen af ​​miR-29a. For at lukke munden p42.3 genekspression blev MKN-45-celler transficeret med siRNA mod p42.3 (SI-p42.3, 100 nM, GenePharma). Den kontrol-RNA (navngivet som NC) var ikke-homolog med enhver humane genom-sekvens. Sekvenserne af oligonucleotider er vist i tabel 4.

Real-time RT-PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) og efterfølgende behandlet med RNase-fri DNase I (Fermentas, San Diego, CA, USA). Total RNA (500 ng) blev omvendt transskriberet ved hjælp af PrimeScript RT reagens kit (Takara, Dalian, Japan). Primersekvenserne anvendt til at amplificere p42.3 og GAPDH er vist i tabel 3. For at analysere ekspressionen af ​​det modne MIR-29a, 2 pg af det totale RNA blev underkastet revers transkription ved hjælp af All-in-One miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, Guangzhou, Kina). Kvantitativ realtids-PCR for moden MIR-29a og U6 blev udført ifølge fabrikantens instruktioner ved anvendelse af ABI 7300 real-time PCR-system og specifikke primere designet af GeneCopoeia, Kina. Den relative ekspression af p42.3 og MIR-29a blev normaliseret til en endogen reference (GAPDH og U6 lille nukleare RNA henholdsvis) og i forhold til kontrollen. Resultaterne blev præsenteret som gange ændring, beregnet ved anvendelse af 2 (-ΔΔCT) metoden [33]; en relative ekspression forhold på 1,0 blev anset for lavt, mens et forhold på 1,0 blev betragtet som høj ekspression [14]

Western blotting

totalt protein fra dyrkede celler og væv. blev ekstraheret ved RIPA lysebuffer indeholdende PMSF, ifølge producentens anvisninger (Beyotime, Shanghai, Kina). Proteinkoncentration blev målt under anvendelse af Bradford-metoden [34]. Samlet, 40 ug protein blev elektroforeret gennem 10% SDS polyacrylamidgeler og blev derefter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membranen blev inkuberet med p42.3 antistof (1:500, Abmart, Kina), CHK2 antistof (1:1,000, CST), cyclinB1 antistof (1:1,000, CST) eller GAPDH (1:5,000, Kang Chen, Kina) ved 4 ° C natten over. Sekundære antistoffer blev mærket med HRP (Kang Chen, Kina) og signalerne blev påvist ved anvendelse af ECL-kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA). Efterfølgende blev billederne analyseret ved ImageJ 1,43 software. Proteinet ekspression blev normaliseret til en endogen reference (GAPDH) og i forhold til kontrollen. En relativ udtryk forholdet mellem 1,0 blev anset for lavt udtryk, mens et forhold mellem 1,0 blev betragtet som høj ekspression [14]

Cell proliferation assay

Høstet MKN-45 celler. (ca. 5 x 10

4 celler) blev podet i 96-brønds dyrkningsplader. Cellulær proliferation blev målt efter 24 timer, 48 timer og 72 timer efter transfektion, henholdsvis, ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (DOJINDO, Japan) ifølge fabrikantens protokol. Absorbansen ved en bølgelængde på 450 nm, som viser positiv relation til kapaciteten af ​​cellulær proliferation, blev bestemt ved et spektrofotometer (E-LIZA MAT-3000).

Cell cyklus assay

Fyrre -Otte timer efter transfektion blev cellerne løftet anvendelse af 0,25% trypsin og vasket i DPBS (Gibco); de blev derefter fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C i 24 timer. Til flowcytometrisk analyse (EPICS XL Beckman Coulter), blev celler inkuberet i RNAse (Fermentas) ved 37 ° C i 30 minutter, behandlet med PI (Sigma) og suspenderet i 300 pi DPBS.

Statistisk analyse

data blev vist som middelværdi ± SD fra mindst tre separate forsøg. Betydningen blev analyseret med t-test og ikke-parametriske tests (Mann-Whitney U-test og Kruskal-Wallis H test). Den statistiske signifikans af korrelation mellem ekspressionen af ​​MIR-29a og p42.3 protein blev beregnet af chi-square test og Spearman rang korrelation. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 13.0 software (IBM, USA) og forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved

P

0.05.