PLoS ONE: Icaritin Årsager Vedvarende ERK1 /2 Aktivering og fremkalder apoptose i Human endometriecancer Cells

Abstrakt

Icaritin, en forbindelse fra

Epimedium Genus

, har selektiv østrogen receptor (ER) modulerende aktiviteter, og besidder anti-tumor aktivitet. Her undersøgte vi icaritin virkning på cellevækst af humane endometriecancer Hec1A celler og fundet, at icaritin potent inhiberede proliferation af Hec1A celler. Icaritin-hæmmede cellevækst var forbundet med øgede niveauer af p21 og p27-ekspression og reduceret cyclinD1 og CDK 4 udtryk. Icaritin også induceret celle apoptose ledsaget af aktivering af caspaser som påvist ved spaltning af endogene substrat Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og cytochrom c-frigivelse, som blev ophævet ved forbehandling med den pan-caspaseinhibitor z-VAD-fmk. Icaritin behandling inducerede også ekspression af pro-apoptotisk protein Bax med et samtidigt fald i Bcl-2-ekspression. Endvidere icaritin inducerede langvarig phosphorylering af ekstracellulært signal-reguleret kinase1 /2 (MAPK /ERK1 /2) i Hec1A celler og U0126, en specifik MAP-kinase kinase (MEK1 /2) inhibitor, blokerede ERK1 /2-aktivering ved icaritin og afskaffet den icaritin-induceret vækstinhibering og apoptose. Vores resultater viste, at icaritin induceret vedvarende ERK 1/2 aktivering og hæmmet vækst for endometriecancer Hec1A celler, og forudsat en rationelt for præklinisk og klinisk evaluering af icaritin for endometriecancer terapi

Henvisning:. Tong JS, Zhang QH Huang X, Fu XQ, Qi ST, Wang YP, et al. (2011) Icaritin Årsager Vedvarende ERK1 /2 Aktivering og fremkalder apoptose i Human endometriecancer Cells. PLoS ONE 6 (3): e16781. doi: 10,1371 /journal.pone.0016781

Redaktør: Syed Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: 8. december 2010; Accepteret: 14 januar 2011; Udgivet: 8 mar 2011

Copyright: © 2011 Tong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Major State Basic Research Program for Kina til QY Sun (2011CB94451). Dette arbejde blev også støttet af NIH tilskud DK070016 til Z. Y. Wang og de Nebraska Tobak Settlement Biomedical Research Program Awards (LB-595 og LB692) til Z. Y. Wang. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer er en af ​​de mest almindelige kvindelige bækken maligniteter og er den fjerde mest almindelige form for kræft i Nordamerikanske kvinder bag lunge-, bryst- og tyktarmskræft, med 42,160 nye tilfælde og 7,780 dødsfald anslået for 2009 [ ,,,0],1], [2], [3]. Omkring 81,500 kvinder rammes hvert år i Den Europæiske Union, og forekomsten er stigende. Median alder for forekomst er 63 år, mens 90% af kvinderne er ældre end 50 [4]. Selv patienter diagnosticeret med og behandlet for tidligt-sygdom i endometrioide histologi nyde forholdsvis gode overlevelsesrater, patienter med fremskreden (stadium III eller IV, i henhold til den nyligt reviderede system af International Federation of Gynækologi og obstetrik [FIGO]) eller tilbagevendende endometriecancer har en dårlig prognose [5]. For de kvinder med tidlige fase sygdom, kirurgi med individualiseret brug af volumen rettet strålebehandling er helbredende [6]. For de kvinder med fremskreden sygdom, er der ingen reel standard for pleje og traditionelt disse kvinder behandles med kirurgi, kemoterapi og stråling i en eller flere kombinationer. I indstillingen af ​​fremskreden eller recidiverende sygdom, især når det ikke er muligt at foretage en kirurgisk resektion, er kendetegnende for terapi været kemoterapi [7]. Selv om mange patienter i begyndelsen reagere på kemoterapi, modstand og tumor tilbagefald i sidste ende udvikle [5]. Det er således vigtigt at udvikle nye terapeutiske midler til effektivt at behandle denne dødelige sygdom.

Icaritin (fig. 1A) er et hydrolytisk produkt af icariin fra

Epimedium

, en traditionel kinesisk urtemedicin. Icaritin udviser mange farmakologiske og biologiske aktiviteter, såsom stimulering af neuronal og hjertedifferentiering [8], [9], forbedring af osteoblast og undertrykt osteoklastisk differentiering og aktivitet [10], forebyggelse af steroid-associeret osteonekrose [11], inhibering af human prostatacarcinom PC-3 cellevækst [12], induktion af human prostata glatte muskelceller apoptose via ERK1 /2-vejen [13], og neurobeskyttende virkninger [14]. Tidligere blev det rapporteret, at icaritin udviser østrogen-lignende aktivitet i østrogen receptor-positiv brystkræft MCF-7 celler ved sub-mikromolære koncentrationer [15]. Ved mikromolære område imidlertid icaritin hæmmet vækst af prostatacancer PC-3-celler [12]. Disse resultater indikerede, at icaritin har både agonist og antagonist-aktiviteter, afhængigt af koncentrationer og kan fungere som en østrogenreceptormodulator at regulere cellevækst. Men der er ingen rapporter om aktivitet icaritin mod endometriecancer.

(A) Den kemiske struktur af icaritin. (B) Virkninger af icaritin på vækstinhibering af Hec1A celler. Celler blev holdt i phenolrødt-frit medium med 2,5% trækul-strippet føtalt serum i 24 timer, og derefter behandlet med den angivne koncentration af icaritin. Celler blev høstet på forskellige tidspunkter som den angivne og proliferation potentiale blev vurderet ved MTT-assayet. Resultater af otte uafhængige forsøg blev beregnet og middelværdi ± SEM. *,

P

. 0,05 sammenlignet med kontrol celler

mitogenaktiveret protein (MAP) kinaser deltager i diverse cellulære funktioner, såsom celleproliferation, celledifferentiering, celle motilitet, og celledød [16]. Der er tre store MAPK familie undergrupper: ekstracellulært signal-reguleret kinase1 /2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal af stress-aktiveret protein kinases1 /2 (JNK1 /2) og p38 proteinkinaser. De signaleringskaskader involverer JNK og p38, aktiveres af ekstracellulære stresssignaler, er involveret i celledifferentiering og apoptose [17], [18]. Tidligere undersøgelser har vist, at forbigående aktivering af ERK1 /2 spiller en afgørende rolle i celleproliferation og at vedvarende ERK1 /2-aktivering inducerer cellecyklusstandsning og differentiering [19], [20]. I den foreliggende undersøgelse viste vi her, at aktivering af ERK1 /2 signalvejen medierer icaritin-induceret apoptose af Hec1A celler.

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at icaritin udløste en mitokondrie-medieret Hec1A celler apoptose og vedvarende aktivering af MAPK /ERK1 /2-vejen. Vores resultater foreslog, at icaritin kunne være nyttigt som et middel mod cancer i endometriecancer terapi.

Resultater

Icaritin hæmmer væksten for endometriecancer Hec1A celler

Tidligere blev det rapporteret icaritin potent hæmmet vækst af prostatakræft PC-3 celler, brystkræftceller og hepatoma HepG2-celler [12], [15], [21]. Vi besluttede at undersøge effekten af ​​icaritin på vækst af endometrie Hec1A celler. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af icaritin i 12 timer, 24 timer og 48 timer, og cellevækst blev målt med MTT-assayet. Vi fandt, at der var en dosisafhængig og tidsafhængig reduktion af væksten af ​​Hec1A celler behandlet med icaritin (fig. 1B), hvilket indikerer, at icaritin inhiberer proliferation af Hec1A celler.

For at sondere underliggende mekanisme icaritin -induceret cellecyklusstop blev større G1-fasen regulatorer, såsom cyclin D1 /CDK4 og cyclin-afhængige kinaseinhibitorer WAF1 /p21 og KIP1 /p27 undersøgt. Som vist i fig. 2A, icaritin behandling resulterede i et markant fald af ekspressionsniveauerne af cyclin D1 og cdk4 og forøgelse af WAF1 /p21 og KIP1 /p27-ekspression sammenlignet med celler behandlet med vehikel (fig. 2B). Disse data viste, at icaritin var i stand til at inducere cellecyklusstandsning og regulere cyklus-relaterede effektorer.

(A) Hec1A celler blev behandlet med den angivne koncentration af icaritin i 24 timer. Niveauerne af cyclin D1 og cdk4 blev bestemt ved Western blot. Proteinniveauer af β-actin blev også målt som kontroller. (B) Hec1A celler blev behandlet med den angivne koncentration af icaritin i 24 timer. Niveauerne af p21 og p27 blev bestemt ved Western blot. Protein niveauer af β-actin blev også målt som kontroller.

Icaritin inducerer Hec1A celler apoptose

Vi næste test, om icaritin også inducerer apoptotisk celledød i humane endometriecancer Hec1A celler. Hec1A celler blev behandlet med icaritin og apoptose blev analyseret ved to forskellige metoder. Som vist i fig. 3A, antallet af TUNEL-positive celler steg med forøgede koncentrationer af icaritin. Nukleosom fragmentering, en indikator for apoptose, bestemt med celledøden Detection ELISA bekræftede yderligere, at icaritin induceret celle apoptose ved en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 3B). Desuden er en annexin V-farvning viste også, at icaritin induceret apoptotisk celledød men ikke nekrose i Hec1A celler (Fig. 3C).

(A) Visualisering af apoptotiske celler ved TUNEL assay på Hec1A celler. (B) DNA-fragmentering blev evalueret under anvendelse af en Celledød Detection ELISA kit. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af tre separate forsøg. *,

P

0,05 sammenlignet med kontrol celler. (C) Den apoptotiske status blev bestemt ved Annexin V /PI-farvning metode. Procentdele af negativ (levedygtige) celler, annexin V-positive (tidlig apoptotisk) celler, PI-positive (nekrotiske) celler eller annexin V og PI dobbelt-positive (sent apoptotiske) celler blev vist (gennemsnit af tre uafhængige forsøg) ved en flowcytometrianalyse.

dosis- og tidsafhængige virkninger af icaritin på den proteolytiske aktivering af caspase-3 og caspase-9 blev også undersøgt. Som vist i fig. 4A, icaritin behandling resulterede i en signifikant stigning i den aktive form af caspase-3 og caspase-9 i Hec1A celler. Aktiveringen af ​​caspaser i icaritin behandlet Hec1A celler blev yderligere bekræftet ved at detektere spaltning af PARP, et endogent substrat af aktiveret caspase-3 og et kendetegn for apoptose. Som vist i fig. 4B, behandling af Hec1A celler med icaritin resulterede i spaltning af PARP til en 85 kDa fragment. Derudover undersøgte vi subcellulære lokalisering af cytochrom c til at bestemme, om mitokondrierne pathway er involveret i icaritin-induceret apoptose. Immunofluorescens af cytochrom c blev visualiseret med et konfokalt laser mikroskop. Efter celler blev behandlet med 10 pM icaritin i 24 timer, farvningen mønster af cytochrom c blev diffus og sløret (fig. 4C) i modsætning til den kompakte, plaque-lignende udseende af cytochrom c i kontrolcellerne behandlet med bærer, der angiver frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier i cytosolen i icaritin-behandlede celler.

(A) Hec1A celler blev behandlet med den angivne icaritin koncentration eller de angivne tidspunkter, blev de samlede celleekstrakter fremstillet og underkastet Western blot assay kan måle niveauet af spaltet-caspase-3 og spaltes-caspase-9. Proteinniveauer af β-actin blev også målt som kontroller. (B) Hec1A celler blev behandlet med den angivne icaritin koncentration eller de angivne tidspunkter, blev de samlede celleekstrakter fremstillet og underkastet Western blot-assay under anvendelse af antistoffer mod PARP. Proteinniveauer af β-actin blev også målt som kontroller. (C) Hec1A celler blev fikseret og mærket for cytochrom c (rød) og DNA (blå). (D) Hec1A celler blev forbehandlet med 10 uM z-VAD-fmk i 1 time, efterfulgt med 10 pM icaritin i 24 timer, og DNA-fragmentering og caspase-3-aktivitet blev bestemt. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af tre separate forsøg. *,

P

0,05 sammenlignet med kontrol celler. (E) Hec1A celler blev forbehandlet med 10 uM z-VAD-fmk i 1 time, efterfulgt med 10 pM icaritin i 24 timer. Proteinekstrakter blev fremstillet og underkastet Western blot-assay under anvendelse af antistof mod PARP. Protein niveauer af β-actin blev også målt som kontroller.

For yderligere at fastlægge den rolle, caspase aktivering i icaritin-induceret apoptose, vi behandlede Hec1A celler med den pan-caspaseinhibitoren z-VAD-fmk (10 uM), før icaritin behandling. Det fælleseuropæiske caspaseinhibitor z-VAD-fmk forbehandling ophævede caspase-3-aktivitet og reduceret icaritin apoptose som målt ved nukleosom fragmentering i Hec1A celler (Fig 4D . E). Disse resultater antyder kraftigt, at aktivering af caspasekaskaden var afgørende for icaritin-induceret apoptose i Hec1A celler.

Icaritin regulerer ekspressionen af ​​Bcl-2-familien proteiner i Hec1A celler

anti-apoptotiske bcl-2 er et potent antagonist af det mitokondrielle pathway af apoptose indledes af en række ekstra- og intracellulære belastninger. Vi besluttede at afprøve virkningerne af icaritin på ekspressionen af ​​anti-apoptotiske protein Bcl-2, og de pro-apoptotiske proteiner Bax i Hec1A celler med Western blot-analysen. Som vist i fig. 5, icaritin forøget i niveauerne af Bax ekspression mens reduceret Bcl-2-ekspression ved en dosis- og tidsafhængig måde, hvilket indikerer, at icaritin også regulerer ekspressionsniveauer fra Bcl-2-familien proteiner til at lette apoptotisk celledød induceret af icaritin.

(A) Hec1A celler blev behandlet med den angivne koncentration af icaritin samlede celleekstrakter blev fremstillet og underkastet Western blot-assay til at måle niveauer af Bcl-2 og Bax. Proteinniveauer af β-actin blev også målt som kontroller. (B) Hec1A celler blev behandlet med de angivne icaritin tidspunkter af icaritin, blev de samlede celleekstrakter fremstillet og underkastet Western blot-assay til at måle niveauer af Bcl-2 og Bax. Protein niveauer af β-actin blev også målt som kontroller.

Icaritin inducerer vedvarende ERK1 /2-aktivering i Hec1A celler

Cellular spændinger og stimuli inducerer celle apoptose via vedvarende aktivering af MAPK signalveje [22], [23]. Vi undersøgte således aktiveringen af ​​MAPK’er ERK1 /2, JNK og p38 efter icaritin behandling. Som vist i fig. 6A, blev phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2 steget efter icaritin behandling, som varer fireogtyve timer. Der blev dog ikke observeret nogen signifikante ændringer i udtryk og phosphoryleringsbegivenheder niveauer af p38 og JNK efter icaritin behandling (Fig 6B . C). Disse resultater antydede, at vedvarende aktivering af MAPK /ERK er involveret i icaritin-induceret vækstinhibering og apoptose i HecA1 celler.

Hec1A celler blev behandlet med den angivne icaritin koncentration eller den angivne interval, samlede celleekstrakter blev fremstillet og underkastet Western blot-assay til at måle niveauer af phosphorylerede former af ERK1 /2 (A), JNK (B) og p38 (C). Membraner blev testet igen med antistoffer mod total ERK1 /2, JNK og p38 til normalisering.

Den ERK1 /2 signalvejen er involveret i icaritin-induceret apoptose i Hec1A

Vi end undersøgte hvorvidt icaritin-inducerede langvarig aktivering af ERK1 /2 signalvejen spiller en rolle i vækstinhibering og apoptose. Som vist i fig. 7A B, icaritin induceret celle apoptose blev effektivt ophævet ved U0126, en potent inhibitor af MEK1 /2, men p38-inhibitoren SB203580 og JNK-inhibitor SP600125 havde ingen virkning, hvilket antyder, at aktiveringen af ​​ERK1 /2 signalering er involveret icaritin apoptose. Tilsvarende kunne ERK1 /2-inhibering ved sin særlige inhibitor effektivt antagoniserer icaritin-induceret caspase-3-aktivitet (fig. 7C). Desuden Western blot-assay viste, at U0126 inhiberede vedvarende ERK1 /2-aktivering og spaltning af PARP i icaritin behandlede (fig. 7D), mens caspaseinhibitoren z-VAD-fmk havde ingen virkning på icaritin-induceret aktivering af ERK1 /2 (fig . 7E). Disse resultater viste, at de pro-apoptotiske virkninger af icaritin i Hec1A celler medieres ved en vedvarende aktivering af ERK1 /2 signalvej.

(A) Hec1A celler blev behandlet med icaritin i nærvær eller fravær af 10 pM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer, blev cellevæksten bestemt ved MTT. Bjælkerne repræsenterer middelværdien ± SEM af tre separate forsøg. *,

P

0,05 sammenlignet for icaritin-behandlede gruppe. (B) Hec1A celler blev behandlet med icaritin i nærvær eller fravær af 10 uM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer, og DNA-fragmentering blev bestemt. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af tre separate forsøg. *,

P Salg 0,05 sammenlignet med icaritin-behandlede celler. (C) Hec1A celler blev behandlet med icaritin i nærvær eller fravær af 10 uM U0126, 10 uM SP600125, eller 40 uM SB203580 i 24 timer, og caspase-3-aktivitet blev bestemt ved caspase-Glo assay. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af tre separate forsøg. *,

P Salg 0,05 sammenlignet med icaritin-behandlede celler. (D) Hec1A celler blev forbehandlet eller ikke forbehandlet med 10 um U0126 derefter tilsat med DMSO (vehikel) eller 10 pM icaritin i 12 timer, 24 timer hhv. Proteinekstrakter blev fremstillet og underkastet Western blot-assay kan måle niveauet af phosphoryleret ERK1 /2. Proteinniveauer af ERK1 /2 blev også målt som kontroller. (E) Hec1A celler blev forbehandlet eller ikke forbehandlet med 10 um U0126 derefter tilsat med DMSO (vehikel) eller 10 pM icaritin i 12 timer, 24 timer hhv. Proteinekstrakter blev fremstillet og spaltningen af ​​PARP blev analyseret med Western bolt. Proteinniveauer af β-actin blev også målt som kontroller. (F) Hec1A Celler blev forbehandlet med eller uden z-VAD-fmk (10 uM) blev yderligere inkuberet med 10 pM icaritin i 24 timer. Proteinekstrakter blev fremstillet og underkastet Western blot-assay kan måle niveauet af phosphoryleret ERK1 /2. Protein niveauer af ERK1 /2 blev også målt som kontroller.

Diskussion

Her har vi vist, at icaritin en forbindelse oprenset fra lægeurt Epimedium, inducerer væksthæmning og apoptotisk celledød i humane endometriecancer Hec1A celler i en dosis og tidsafhængig måde.

det er velkendt, at cellecyklusprogression er dynamisk og strengt reguleret af komplekser indeholdende cdk’er og cycliner som alle er kritiske for den normale progression af celle cyklus og inaktivering af disse proteiner fører til standsning af cellecyklus [24], [25], [26]. De observerede inhibitoriske virkninger af icaritin på ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4 i Hec1A celler antydede, at icaritin kan standse cellecyklussen ved en specifik fase. CDK-aktivitet er også reguleret af CDK-inhibitorer, såsom WAF1 /p21 og KIP1 /P27 familier af proteiner. Her viste vi også, at icaritin inducerede ekspressionsniveauerne af den WAF1 /p21 og KIP1 /p27.

I mange celletyper, er apoptose kendetegnet ved genereringen af ​​DNA-fragmenter gennem virkningen af ​​endogene endonukleaser [27] , [28]. DNA’et af apoptotiske celler spaltes til multimerer af 180-200 bp fragmenter, svarende til oligonucleosomal størrelse. Derfor DNA’et af apoptotiske celler migrerer typisk som en stige af 180-200 bp multimerer på en agarosegel. Terminal deoxynucleotidy Transferase Biotin-dUTP Nick endemærkning (TUNEL) metode identificerer apoptotiske celler in situ ved anvendelse af terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT) til at overføre biotin-dUTP til disse strengbrud af spaltet DNA [29]. ELISA-assayet bestemmelse af de cytoplasmatiske histon-associerede DNA-fragmenter (mono- og oligonucleosomes) efter induceret celledød [30]. Annexin V anvendes til kvantitativt at bestemme procentdelen af ​​celler i en population, der aktivt undergår apoptose. Den er afhængig af ejendom celler til at miste membran asymmetri i de tidlige faser af apoptose. I apoptotiske celler er membranen phospholipid phosphatidylserin (PS) translokeres fra indre blad af plasmamembranen til den ydre folder og derved udsætte PS til det eksterne miljø. Annexin V er en calcium-afhængig phospholipid-bindende protein, som har en høj affinitet for PS, og er nyttig til at identificere apoptotiske celler med blotlagt PS. Propidiumiodid (PI) er en standard flowcytometrisk levedygtighed sonde og anvendes til at skelne levedygtige fra ikke-levedygtige celler. Levedygtige celler med intakte membraner udelukker PI, mens membraner af døde og beskadigede celler er gennemtrængelig for PI. Celler, der betragtes levedygtige er annexin V og PI negativ; celler, som er i begyndelsen af ​​apoptose er annexin V positive og PI negativ; celler, der er i slutningen af ​​apoptose er både annexin V og PI positive; og celler, der er i nekrotiske er annexin V negative og PI negative [31]. Annexin V /PI-farvning metode skelner apoptose celler og nekrose celler. I den foreliggende undersøgelse blev Hec1A celler behandlet med icaritin og apoptose blev analyseret ved anvendelse af TUNEL og ELISA-assay. Desuden en annexin V-bindende assay viste, at icaritin behandling induceret apoptose men ikke nekrose i Hec1A celler.

Mitokondrier spille en central rolle i signaltransduktion af apoptose [32]. Observationen af ​​icaritin-medieret aktivering af caspase-9, caspase-3, efterfølgende spaltning af PARP og frigivelse af cytochrom c, samt det resultat, at pan-caspaseinhibitor z-VED-FMK næsten fuldstændigt blokeret icaritin-induceret apoptose i Hec1A celler, hvilket antyder, at mitochondrial-medieret caspasekaskaden pathway spiller en meget vigtig rolle i icaritin apoptose [33].

Bcl-2-familien af ​​proteiner, herunder Bcl-2 og Bcl-2-beslægtede familiemedlemmer såsom Bd-xL, Bad og Bax, spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​apoptose. De kan aktivere eller inhibere frigivelsen af ​​downstream faktorer såsom cytochrom c, som fører til aktivering af caspase-3 og PARP i udførelsen af ​​apoptose [34]. Bax udøver pro-apoptotisk aktivitet ved translokation fra cytosolen til mitokondrierne, hvor den inducerer cytochrom c-frigivelse, mens Bcl-2 udøver sin anti-apoptotisk aktivitet, i det mindste delvist, ved at hæmme translokationen af ​​Bax til mitokondrierne [35] . Det er klart, at forholdet mellem pro- og anti-apoptotisk protein ekspression, såsom Bax /Bcl-2, er kritisk for induktion af apoptose, og den beslutter modtageligheden af ​​celler til at undergå apoptose [36]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at behandling af Hec1A celler med icaritin medførte signifikant fald i Bcl-2-proteinet og forøgelse af Bax-proteinet, således at forskyde Bax /Bcl-2-forhold til fordel for apoptose. Tilsammen vores resultater indikerede, at icaritin regulerer ekspressionsniveauer fra Bcl-2-familien, inducerer cytochrom c-frigivelse og trigs caspase-afhængig celle apoptotisk død.

Familien af ​​MAPK’er, ERK, SAPK /JNK1 /2 og p38, spiller centrale roller i celleproliferation, differentiering, overlevelse og apoptose, herunder ekstracellulær-reguleret kinase1 /2 [37], [38]. Generelt transient ERK1 /2-aktivering sker hurtigt og nedgang med 30-45 min, hvilket anses for at føre til celleproliferation og overlevelse [39], men vedvarende eller langvarig ERK1 /2-aktivering, der varer mere end 12 timer er involveret i celle differentiering og død [40], [41], [42], [43]. Den dobbelte aktiviteter ERK1 /2 i både celledeling og celledød kan forklares ved flere nylige fund, der viser, at phosphorylerede ERK’er kan producere forskellige resultater, afhængig af varigheden af ​​ERK ophobning i kernen [44], [45]. For nylig er det blevet rapporteret, at vedvarende ERK-aktivering var involveret i calcium-induceret apoptose af linseepitelceller [46]. Flere undersøgelser har vist, at icaritin inducerer aktivering af ERK og p38-kinase i embryonale stamceller og neuronale celler [8], [14]. Chen et al. rapporterede, at icaritin inducerer vækstinhibering og apoptose af human prostatacancer PC-3-celler gennem ERK1 /2 signalvej [13]. Her fandt vi også, at icaritin inducerede langvarig aktivering af ERK1 /2, men ikke JNK og p38 i Hec1A celler. U0126, en specifik inhibitor af MEK (MAPK /ERK-kinase), blokeres effektivt icaritin-induceret ERK1 /2-aktivering og svækket icaritin-induceret apoptose, hvilket tyder på, at den vedvarende aktivering af ERK1 /2 signalvej er en af ​​de mekanismer.

som konklusion, fandt vi, at icaritin hæmmede cellevækst og induceret celle apoptose i Hec1A celler. Vi undersøgte også de underliggende mekanismer, der er involveret i icaritin-induceret apoptose. Vores resultater viste, at icaritin-induceret celievækstinhiberingen indebærer reduktioner af cyclin D1 og cdk4 proteinekspression og induktioner af p21 og p27 protein udtryk. Vores resultater viste også, at icaritin apoptose involverer aktivering af caspase-3 og caspase-9 og frigivelse af cytochrom c. Vi fandt, at vedvarende ERK1 /2-aktivering var nødvendig for icaritin-induceret apoptose. Vores resultater forudsat en rationel at icaritin kunne udvikles som en potentiel anticancermiddel mod human endometriecancer.

Materialer og metoder

Materialer og reagenser

Icaritin med en renhed på op til 99,5% var fra Dr. Kun Meng (shenogen Pharma Co Beijing, Kina). En stamopløsning (10 uM) blev fremstillet ved opløsning icaritin i DMSO (Sigma, St. Louis, MO, USA) og opbevaret ved -20 ° C. MTT, DAPI, U0126, SP600125, SB203580, og pan-caspaseinhibitor (z-VAD-fmk) blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). Antistof til kløvet caspase-3 blev erhvervet fra Cell Signaling (Beverly, MA). Antistoffer mod ERK1 /2, phospho-ERK1 /2, p38, phospho-p38, JNK, phospho-JNK, p21, p27, cytochrom c, Bcl-2, Bax, spaltet caspase-9, cyclin D1, cdk4, PARP og β actin blev købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). FITC Annexin V Apoptose Detection Kit jeg blev købt fra Becton Dickinson (PharMingen).

Celler kultur og celledeling essay

Den menneskelige endometriecancer cellelinje Hec1A blev opnået fra Dr. Li-Hui Wei (Peking University Folkets Hospital, Beijing) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Gibco-BRL, USA) medium med 10% føtalt kalveserum (Hyclone, UT), 5 ug /ml insulin, og holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Medier vil blive ændret i phenolrødt-frit medium med 2,5% trækul-strippet føtalt kalveserum i 24 timer før forsøg er nødvendige.

Celler blev podet i en 96-brønds skål til en slutkoncentration på 1 x 10

4 celler /brønd og inkuberet i DMEM medium indeholdende 10% FCS i 24 timer. Derefter Celler blev dyrket i phenol-rød-fri DMEM (Gibcol-BRL, USA) med 2,5% trækul-strippet føtalt kalveserum (Biochrom AG, Tyskland) efterfulgt af behandling med forskellige koncentrationer af icaritin i 12 timer, 24 timer og 48 h. Mediet blev fjernet og frisk medium blev tilsat til hver brønd sammen med 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml). Efter 4 timers inkubation blev 150 pi DMSO tilsat til hver brønd. Pladerne blev aflæst ved bølgelængde på 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Bioteck Powerwave

TM, USA). Otte reduplicate brønde blev anvendt til hver behandling, og forsøg blev gentaget tre gange.

Western blot-analyse

Western blot blev udført som tidligere beskrevet [47], [48]. Celler blev behandlet med den angivne koncentration af icaritin i den angivne tid i phenol-rød-fri DMEM (Gibcol-BRL, USA) med 2,5% trækul-strippet føtalt kalveserum (Biochrom AG, Tyskland). Cellerne blev opsamlet i iskold PBS, og celleekstrakterne blev fremstillet i RIPA-puffer med proteinase inhibitor cocktail fra Sigma (St.Louis, MO). Proteinkoncentrationerne af cellelysaterne blev bestemt og kogt med gel-ladningsbuffer i 10 minutter ved 100 ° C. Prøver indeholdende 30 ug totalt protein blev elektroforesebehandlet på 10% SDS-polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membran (Millipore, Temecula, CA). Efter overførsel blev membranen blokeret i TBST (TBS indeholdende 0,1% Tween 20) indeholdende 5% skummetmælk i 2 timer, efterfulgt af inkubation natten over ved 4 ° C med passende primære antistoffer. Efter vask tre gange i TBST, blev membranerne inkuberet i 1 time ved 37 ° C med 1:2000 peberrodsperoxidasekonjugeret passende sekundære antistoffer. Endelig blev membranerne visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens påvisningssystem (Amersham, Piscataway, NJ).

TUNEL Assay

Potentiel DNA-fragmentering blev undersøgt med fluorescens-farvning ved TUNEL (terminal transferase dUTP Nick End Mærkning) apoptose afsløring kit (Beyotime Biotech, Kina) efter producentens anvisninger. Kort fortalt blev celler dyrket på sterile glas coverlips fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter, og derefter permeabiliseret med 0,4% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med en reaktionsblanding indeholdende biotin-dUTP og terminalen deoxynucleotidyltransferase (TdT) i 60 minutter og derefter med avidin-FITC-opløsning i 30 minutter i mørke. DAPI blev efterfølgende sat til nuklear farvning. Mikroskopisk analyse blev udført ved anvendelse af et konfokalt laser-scanning-mikroskop (Zeiss LSM 710 META, Tyskland).

Apoptose Detektion af celledød Enzyme-Linked immunabsorbentassay Metode

I ELISA, cellerne udsået i 96-brønds plader (1 × 10

4 celler /brønd) blev behandlet med icaritin, derefter apoptotiske celler blev evalueret ved anvendelse af celledød Detection ELISA-kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens anvisninger. Fotometrisk enzymimmunoassay blev anvendt til kvantitativt at bestemme dannelsen af ​​cytoplasmatiske histon-associerede DNA-fragmenter i form af mononucleosomes efter apoptose af cellerne. Absorbans ved 405 nm blev målt som indikator for apoptotiske celler. Henvisningen bølgelængde var 490 nm. Den berigelse faktor (samlede apoptose) blev beregnet ved at dividere absorbansen af ​​prøven (A405 nm) ved absorbansen af ​​kontrollerne uden behandling (A490 nm).

Annexin V /PI analyser for apoptose

for Annexin V /PI assays blev celler farvet med Annexin V-FITC og PI, og vurderet for apoptose ved flowcytometri ifølge fabrikantens protokol (BD PharMingen, San Diego, CA, USA). Kort fortalt, 1 x 10

6 celler blev vasket to gange med PBS og farvet med 5 pi Annexin V-FITC og 10 pi PI (5 ug /ml) i 1 ml bindende buffer i 15 minutter ved stuetemperatur i mørk. De apoptotiske celler blev bestemt under anvendelse af et Becton-Dickinson FACScan cytoflurometer (Mansfield, MA, USA).

Immunfluorescensfarvning

Immunfluorescensfarvning blev anvendt til at analysere den subcellulære fordeling af cytochrom c i Hec1A celler induceret af Icaritin. Celler dyrket på sterile glas coverlips blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Efter permeabiliseret med 0,4% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur blev cellerne blokeret i 4% BSA-suppleret PBS i 1 time og inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-cytochrom c-antistof. Efter vask tre gange i PBS, blev cellerne mærket med TRITC-konjugeret sekundært antistof. DAPI blev efterfølgende sat til nuklear farvning.