PLoS ONE: D-vitamin receptor Mangel Forbedrer Wnt /β-Catenin Signaling og Tumor Burden i Colon Cancer

Abstrakte

Aberrant aktivering af Wnt /β-catenin vej er kritisk for initiering og progression af de fleste tyktarmskræft. Denne aktivering provokerer akkumulering af nukleare β-catenin og induktion af dets målgener.

Apc

min /+

mus er den mest anvendte model for tyktarmskræft. De huser en muteret

Apc

allel og udvikle tarm adenomer og carcinomer i de første måneder af livet. Denne fænotype skyldes mutationen af ​​det andet

Apc

allel og den deraf følgende akkumulering af nuklear β-catenin i de berørte celler. Her beskriver vi, at D-vitamin receptor (VDR) er en afgørende modulator af nukleare β-catenin-niveauer i tyktarmskræft

in vivo

. Ved passende opdræt af

Apc

min /+

mus og

VDR

+/-

mus har vi genereret dyr udtrykker et muteret

Apc

allel og to , en eller ingen

VDR

vildtype alleler. Mangel på

VDR

øget antallet af colon Aberrant Crypt Foci (ACF), men ikke fra adenomer eller karcinomer i enten tyndtarmen eller tyktarmen. Vigtigere, colon ACF og tumorer i

Apc

min /+ VDR

– /-

mus havde øget nuklear β-catenin og tumorerne nåede en større størrelse end

Apc

min /+ VDR

+ /+

. Både ACF og karcinomer i

Apc

min /+ VDR

– /-

mus viste højere udtryk for β-catenin /TCF målgener. I tråd med dette,

VDR

knock-down i dyrkede humane colon cancerceller forbedrede β-catenin indhold og target genekspression nukleare. Konsekvent,

VDR

udtømning ophævet kapacitet på 1,25 (OH)

2D

3 at fremme udflytning af β-catenin fra kernen til plasmamembranen og at inhibere β-catenin /TCF målgener. Afslutningsvis VDR styrer niveau af nuklear β-catenin i colon cancerceller og kan derfor dæmpe virkningen af ​​onkogene mutationer, der aktiverer Wnt /β-catenin vej

Henvisning:. Larriba MJ, Ordóñez-Morán P , Chicote I, Martín-Fernández G, Puig I, Muñoz A, et al. (2011) D-vitamin receptor Mangel Forbedrer Wnt /β-Catenin Signaling og Tumor Burden i tyktarmskræft. PLoS ONE 6 (8): e23524. doi: 10,1371 /journal.pone.0023524

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: 23. marts 2011; Accepteret: 19 Juli 2011; Udgivet: 15 August, 2011

Copyright: © 2011 Larriba et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fondo de Investigación Sanitaria-Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, PI081356), Vall d’Hebron Institute of Oncology, Olga Torres Foundation, Fundación de la Asociación Española de Lucha Contra el cANCER (AECC), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-18302) og Red Tematica de Investigación Cooperativa en cancer (ISCIII, RD06 /0020/0009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den anden mest almindelige dødsårsag af kræft i de udviklede lande [1]. Sandsynligvis, ved vi mere om de genetiske ændringer, der forårsager tyktarmskræft end for nogen andre faste neoplasi. Mutationer i

APC

/adenomatøs polypose coli,

CTNNB1

/β-catenin eller

Axin

gener, der aktiverer Wnt /β-catenin vej er ansvarlige for at indlede de fleste kolon cancere [2]. Det første trin i colon tumorigenese involverer dannelsen af ​​kryptfoci (ACF), som senere udvikle sig til adenom [3]. Posterior malignisering af adenom til karcinom kræver erhvervelse af nye ændringer i gener, der er relateret til Wnt /β-catenin signalering eller tilhører andre veje, der virker synergistisk i processen [2].

Apc

min /+

mus huser en kønscellerne inaktiverende mutation i et

Apc

allel udvikle flere tarm adenomer og carcinomer efter tre måneder [4]. Denne fænotype forekommer som en konsekvens af spontan mutation af den resterende

Apc

allel (tab af heterozygositet) og aktivering af Wnt /β-catenin-signalvejen. Denne musemodel er blevet guldstandarden af ​​tarmkræft indvielse.

Wnt /β-catenin vej regulerer evne β-catenin protein til at drive reguleringen af ​​specifikke målgener [5], [6]. Kort fortalt, i fravær af en Wnt signal eller aktiverende mutationer, β-catenin er kun til stede bundet til E-cadherin i intercellulære

adherensovergange

, som den frie protein er hurtigt phosphoryleret med caseinkinase-Iβ ( CK-Ia) (Ser45) og glycogensynthasekinase-3 (GSK-3β) (Ser33, Ser37 og Thr41) i et kompleks dannet også af de tumorsuppressorproteiner APC og Axin. Phosphorylering etiketter p-catenin for ubiquitinering og nedbrydning af proteasomet [7]. I sådanne basale betingelser DNA-bundne T-celle faktor /lymfoide enhancer faktor (TCF /LEF) proteiner interagerer med transkriptionelle corepressorer at blokere målgenekspression i kernen. Binding af Wnt-ligander til deres celleoverfladereceptor komplekser (Frizzled-LRP) resulterer i rekruttering af cytoplasmatiske Axin til plasmamembranen, aktivering af Dishevelled protein og andre ikke velkarakteriserede effekter, der fører til inhibering af β-catenin phosphorylering. Dette tillader β-catenin at akkumulere og træde ind i kernen, hvor den interagerer med TCF /LEF familiemedlemmer og forårsager aktivering af deres ellers undertrykte målgener [5], [7]. Wnt /β-catenin pathway er den vigtigste drivkraft bag proliferation af epitelceller i colon og er afgørende for opretholdelsen af ​​progenitor rum [8], [9]. Imidlertid mutationerne fundet i tyktarmskræft resultat i den afvigende aktivering af vejen og inducere den konstitutive ekspression af dets målgener (hovedsagelig involveret i celleproliferation og dedifferentiering), fører til dannelsen af ​​godartede endnu langlivede adenomer. Ophobning af yderligere genetiske og epigenetiske ombygninger brændstoffer tumor progression.

Mange epidemiologiske og eksperimentelle undersøgelser tyder på, at D-vitamin

3 (cholecalciferol), dets mest aktive metabolit 1α, 25-dihydroxyvitamin D

3 (calcitriol , 1,25 (OH)

2D

3) og flere analoger beskytter mod tyktarmskræft [10] – [12]. Vi har rapporteret, at 1,25 (OH)

2D

3 inhiberer proliferation og fremmer epitheldifferentiering af humane coloncancer-celler ved at inducere ekspressionen af ​​E-cadherin og ved at antagonisere Wnt /β-catenin pathway. Sidstnævnte er resultatet af to primære mekanismer: a) induktion af direkte binding af vitamin D receptor (VDR) til p-catenin, hvilket udelukker dannelsen af ​​transkriptionelt aktive β-catenin /TCF-komplekser, og b) induktion af β catenin nuklear eksport og relocalization på plasmamembranen

adherensovergange

som en konsekvens af E-cadherin opregulering [13]. Derudover 1,25 (OH)

2D

3 forøger ekspressionen af ​​DICKKOPF-1 (DKK1), et udskilt protein, der inhiberer Wnt signalering fra dens plasmamembranreceptorer [14]. Vi har også beskrevet, at menneskelig

VDR

gen er et direkte mål for SNAIL1 og SNAIL2 /slug transskription repressorer, og at VDR udtryk i kolon kræftpatienter reduceres ved fremskredne stadier af sygdommen er forbundet til opregulering af disse faktorer [15], [16]. Følgelig høj SNAIL1 /2-ekspression i dyrkede coloncancerceller øger β-catenin transkriptionel aktivitet ved at undertrykke VDR-ekspression og dens antagonistiske aktivitet på Wnt /β-catenin signalering [16], [17].

β-Catenin har en bred vifte af pleiotrope effekter, der kan ikke sandsynligvis forklares alene ved modulering af TCF /LEF handling. Således har β-catenin nylig blevet beskrevet at binde adskillige transkriptionsfaktorer af de nukleare receptor-superfamilien og homeobox-proteiner [13], [18], [19]. I de fleste tilfælde β-catenin binding forøger den transkriptionelle aktivitet af disse faktorer og påvirker ekspressionen af ​​alternative eller yderligere sæt af målgener involveret i celle-skæbne beslutninger langs udvikling, vævshomeostase eller cancer [19], [20]. Vores indledende beskrivelse af direkte interaktion af β-catenin med VDR i humane colon cancerceller er blevet bekræftet i andre cellesystemer [21] – [24]. β-catenin /VDR interaktion involverer aktivator funktion-2 (AF-2) transaktiveringsdomæne af VDR og det C-terminale domæne af β-catenin [21]. I mus hud, β-catenin /VDR styrer målgener, epitelial stamceller skæbne og tumor udvikling [20]. I dette system, øget nuklear β-catenin fremmes tumorinitiering mens VDR-ligander beskytte mod kræft ved at reducere styrken af ​​Wnt /β-catenin signalering [20]. I overensstemmelse med dette, behandling af

Apc

min /+

mus med 1,25 (OH)

2D reducerer

3 eller analoger tumor belastning [25] eller polyp nummer og belastning [ ,,,0],26].

det er vigtigt at understrege, at niveauet af β-catenin i kernen definerer styrken af ​​Wnt-signal og følgelig skæbne eller opførsel af flere typer normale og tumorceller [5], [27]. Ud for aktiverende mutationer af Wnt /β-catenin pathway komponenter, andre genetiske ændringer som mutationer i

K-RAS

[28] eller aktivering af onkogene pathways ligesom HGF /c-Met signaling [29] forbedre nukleare p-catenin akkumulering under tyktarmskræft progression. I et sådant scenario kan agenter i stand til at mindske β-catenin nuklear indhold og så at dæmpe Wnt /β-catenin signalet blive potentielt anvendes i cancerterapi, så længe tumorceller viser Wnt pathway afhængighed.

I denne undersøgelse har vi vurdere konsekvenserne af

VDR

mangel på initiering og udvikling af tarmkræft drevet af aktivering af Wnt /β-catenin vej. Effekten af ​​

VDR

fravær er blevet analyseret både

in vivo

in vitro

: i tumorer genereret i

Apc

min /+ VDR

– /-

mus og i dyrkede humane colon kræftceller, hvor

VDR

udtryk blev slået ned ved hjælp af shRNA. Derudover har vi undersøgt virkningen af ​​VDR rekonstituering i VDR-negative humane coloncancer-celler. Vores resultater etablere en direkte forbindelse mellem VDR funktion og nukleare β-catenin niveauer, der er afgørende for at kontrollere aktiviteten af ​​Wnt /β-catenin signalering i tyktarmskræft

in vivo

Resultater

Brug rådighed

Apc

min /+

VDR

+/-

mus vi genereret af passende krydsninger

Apc

min /+ VDR

+ /+, Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

dyr. Histologisk analyse på fem måneders alderen viste, at

VDR

mangel påvirkede ikke det samlede antal tumorer i

Apc

min /+

mus, enten i tyndtarmen eller tyktarmen (figur 1a, 1b). I modsætning hertil kolon tumorer i

Apc

min /+ VDR

– /-

mus var signifikant større end i

Apc

min /+ VDR

+ /+

eller

Apc

min /+ VDR

+/-

mus (figur 1c). Selvom forskellige i størrelse, colon adenomer og karcinomer var histopatologisk tilsvarende i alle mus uafhængigt af deres VDR status (figur 1d). Desuden er antallet af colon ACF var højere i

Apc

min /+ VDR

– /-

mus end i

Apc

min /+ VDR

+ /+

eller

Apc

min /+ VDR

+/-

mus (figur 2a).

Samlet antal tumorer (adenomer og karcinomer) i tyndtarmen (a), eller i tyktarmen (b),

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til én mus analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. (C) størrelse kolon tumorer (adenomer og karcinomer) fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+ /-

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til en tumor analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. P-værdien for en-vejs ANOVA-analyse er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem grupper efter Bonferroni multipel sammenligning post-test. (D) Repræsentative hæmatoxylin /eosin farvning billeder af tyktarmskarcinomer fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Scale bar, 300 um.

(a) Samlet antal colon ACF i

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til én mus analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. (B) Øvre paneler, repræsentative hæmatoxylin /eosinfarvning billeder af colon ACF i

Apc

min /+ VDR

+ /+

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Pilespidser angiver ACF. Scale bar, 50 um. Middle paneler, repræsentative immunofluorescens billeder, der viser β-catenin udtryk og lokalisering i colon ACF fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Pilespidser angiver ACF. Scale bar, 100 pm. Lavere paneler er en forstørrelse af mellemledere paneler. Scale bar, 50 um. (C) Kvantificering af β-catenin nukleare niveau i colon ACF fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+ /-

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til en læsion analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. (D) Kvantificering af β-catenin nukleare niveau i colon adenomer og carcinomer fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til en læsion analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. (A, c, d) p-værdier for envejs ANOVA analyse er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem grupper efter Bonferroni multipel sammenligning post-test.

Næste vi evaluerede status Wnt pathway aktivering i colonlæsioner ved at analysere β-catenin udtryk. Selv ACF i

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /- Restaurant mus ikke skelnes ved hæmatoxylin /eosin (H /E) farvning, vi observerede en nettostigning i nukleare og cytosol β-catenin-niveauer i den fuldstændige mangel på

VDR

(figur 2b). Henviser β-catenin-farvning var høj og helt homogen blandt celler i ACF (figur 2b), var det meget heterogen i carcinomer i de tre typer af dyr (Figur S1a). Dette fænomen blev også observeret i humane primære coloncarcinomer (Figur S1B), hvor niveauet for nuklear β-catenin er heterogen og sandsynligvis definerer tumorigent potentiale af forskellige populationer af kræftceller til stede i tumoren [29]. Denne heterogenitet kan forklare, hvorfor en statistisk signifikant stigning i den nukleare β-catenin niveau blev fundet i ACF af

Apc

min /+ VDR

– /-

i forhold til

Apc

min /+ VDR

+ /+

eller

Apc

min /+ VDR

+/-

mus (Figur 2c), men kun en mindre tendens blev observeret i adenomer og karcinomer (figur 2d).

for at demonstrere en årsagssammenhæng mellem

VDR

tab og stigningen i nukleare β-catenin, vi studerede SW480-ADH humane colon cancerceller, hvor

VDR

blev slået ned ved hjælp af shRNA. Disse celler havnen fleste af genetiske abnormiteter, der kendetegner avancerede tyktarmskræft såsom mutation af

APC

og

TP53

tumorsuppressorgener, aktivering af

K-RAS

onkogen og

c-MYC

amplifikation [13]. Efter aftale med

in vivo

resultater, en kraftig stigning i indhold nukleare β-catenin blev fundet i shVDR SW480-ADH-celler i forhold til shControl celler (figur 3a, 3b). Desuden

VDR

knock-down ophævede kapacitet på 1,25 (OH)

2D

3 at inducere E-cadherin ekspression og β-catenin flytning fra kernen til plasmamembranen ( Figur 3a). Også,

VDR

knock-down forhindrede reorganisering af β-tubulin cytoskelet og ændringen i cellemorfologi induceret af 1,25 (OH)

2D

3, der fører til dannelse af kompakte epithelioid øer (figur 3b).

Repræsentative immunofluorescens billeder, der viser β-catenin og E-cadherin (a) eller β-catenin og β-tubulin (b) ekspression og lokalisering i SW480-ADH-celler inficeret med lentivirus udtrykker shVDR eller shControl og behandlet med 1,25 (OH)

2D

3 eller vehikel i 72 timer. Scale bar, 20 pm.

Vi ønskede at undersøge, om stigningen i niveau af nuklear β-catenin oversat til et stærkere Wnt /β-catenin signalering. Til dette formål undersøgte vi β-catenin /TCF-afhængig transkription i colon cancerceller. shControl og shVDR SW480-ADH-celler blev inficeret med lentivirus koder for reporter eGFP proteinet under kontrol af syv kopier af en konsensus TCF /LEF-bindingssted (figur 4a) [30]. Tilstedeværelsen i den lentivirale konstruktionen af ​​den røde fluorescerende protein mCherry styret af en konstitutiv promotor har tilladelse til at identificere inficerede celler under et fluorescensmikroskop og ved flowcytometri. I lighed med p-catenin farvning i colontumorer, fandt vi bestemt heterogenitet i β-catenin /TCF aktivitet blandt cellekulturen: variabel eGFP ekspression i lige inficerede celler (figur 4b). Analysen af ​​hele cellepopulationen ved flowcytometri viste, at andelen af ​​høj-eGFP celler var overlegne i shVDR end i shControl cellekulturer (figur 4c). Desuden shVDR celler havde en signifikant højere eGFP signal gennemsnit end shControl celler (figur 4d). Vi fandt også, at faldet i eGFP ophobning forårsaget af 1,25 (OH)

2D

3 i shControl celler (reduktion af andelen af ​​high-eGFP celler og eGFP signal gennemsnit) blev svækket i shVDR celler ( Figur 4c, 4d).

(a) Diagram over 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry lentiviral konstruktion bruges til at inficere shControl og shVDR SW480-ADH-celler. (B) Repræsentant fase-kontrast og fluorescens billeder, der viser ekspression af eGFP og mCherry i SW480-ADH celler inficeret med 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry vektor. Pilespidser angiver tilsvarende inficerede celler, der har variabel ekspression af eGFP. Målestokke 20 uM. (C) Flowcytometrianalyse af eGFP udtryk i shControl og shVDR SW480-ADH celler inficeret (mCherry positiv) med 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry vektor og behandlet med 1,25 (OH)

2D

3 eller vehikel i 96 timer. Procentdelen af ​​celler i hver port er angivet. (D) Kvantificering af flowcytometri data, der viser den gennemsnitlige ekspression af eGFP i de inficerede mCherry-positive celler. Dataene svarer til tre uafhængige forsøg. P-værdien for en-vejs ANOVA-analyse er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem grupper efter Bonferroni multipel sammenligning post-test. (E) Analyse af QRT-PCR af

VDR

,

AXIN2

,

LEF1

og

c-myc

mRNA-ekspression i shControl og shVDR SW480- ADH celler behandlet med 1,25 (OH)

2D

3 eller vehikel i 48 timer. Det geometriske gennemsnit af ekspressionen af ​​SDHA og TBP husholdningsgener blev anvendt til RNA-ekspression normalisering som angivet i Materialer og Metoder. Tal angiver procentdelen af ​​inhibering med 1,25 (OH) 2D3 behandling i hver celletype. Dataene svarer til tre uafhængige forsøg

Det er vigtigt, blev højden af ​​nukleare β-catenin-niveauer afspejles i en forøget ekspression af flere β-catenin /TCF målgener:. QRT-PCR-analyse afslørede højere niveauer af

AXIN2

,

LEF1

og

c-myc

mRNA i shVDR end i shControl celler (Figur 4e). Derudover hæmning af ekspressionen af ​​β-catenin /TCF målgener med 1,25 (OH)

2D

3 blev reduceret i shVDR celler (Figur 4e). Reduktionen af ​​VDR-ekspression ved shRNA blev også analyseret ved QRT-PCR (figur 4e) og omsættes til upåviselige proteinniveauer ([31] og data ikke vist). Som kontrol undersøgtes ekspressionen af ​​

CDH1

/E-cadherin og

CYP24A1 Salg i disse celler, to 1,25 (OH)

2D

3 målgener. Induktionen af ​​begge gener blev drastisk hæmmet i shVDR celler (Figur S2A).

Dernæst vi udvidet vores studier til andre humane colon cancer cellelinjer.

VDR

knock-down i HCT116 og HT29-celler også fremmet en stigning i nukleare β-catenin-niveauer (fig S2b) og aktiveringen af ​​TCF /LEF-afhængig transskription (fig S2C), hvilket fører til en højere ekspression af de β-catenin målgener

AXIN2

og

DKK1

(Figur S2d). En sådan genregulering var ledsaget af en generel tab af epitelial organisation (Figur S2b). Som forventet, reduktion af

VDR

udtryk blokeret kapacitet på 1,25 (OH)

2D

3 til at fremkalde sit mål gen

CYP24A1

(Figur S2d). Men, og Modsat data fra SW480-ADH-celler, 1,25 (OH)

2D

3 havde ingen virkning på β-catenin placering eller transkriptionsaktivitet i HCT116 og HT29-celler (Figur S2d og data ikke vist) . Grunden kan være, at disse celler udtrykker højt niveau af E-cadherin og således β-catenin er placeret på plasmamembranen i fravær af 1,25 (OH)

2D

3.

Forbigående udtryk for eksogen vildtype VDR i VDR-negative human SW620 metastatiske tyktarmscancerceller reduceret deres høje niveauer nukleare β-catenin (Figur S3). Derimod VDR- ΔAF2 og VDR-L417S mutanter, som er ude af stand til at binde β-catenin og rekruttere klassiske coaktivatorer [21] ændrede ikke den nukleare indhold af β-catenin (fig S3). Ligeledes ekspressionen af ​​et VDR-mutant ikke i stand til at binde klassiske coaktivatorer, men i stand til at binde β-catenin (VDR-E420Q) [21] havde ingen virkning på β-catenin nuklear indhold i SW620-celler (Figur S3).

den observerede stigning i indhold nukleare β-catenin af

VDR

knock-down er ikke en følge af den reducerede aktivitet af kinaser CK-Ia eller GSK-3p da graden af ​​β-catenin-phosphorylering på Ser45 eller Ser33 /Ser37 /Thr41 var uændret i shVDR SW480-ADH-celler (Figur S4A). Som β-catenin-phosphorylering ved Ser552 og Ser675 ved proteinkinase A og /eller AKT er blevet foreslået at fremme β-catenin nuklear placering og /eller transkriptionelle aktivitet [32] – [34], analyserede vi også den mulighed, at disse kinaser var involveret i virkningen af ​​VDR-knockdown på β-catenin. Vi fandt, at β-catenin fosforylering på Ser552 og Ser675 blev reduceret i shVDR SW480-ADH-celler (Figur S4).

Næste vi havde til formål at bekræfte effekten af ​​VDR-mangel på β-catenin target gener

in vivo

. Til dette formål har vi analyseret ved immunfluorescens og kvantificeres niveauet af ekspressionen af ​​to β-catenin /TCF målgener (

CCND1

/cyclin D1 og

LEF1

) i tyktarmen ACF og carcinomer i

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Følgelig med data fra dyrkede celler, blev en signifikant forøget ekspression af begge genprodukter fundet i læsioner af

Apc

min /+ VDR

– /-.

Mus (figur 5)

Kvantificering af cyclin D1 (a) og LEF1 (d) proteinekspression i colon læsioner fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Hver prik svarer til en læsion analyseret og den vandrette linje angiver middelværdien. P-værdierne for envejs ANOVA analyse er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem grupper efter Bonferroni multipel sammenligning post-test. Repræsentative immunofluorescens billeder, der viser β-catenin og cyclin D1 (b, c) eller β-catenin og LEF1 (e, f) ekspression og lokalisering i colon ACF (b, e) og carcinomer (c, f) fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Målestokke 50 um (b, e) og 200 um (c, f). Stjerner angiver en uspecifik farvning.

Endelig har vi analyseret graden af ​​differentiering af ACF og karcinomer stede i tyktarmen af ​​

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Antistoffer mod cytokeratiner (pan-cytokeratin) og villin1 som markører for epitheldifferentiering blev anvendt (Figur S5). ACF udtrykte meget lave niveauer af disse proteiner som forventet fra progenitoren fænotype indført ved høj Wnt /β-catenin signalering (figur 6a, 6b). I carcinomer udtryk for begge mærker var heterogen (figur 6c, 6d), der er enig med den heterogene udtryk for β-catenin tidligere beskrevet (figur S1a). Ingen væsentlige forskelle i ekspression af cytokeratiner og villin1 blev fundet mellem læsioner af

Apc

min /+ VDR

+ /+

,

Apc

min /+ VDR

+/-

og

Apc

min /+ VDR

– /- iBooked.dk mus, hvilket tyder på, at disse to differentiering markører er tabt tidligt i colon tumorigenese, sandsynligvis som følge af den første aktivering af Wnt /β-catenin vej.

Repræsentative immunofluorescens billeder, der viser β-catenin og villin1 (a, c) eller β-catenin og pan-cytokeratin (b, d) udtryk og lokalisering i colon ACF (en , b) og carcinomer (c, d) fra

Apc

min /+ VDR

+ /+

Apc

min /+ VDR

– /-

mus. Stiplede linjer afgrænser ACF. Tal angiver regioner med forskellig mønster af ekspression af de analyserede proteiner i den samme tumor: 1) høj β-catenin, lav villin1 /cytokeratiner; 2) lav β-catenin, høj villin1 /cytokeratiner. Scale barer, 50 um (a, b) og 200 um (c, d).

Diskussion

niveau af nuklear β-catenin definerer styrken af ​​Wnt /β catenin signalering og i konsekvens skæbne og fænotype af mange typer af normale og kræftceller. Afvigende aktivering af Wnt /β-catenin signalering grund af ændringer i dele af vejen er ansvarlig for at indlede de fleste menneskelige kolon kræft, som fremhæver betydningen af ​​at styre nukleare β-catenin ophobning [28], [29], [35] . Selv indledningen af ​​colon tumorigenese anses klonale [36], coloncarcinomer udviser dog heterogen nukleare β-catenin-ekspression. Dette er kendt som β-catenin paradoks og har ført for at søge efter alternative veje modulerer β-catenin placering og aktivitet. Blandt dem,

K-RAS

mutation og myofibroblaster-afledt HGF er for nylig blevet foreslået at øge β-catenin nukleare indhold [28], [29].

Meget lidt er kendt om mekanismer til forringelse af niveauet for β-catenin i kernen. Vi har beskrevet at 1,25 (OH)

2D

3 og flere mindre calcæmiske analoger forstyrrer Wnt /β-catenin pathway i en serie af human coloncancer-cellelinjer i flere tilstande: de øger bindingen af ​​VDR til p-catenin hæmmer dannelsen af ​​β-catenin /TCF-komplekser, inducerer ekspressionen af ​​Wnt-inhibitoren DKK1, og fremme udflytning af β-catenin fra kernen mod plasmamembranen hvor det binder E-cadherin på

adherens vejkryds

[13], [14]. Formodede mekanismer for denne sidstnævnte effekt omfatter induktion af β-catenin nukleare eksport eller Sequester af nyligt syntetiseret og /eller cytosolisk β-catenin protein ved E-cadherin, hvis udtryk er stærkt induceret af 1,25 (OH)

2D

3. En anden mekanisme Wnt /β-catenin inhibering i coloncancer er blevet foreslået af Kaler og cols .: 1,25 (OH)

2D

3 nedsætter syntesen og sekretionen af ​​THP-1-makrofager af interleukin-1β, et cytokin, der aktiverer Wnt /β-catenin pathway i colon cancerceller gennem blokade af β-catenin phosphorylering af GSK-3β [37]. Men funktionen af ​​alle disse celle-selvstændige og ikke-celle-autonome mekanismer,

in vivo

forblev ukendt.

I dette studie undersøgte vi, om

VDR

mangel ændrer β catenin nuklear indhold og Wnt /β-catenin vej i de mest almindeligt anvendte dyremodel for tyktarmskræft,

Apc

min /+

mus. Vores resultater viser, at

VDR

mangel i

Apc

min /+

mus stiger nukleare β-catenin niveauer og udtryk af Wnt /β-catenin målgener og i overensstemmelse med disse effekter , øger den samlede colontumor belastning. Konsekvent og scorede-down

VDR

efter shRNA i humane coloncancer-celler forøger nuklear indhold af β-catenin, dens transkriptionsaktivitet, og ekspressionen af ​​Wnt /β-catenin målgener. Desuden forbigående restaurering af vildtype VDR udtryk i VDR-negative humane SW620 kolon kræftceller falder nukleare β-catenin niveau, hvorimod VDR-ΔAF2, VDR-L417S eller VDR-E420Q mutanter, ude af stand til at binde klassiske coaktivatorer og aktivere gentranskription [21 ], gjorde ikke. Mærkeligt, blandt dem kun VDR-E420Q er i stand til at binde β-catenin [21] og dens re-udtryk i

VDR

– /- mus redder alopeci, men ikke engelsk syge fænotype [38]. Det synes derfor, at nukleare β-catenin niveau og aktivitet afhænger af evnen af ​​VDR at rekruttere klassiske transkriptionelle co-aktivatorer.

Vores data viser, at VDR knock-down i SW480-ADH celler ikke påvirker β-catenin phosphorylering med CK-Ia eller GSK-3β, kassere en rolle VDR regulering total β-catenin akkumulation. Ud fra følgende betragtninger β-catenin niveau stiger nukleare i fravær af VDR, er den totale cellulære mængde β-catenin protein ikke ændret (figur S4A). Uventet, vi fandt også, at phosphorylering af β-catenin ved Ser552 og Ser675 foreslået at forhøje β-catenin transkriptionel aktivitet er reduceret i shVDR SW480-ADH-celler. den formodede hæmmende effekt, at reduktionen af ​​disse phosphoryleringer kan have på β-catenin transkriptionel aktivitet synes dog der skal passeres af effekten af ​​VDR-mangel stigende β-catenin nukleare translokation. Tilsammen tyder disse data, at VDR ikke kontrollerer β-catenin nedbrydning, men sandsynligvis favoriserer sin omfordeling til cellekernen.

Vores resultater afslører en roman

in vivo

funktion af VDR som afgørende modulator af Wnt /β-catenin signalstyrke i tyktarmskræft. Konstateringen af, at

betyder VDR

mangel ikke ændre antallet af tumorer, men øger tumor belastning viser, at VDR ikke blokerer de første mutationer, der provokerer den tidlige aktivering af Wnt /β-catenin vej, men at det fortrinsvis har en langsigtet beskyttende virkning på tumorvækst ved at begrænse styrken af ​​Wnt /β-catenin onkogen signal. Overensstemmende med vores resultater, har en meget nylig rapport vist, at

Apc

min /+ VDR

– /- iBooked.dk mus præsentere større intestinale tumorer end

Apc

min /+ VDR

+ /+

mus, selvom de molekylære mekanismer bag denne fænotype ikke blev undersøgt [39]. Overensstemmelsen af ​​de to parallelle undersøgelser bekræfter deres vigtigste resultater.

Resultatet af vores undersøgelse er relevante for klinikken, da VDR udtryk nedreguleres i ca. to tredjedele af avancerede kolon tumorer associeret med opregulering af

SNAI1

og

SNAI2

gener, der koder for SNAIL1 /SNAIL2 transkriptionelle repressorer [15], [16], [40]. Scale bar, 500 pm.