PLoS ONE: epidermal vækstfaktor-lignende domæne-holdigt protein 7 (EGFL7) Forbedrer EGF receptor-AKT Signaling, Epithelial-Mesenchymale Transition, og Metastase af Gastric Cancer Cells

Abstrakt

epidermal vækstfaktor-lignende domæne holdig protein 7 (EGFL7) opreguleres i humane epiteliale tumorer og så er en potentiel biomarkør for malignitet. Faktisk har tidligere undersøgelser vist, at høj EGFL7 ekspression fremmer infiltration og metastase af gastrisk karcinom. Den epitel-mesenkymale overgang (EMT) indleder den metastatiske kaskade og forlener kræftceller med invasiv og vandrende kapacitet; dog er det ikke kendt, hvis EGFL7 fremmer metastase ved at udløse EMT. Vi fandt, at EGFL7 blev overudtrykt i flere humane gastrisk cancer (GC) cellelinier og at overekspression fremmet celle invasion og migration som afsløret ved scratch såret og Transwell migration assays. Omvendt shRNA-medieret EGFL7 knockdown reduceret invasion og migration. Endvidere EGFL7-overudtrykker celler voksede til større tumorer og var mere tilbøjelige til at metastasere til leveren sammenlignet med underexpressing CG-celler efter subkutan injektion i mus. EGFL7 overekspression beskyttet GC cellelinjer mod anoikis, hvilket giver en plausibel mekanisme for denne forbedrede metastatisk kapacitet. I udskårne humane gastriske tumorer, blev ekspression af EGFL7 positivt korreleret med ekspressionsniveauer af mesenkymale markør vimentin og EMT-associerede transkription repressor sneglen, og negativt korreleret med ekspression af epitelcelle markør E-cadherin. I GC cellelinjer, EGFL7 knockdown vendt morfologiske tegn på EMT og faldt både vimentin og Snail udtryk. Desuden EGFL7 overekspression fremmes EGF-receptor (EGFR) og proteinkinase B (AKT) phospho-aktivering, effekter markant undertrykt af EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren AG1478. Desuden AG1478 reducerede også den forhøjede invasive og vandrende kapacitet GC cellelinjer overekspression EGFL7. Kollektivt, disse resultater antyder kraftigt, at EGFL7 fremmer metastase ved at aktivere EMT gennem en EGFR-AKT-Snail signalvejen. Afbrydelse af EGFL7-EGFR-AKT-Snail signalering kan en lovende terapeutisk strategi til mavekræft

Henvisning:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) epidermal vækstfaktor-lignende domæne-holdigt protein 7 (EGFL7) Forbedrer EGF receptor-AKT Signaling, Epithelial-Mesenchymale Transition, og Metastase af Gastric Cancer Cells. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922

Redaktør: Claudia D. Andl, Vanderbilt University, USA

Modtaget: November 15, 2013; Accepteret: 19 maj 2014; Udgivet: 19 Jun 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.001.080) og Open-End fonden for værdifulde og Precision instrumenter for Central South University (nr JJ3121). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige ondartet svulst og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1], [2]. Cirka halvdelen af ​​alle GC tilfælde forekommer i østasiatiske lande, med særligt høje forekomster i Japan, Korea og Kina [3], [4]. Fremskridt i den systemiske behandling af GC har i høj grad øget overlevelse på kort sigt; Men de fem-års overlevelse på GC patienter fortsat er lav på grund af tilbagefald og metastaser [5]. Desuden er de fleste nydiagnosticerede GC patienter viser allerede metastatisk sygdom, som udgør en stor terapeutisk udfordring for onkologer [6].

epidermal vækstfaktor-lignende domæne-holdigt protein 7 (EGFL7), også kendt som vaskulær endotel statin , er et endotelcelle-afledt udskilte faktor, der regulerer vaskulær rør-dannelse. Parker et al. [7] viste, at EGFL7 er afgørende for angiogenese under zebrafisk embryogenese [8]. Nylige undersøgelser har rapporteret forhøjede ekspression af EGFL7 i flere tumorer og cancercellelinjer, herunder nyre tumorer, maligne gliomer, hepatocellulære carcinomer og tyktarmskræft [7] – [10]. Vi har tidligere vist, at EGFL7 også er overudtrykt i gastrisk karcinom [11], og udtryk var signifikant korreleret med patologiske karakteristika, klinisk progression, dårlig prognose, og metastase [10], [12]. Derfor EGFL7 er en kandidat prædiktiv faktor for kræft progression og metastase. Men mekanismerne bag de tumorgene virkninger af EGFL7 er uklare.

Metastase er en multi-trins proces, der involverer en epitelial-mesenchymal overgang (EMT), hvori polariseret epitelceller omdannes til mesenchymal-celler [13], en fænotype med større invasive og vandrende kapacitet [14]. EMT er også en reversibel proces, der ofte forekommer ved den invasive foran mange metastatiske cancere [15]. Flere undersøgelser har vist, at EGF fremmer kræft cellemigration og invasion samtidig med aktivering af EMT [16] – [18]. Betydeligt, EGFL7 indeholder to EGF-lignende domæner, hvilket tyder på en vis funktionel homologi [9], [12]. Men om EGFL7 faktisk gør forbedre EMT og fremme mavekræft metastaser er endnu ikke fastlagt. Desuden er de molekylære mekanismer, ved hvilke EMT reguleres i GC forbliver stort set ukendt. Zinkfinger transskriptionsrepressor sneglen er kritisk for genekspression omprogrammering under EMT, navnlig til undertrykkelse af celle-celle-adhæsion protein endotel (E) -cadherin, er tabet af hvilket betragtes som en vigtig tidlig begivenhed i EMT og nødvendigt til efterfølgende metastase [ ,,,0],19].

Den foreliggende undersøgelse har til formål at afgøre, om EGFL7 fremmer metastase ved at udløse EMT. Vi fandt, at EGFL7 overekspression aktiverer EGFR-AKT vej, udløser EMT, og fremmer GC celleinvasion

in vitro

og metastase

in vivo

.

Materialer og metoder

patienter og Tissue Collection

Gastric karcinom væv blev opnået fra 79 GC patienter (58 mænd og 21 kvinder) behandlet med kirurgisk resektion ved Institut for Kirurgi, Xiangya Hospital, Central South University (Kina). Kirurgiske indgreb blev gennemført fra Jan 2010 til december 2012. Patienterne var 54,7 år i gennemsnit (interval: 28 til 82 år). Og modtog hverken kemoterapi eller strålebehandling inden operationen

Patienterne blev informeret om, at kirurgiske prøver ville anvendes til konventionel patologisk diagnose og at de resterende væv kunne anvendes til forskning. Ingen personlige patientdata var påkrævet for denne undersøgelse, og de protokoller, foretaget nogen risiko, så kun verbal informeret samtykke var påkrævet fra patienterne. Protokollen blev godkendt af den etiske komité i Xiangya Hospital, Central South University (Permit nummer: 201.311.389).

Sygdom iscenesættelse blev defineret i henhold til den sjette udgave af TNM af amerikanske Blandede kræft [ ,,,0],20], [21]. De tumorer var godt differentieret gastrisk adenocarcinom i 12 tilfælde, moderat differentieret i 34 tilfælde, og dårligt differentieret i 33 tilfælde. Alle prøver blev straks fikseret med 10% formalin, dehydreret, og paraffinindlejret. Præcise kliniske oplysninger og patologisk diagnose var tilgængelige for alle patienter.

Immunhistokemi

For immunhistokemi blev udarbejdet prøver inkuberet ved 60 ° C i 15 timer og skæres i 4 um-tykke sektioner, afparaffineres i terpentin, tørret og rehydreret i en faldende ethanol: destilleret vand gradient. Endogen peroxidaseaktivitet blev inaktiveret ved inkubation i 30 minutter i 0,3% hydrogenperoxid i 0,01 M phosphatbufret saltvand (PBS). Skiver blev derefter inkuberet i 15-20 min i citratpuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i antigen-genvinding, blokeret med 5% normalt gedeserum i 0,01 M PBS i 15 minutter ved 37 ° C og inkuberet med primære antistoffer fortyndet i blokeringsopløsning natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. De følgende primære antistoffer blev anvendt: muse-anti-EGFL7 monoklonalt antistof (Abcam, USA, 1:400) og kanin-monoklonale antistoffer rejst mod E-cadherin (CST, USA, 1:1000), vimentin (CST, USA, 1:1000 ), Snail (Proteintech, USA, 1:1000), og CD34 (Boster, Kina, 1:500). Efter vask blev prøverne successivt inkuberet med biotinyleret sekundært antistof og streptavidin-peberrodsperoxidase (HRP) avidin arbejdsopløsning. Immunolabeling blev visualiseret ved hjælp af DAB substrat kit fra Zhongshan Golden Bridge Company (Kina) i henhold til producentens anbefalinger. Endelig blev snittene modfarvet med hematoxylin (Vector Laboratories, USA), dehydreret i en stigende ethanol: destilleret vand gradient, og monteret på objektglas under anvendelse Permount monterings medier (Fisher Scientific, USA)

Kvantificering af Immunohistokemiske signaler.

Alle GC og de omkringliggende ikke-neoplastiske gastriske væv blev bekræftet histopatologisk af to uafhængige patologer (K.-SW og J.-HL) blinde til den oprindelige diagnose. Immunfarvning blev gradueret ved en semi-kvantitativ metode, betragtes både intensiteten og distribution af farvningen [22]. Kort fortalt blev tilfældigt udvalgt fem områder under lav forstørrelse (100 ×, Olympus BX51, Tokyo, Japan), og 200 tumorceller talt fra hvert felt. Den farvningsintensitet blev scoret som følger: 0, ingen farvning; 1, svag gul farvning; 2, gul farvning; 3, brun farvning. Positive celler var karakteriseret ved en klar grænse og gul eller brun farvning forskellig fra baggrunden. Procentdelen af ​​positive celler (PP) blev scoret som følger: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. De to scoringer blev kombineret for at opnå følgende klassificering: negativ farvning, prøver med immunoreaktiv score (IRS) fra 0 til 2; svagt positiv farvning, prøver med IRS på 3 til 5; stærkt positiv farvning, prøver med IRS på 6 til 7. Prøver, der viste svagt og stærkt positiv farvning blev inkluderet i den statistiske analyse.

cellelinjer og Kultur

Menneskelig GC cellelinjer SGC7901 (moderat differentieret adenocarcinom), BGC823 (dårligt differentieret adenocarcinom), MKN28 (veldifferentieret adenocarcinom), og MKN45 (dårligt differentieret adenocarcinom) såvel som normale gastrisk mucosa epitel GES-1-celler blev købt fra Type Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler blev dyrket og opretholdt i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium (Gibco Biocult, Paisley, UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Short Hårnål RNA (shRNA) og rekombinant ekspressionsplasmidet Pex-2-EGFL7

For at generere cellelinjer overekspression eller underexpressing EGFL7, blev de native cellelinier stabilt transficeret med en ekspressionsvektor eller målrettet shRNA. De shRNA sekvenser af menneskelige EGFL7 blev designet i henhold til den menneskelige EGFL7 DNA-sekvens (GenBank NO NM_016215.3.) Af Designer 3,0 software (Genepharma, https://www.genepharma.com) og BLAST søgninger (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Målsekvenserne blev sammenlignet med det humane genom database BLAST-søgning for at sikre ingen høj homologi med andre kodende sekvenser. Sekvenserne EGFL7-homo-333 og EGFL7-homo-887 blev identificeret som målområder for en specifik EGFL7 shRNA. Derudover blev en uspecifik sekvens (scramble shRNA) udformet som en negativ kontrol, og GAPDH-sekvensen er designet som en intern kontrol. De shRNA sekvenser var som følger:

EGFL7-shRNA1 mod EGFL7-homo-333: fornuft, 5′-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 ‘; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 ‘; EGFL7-shRNA2 mod EGFL7-homo-887: sense, 5’-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 ‘; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 ‘; uspecifik sense, 5’-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 ‘; antisense, 5’-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 ‘; GAPDH sense, 5’-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 ‘; antisense, 5’-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 ‘. Den pGPU6 /GFP /Neo (grønt fluorescerende protein, neomycin) vektor (Genepharma Company, Shanghai, Kina) blev anvendt til plasmidkonstruktion. Nukleotiderne blev annealet og indsat i BamHI og HindIII sites og transformeret i DH5a-kompetente E. coli. Dual kanamycin /neomycin-resistente kolonier blev udvalgt og vektorsekvenserne bekræftet ved restriktionsspaltning og DNA-sekventering.

EGFL7 cDNA, der koder 533-1353 aminosyresekvens blev subklonet ind i en pEX-2 plasmidvektoren (Genepharma, Shanghai, Kina) ved BgIII /EcoRI dobbelt fordøjelse og betegnet pEX-2-EGFL7. Det rekombinante plasmid blev amplificeret i DH5a-kompetente E. coli og vektorsekvensen amplificeret ved PCR. DNA-sekventering bekræftede, at det rekombinante plasmid indeholdt en EGFL7 genfragment identisk med GenBank (GenBank NR. NM_016215.3). Kanamycin /neomycin-resistente kolonier blev selekteret og sekvensen bekræftet ved restriktionsfordøjelse og DNA-sekventering. Alle primere blev designet og syntetiseret af Genepharma (Shanghai, Kina).

stabil transfektion og G418 Selection

At etablere en EGFL7-underexpressing klon (og passende kontrol), BGC823 celler blev podet i seks brønds dyrkningsplader ved 1 x 10

6 /brønd og inkuberet i 24 timer i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS i en fugtig 5% CO

2 atmosfære holdt ved 37 ° C. Cellerne blev transficeret med 4 ug pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-uspecifikke-shRNA eller pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA anvendelse af lipofectamin 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet i G418 (Sigma, USA, 600 ug /ml) i første udvælgelse, fortyndet, udpladet ved lav densitet (ca. 1 celle /brønd) og opretholdt i dyrkningsmedium suppleret med G418 ved halv startkoncentrationen udvælgelse i yderligere 3 uger. De resulterende stabile cellelinier blev navngivet BGC2-13 (cellelinje som følge af pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabil transfektion) og BGC-NC, og udvidet til efterfølgende undersøgelser. Ekspressionsniveauet af EGFL7 blev vurderet ved Western blot og real-time RT-PCR. At etablere en overudtrykkende linje og matchet kontrol, MKN28 celler blev podet, transfekteret med 4 ug PEX-2-EGFL7 eller PEX-2 plasmider, og selekteres som beskrevet for BGC823 celler, bortset fra at 500 ug /ml G418 blev anvendt til initial udvælgelse. De resulterende stabile cellelinier blev navngivet MKN28-EGFL7 og MKN28-NC. Ekspressionsniveauerne af EGFL7 i G418-resistente kloner blev evalueret ved Western blot og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR).

Western blot-analyse

Efter cellerne nåede 80% -95% konfluens, blev samlet protein ekstraheret ved anvendelse cellelysat ekstraktionsbuffer (Beyotime, Kina) indeholdende proteasehæmmer (1 mM phenylmethylsulfonylfluorid). Lysat totale proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af en bicinchoninsyre protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Lige store mængder protein (25 ug) fra hver behandlingsgruppe blev separeret pr gelbane med 8% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, USA). Membranerne blev sekventielt inkuberet med blokeringspuffer bestående af Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 5% fedtfri tørmælk i 2 timer ved stuetemperatur og derefter natten over ved 4 ° C i den samme puffer med en af ​​de følgende primære antistoffer: anti EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Science, UK). anti-E-cadherin, anti-vimentin, anti-snail (alle på 1:1000; cellesignalering Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-phospho-EGFR, anti-AKT, anti-phospho-AKT, anti-ERK, og anti-phospho-ERK (alle 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunmærket membraner blev derefter inkuberet med et HRP-konjugeret sekundært antistof (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., USA) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med TBST blev proteinbånd visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens påvisningssystem (Advansta Corporation, Menlo Park, Californien, USA) ifølge producentens instruktioner. Ekspression af GAPDH blev anvendt som en loading kontrol og proteiner kvantificeres ved anvendelse UTHSCSA Billede Tool 3.0. Målprotein ekspression blev beregnet som bandet intensitetsforhold af målproteinet til GAPDH.

RNA-ekstraktion og PCR analyser

Celler blev lyseret i TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og total RNA blev fremstillet ifølge producentens instruktioner. Første stamme cDNA’er blev syntetiseret ved PrimeScript RT reagens kit med gDNA viskelæder (Takara, Otsu, Japan) og amplificeret ved PCR under anvendelse af følgende specifikke primere: EGFL7 sense, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ‘; antisense, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ‘. CDNA’et af GAPDH blev amplificeret for at kontrollere for mængden af ​​cDNA til stede i hver prøve (sense, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘; antisense, 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’). PCR-amplifikation blev udført ved 94 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 57 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s. PCR-produkter blev separeret på 1,0% agarosegeler og målgenekspression kvantificeres som forholdet af målgenet båndintensitet med den for GAPDH hjælp af Image Tool 3.0 (University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

real-time PCR

Reaktionsblandingen for real-time PCR bestod af 10 pi Premix Ex Taq (probe qPCR), 0,2 uM af hver EGFL7 og GAPDH primer (nedenfor), 0,2 pmol /ml TaqMan prober (EGFL7 eller GAPDH), og 0,4 pi ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamin) reference Dye II (Takara Bio, Shiga, Japan). Blandingen blev kombineret med 2 pi cDNA i hver brønd af en 96-brønds plade MicroAmpTM (Applied Biosystems, CA, USA) og destilleret vand blev anvendt til at justere til et endeligt volumen på 20 pi. De følgende primere blev udformet under anvendelse af Primer Premier 6.0 softwarepakke (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: fremad, 5′-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 ‘; omvendt, 5’-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 ‘; GAPDH: forward, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘; omvendt, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘. Alle reaktioner blev udført på en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle betingelser var indledende denaturering ved 95,8 ° C i 30 s efterfulgt af 40 amplifikationscykler ved 95,8 ° C i 6 s og 60,8 ° C i 30 s.

Lignende forsøgsbetingelser blev anvendt til at vurdere ekspressionen af ​​andre gener med de følgende primere: E-cadherin: forward, 5′-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 ‘; omvendt, 5’-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 ‘; vimentin: forward, 5’-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 ‘; omvendt, 5’-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 ‘; Snail: fremad, 5’-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 ‘; omvendt, 5’-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 ‘; GAPDH: forward, 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘; omvendt, 5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 ‘. Reaktionsblandingen for real-time PCR bestod af 10 pi SYBR Premix Ex TaqTM II, 1.6 pi af hver primer (0,4 uM), 0,4 pi ROX referencenummer Dye, 2 pi template cDNA og 6 pi diethylpyrocarbonat-behandlet vand. Real-time PCR blev udført på en 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) med følgende thermocycle betingelser: indledende denaturering ved 95 ° C i 10 s, efterfulgt af 40 amplifikationscykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 34 s.

celleproliferationsassay

Celleproliferation blev anslået af 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5 diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) levedygtig celleassay. Celler blev udpladet på 96-brønds plader ved 2000 /brønd og dyrket i 12, 24, 48, 72 og 96 timer. Derefter blev 20 pi MTT (Sigma) stamopløsning (5 mg /ml) tilsat til 200 pi af mediet i hver brønd, og pladerne blev inkuberet i yderligere 4 timer ved 37 ° C. Efter omhyggelig aspiration af dyrkningsmediet, blev 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO) tilsat til hver brønd for at opløse formazankrystaller dannet ud fra MTT ved levedygtige celler. Pladerne blev rystet på en roterende platform i 10 minutter og absorbansen måles ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

Plate kolonidannelse Assay Salg

Celler blev podet ved 200 /brønd i det samme seks- brønd plader som anvendes til andre assays til vurdering kolonidannelse under celle-adhærerende betingelser. Efter 10 dage blev cellerne farvet med 1% Giemsa, og antallet af synlige kolonier blev talt. Den relative klon dannelse indeks blev beregnet som gennemsnitlige antal kolonier /antal seedede celler × 100%.

Scratch sårheling assays

For at analysere cellemigration, 5 × 10

5 celler /brønd blev udpladet i seks-brønds plader coatet med 10 ug /ml fibronectin (FN) og inkuberet i 24 timer. Monolaget blev derefter sprængt ved en enkelt bunden ved hjælp af en 200 gl pipettespids. Mikrografer blev opnået ved 0, 12, 24, 36, 48, og 72 timer efter bunden med en fase-kontrast mikroskop (Olympus BX51, Japan). Antallet af celler i ridset (golde) område af mikrobrønd blev talt i fem områder (Forstørrelse: x 200). Alle forsøg blev udført i to eksemplarer.

In vitro

Invasion og Migration Assay

Cell invasion og migration blev evalueret ved hjælp transwell kamre (Corning, New York, USA). Invasion assays blev udført i Transwell kamre adskilt af polycarbonat membranfilter skær (8 um porer) i 24-brønds plader. Hvert kammer blev coatet med 100 pi 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) i koldt RPMI 1640 natten over ved 4 ° C. Efterfølgende celler (5 x 10

4 /ml x 200 pi) blev podet i det øvre kammer i serum-frit medium. Ca. 800 pi medium konditioneret med 10 ug /ml fibronectin blev anbragt i det nedre kammer af Transwell kammer som en kemoattraktant. Efter inkubation i 24 timer ved 37 ° C, blev de resterende tumorceller på den øvre overflade af kammeret fjernet ved aftørring med våd vatpinde. Invaderende celler på den nedre overflade blev fikseret med 4% paraformaldehyd, farvet med krystalviolet og talt under et fasekontrastmikroskop (Olympus, Japan) ved × 200. Fire uafhængige eksperimenter blev udført tredobbelt for alle behandlingsgrupper betingelser.

In vitro

migration analyser blev udført under de samme vilkår som de invasion analyser, men med ikke-coatede nedre kamre og bruger 1 x 10

5 celler /ml (200 pi).

anoikis assay

poly-hydroxyethylmethacrylat (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), som inhiberer celleadhæsion til dyrkningsplader og andre vækst- overflader, blev rekonstitueret i 95% ethanol til en slutkoncentration på 12 mg /ml. Til fremstilling poly-HEMA-coatede plader blev 2 ml af denne opløsning blev tilsat til hver brønd i en plade med 6 brønde og fik lov at tørre natten over under en laminar strømning vævskultur hætte. Derefter blev 5 × 10

4 celler udpladet tredobbelt i hvert poly-HEMA-coatet godt med regelmæssige kulturmedier. Efter 24 timer blev GC celler høstet, skyllet med PBS og resuspenderet i 500 pi bindingsbuffer fra en Annexin V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Resuspenderede celler fra hver prøve blev opdelt i portioner (100 pi) i fire rør. Tre rør blev mærket med enten Annexin V-PE, 7-AAD, eller begge, mens den fjerde blev anvendt som en umærket kontrol. Hver batch blev derefter analyseret ved flowcytometri på en Beckman Coulter FC 500 tæller (Beckman Coulter). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev afledt som summen af ​​celle fraktioner viser tidlig apoptose (annexin V-positive) og sen apoptose (7-AAD-positive).

Xenograft Nude Mouse Model

Xenografting af GC cellelinjer blev udført i overensstemmelse med de nationale retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (publikation nr. 86-23, revideret 1985), blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for tredje Xiangya Hospital, Central South University ( LLSC [LA] 2013-0010), og var i overensstemmelse med gældende kinesisk lov om beskyttelse af dyr (LLSC [LA] 2013-0010). blev gjort alt for at minimere antallet af anvendte mus og deres lidelser.

Femogtredive Balb /c nøgne mus alder 4 til 6 uger blev købt fra SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Shanghai, Kina) og huset i individuelt ventilerede bure. Musene blev tilfældigt opdelt i BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, og styre PBS-grupper (n = 5 mus /gruppe). Dyrkede celler blev høstet og resuspenderet i PBS ved 1 × 10

8 celler /0,2 ml. Suspensionen blev injiceret subkutant i den venstre øvre ekstremitet af hver nøgen mus med undtagelse af dem i kontrolgruppen, som blev injiceret med 0,2 ml PBS. Tumorvækst blev vurderet hver 3. dag ved at måle tumordiametre med Vernier skydelære. Tumorvolumen (TV) blev beregnet ifølge formlen: TV (mm

3) = d

2 × D /2, hvor d og D er den korteste og den længste diameter, hhv. Musene blev aflivet efter 4 uger efter celleimplantation, og tumorerne blev ekstraheret og vejet. Alle levere blev undersøgt for metastase af hematoxylin og eosin (H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

EGFL7 Expression blev Forhøjet i Human Gastric kræftcellelinjer

Western blot og RT. PCR blev udført for at sammenligne EGFL7 udtryk i de humane GC cellelinjer SGC7901, BGC823, MKN45, og MKN28 til, at der i normale gastrisk mucosa epitel GES-1 celler. Forhøjede EGFL7 niveauer blev fundet i alle fire GC cellelinjer forhold til GES-1, med BGC823 og MKN28 vise den højeste og laveste EGFL7 udtryk henholdsvis både på protein og mRNA-niveauer (figur 1A og 1B). Derfor blev BGC823 og MKN28 anvendes i efterfølgende forsøg for at vurdere virkningerne af EGFL7 udtryk på proliferation, migration og metastatisk potentiale. Vi ansat stabil shRNA transfektion til at undertrykke EGFL7 udtryk i BGC823 celler og designet en menneskelig EGFL7 høj ekspressionsplasmid (PEX-2-EGFL7) for at øge EGFL7 udtryk i MKN28 celler.

(A) Expression niveauer af EGFL7 protein i GC cellelinier SGC7901, BGC823, MKN45, og MKN28, og den normale gastriske cellelinje GES-1 blev vurderet ved Western blot. GC cellelinier viste højere EGFL7 protein ekspressionsniveauer end GES-1-celler, med BGC823 celler med de højeste EGFL7 protein ekspressionsniveauer. (B) QRT-PCR viste, at BGC823 havde den højeste EGFL7 mRNA-ekspression. Western blot og PCR-forsøg blev udført tredobbelt, og GAPDH blev anvendt som intern kontrol. (C) QRT-PCR viste, at shRNA1 sekvens resulterede i 75% hæmning af EGFL7 mRNA-ekspression, hvorimod shRNA2 sekvens resulterede i kun 30% inhibering. (D) BGC823 cellelinjer stabilt transficeret med pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 eller pGPU6 /GFP /Neo-uspecifikke-shRNA betegnes BGC2-13 og BGC-NC, hhv. MKN28 cellelinier transficeret med PEX-2-EGFL7 eller PEX-2-uspecifik betegnes MKN28-EGFL7 og MKN28-NC, hhv. Ekspression af EGFL7 protein var markant lavere i BGC2-13 celler i forhold til BGC823 og BGC-NC celler, og markant højere i MKN28-EGFL7 celler i forhold til MKN28 og MKN28-NC celler. (E) EGFL7 ekspressionsniveauer blev ligeledes analyseret ved QRT-PCR, og resultaterne bekræftede Western blot data. GAPDH tjente som intern kontrol for både QRT-PCR og Western blot. Fejl søjler repræsenterer SD for tredobbelte eksperimenter (*

P

0,05).

Vi konstrueret to shRNA plasmidvektorer rettet EGFL7 mRNA og gennemførte QRT-PCR til at vurdere effekten af disse kandidat shRNA sekvenser til at undertrykke EGFL7 sammenlignet med ikke-specifikke sekvenser. De shRNA1 og shRNA2 sekvenser opnået 75% og 30% inhibering af EGFL7 henholdsvis (figur 1C), så den mere effektivt shRNA1 blev anvendt til alle efterfølgende forsøg. De BGC823 linjer stabilt transficeret med pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 eller pGPU6 /GFP /Neo-uspecifikke-shRNA blev betegnet BGC2-13 og BGC-NC, hhv. De MKN28 linjer stabilt transficeret med PEX-2-EGFL7 og PEX-2-uspecifik blev betegnet MKN28-EGFL7 og MKN28-NC, hhv. Ekspressionsniveauerne af EGFL7 protein og mRNA i G418-resistente kloner blev også evalueret ved Western blot (figur 1 D) og real-time RT-PCR (figur 1E). Resultaterne viste markant nedsat EGFL7 udtryk i BGC2-13 celler sammenlignet med BGC-NC-celler og signifikant forhøjet udtryk i MKN28-EGFL7 celler i forhold til MKN28-NC-celler (alle

P

0,05). Der var ingen signifikante forskelle i mRNA og protein-ekspression mellem BGC-NC og BGC celler eller mellem MKN28-NC og MKN28 celler (alle

P

0,05).

EGFL7 Fremmes GC Cell Invasion og migration, men påvirkede ikke GC Cell Proliferation

for at undersøge den rolle, EGFL7 i GC progression, vi først undersøgt, om EGFL7 lyddæmpning eller overekspression ændret proliferative, invasive, og vandrende kapacitet GC celler. Scratch sårheling blev anvendt til måling migration af stabilt transficerede celler. Et sår blev genereret på GC cellemonolag med en enkelt bunden og antallet af celler i bunden zone sammenlignet ved 0 og 48 timer. Lukning af såret var betydeligt langsommere i BGC2-13 kulturer (underexpressing EGFL7) i forhold til indfødte BGC823 og BGC-NC kulturer (32%

vs.

100% og 98%, begge

P

0,05) (figur 2A). I modsætning hertil lukningen var signifikant hurtigere i MKN28-EGFL7 kulturer (overekspression EGFL7) i forhold til MKN28 og MKN28-NC kulturer (99%

vs.

49% og 50%, begge

P

& lt 0,05) (Figur 2B). Wu et al.