PLoS ONE: Fotodynamisk terapi med 5-aminolevulinsyre (ALA) Forringer tumorfremkaldende og Chemo-Resistance Ejendom i hoved- og halscancer-afledte cancerstamceller

Abstrakt

Baggrund

Hoved- og halskræft (HNC) rangerer den fjerde førende malignitet og kræft død i mandlige befolkning i Taiwan. Trods nylige terapeutiske fremskridt, prognosen for HNC patienter er stadig dystre. Nye strategier er et presserende behov for at forbedre chemosensitization til konventionelle kemoterapeutiske lægemidler og kliniske respons af HNC patienter. Undersøgelser har vist, at topisk 5-aminolevulinsyre-medieret fotodynamisk terapi (ALA-PDT) bruges i behandlingen af ​​forskellige humane præmaligne og maligne læsioner med nogle opmuntrende kliniske resultater. Men de molekylære mekanismer i ALA-PDT i den terapeutiske virkning i HNC tumorigenese og om ALA-PDT som chemosensitizer til HNC behandling er fortsat uklare. Akkumulerende data support cancer stamceller (CSCS) bidrager kemo-resistens i HNC. Baseret på de tidligere undersøgelser, at formålet med undersøgelsen er at undersøge effekten af ​​ALA-PDT på CSCS og chemosensitization ejendom i HNC.

Metode /Principal Finde

CSCS markør ALDH1 aktivitet af HNC celler med ALA-PDT behandling som vurderet af Aldefluor assay flowcytometri analyse. Sekundær Sphere-dannende selvfornyelse, stemness markører udtryk, og invasivitet af HNC-CSCS med ALA-PDT-behandling blev præsenteret. Vi observerede, at behandlingen af ​​ALA-PDT betydeligt nedreguleret den ALDH1 aktivitet og CD44 positivitet af HNC-CSCS. Desuden ALA-PDT reducerede selvfornyelse ejendom og stemness signaturer udtryk (Oct4 og Nanog) i kugle-dannende HNC-CSCS. ALA-PDT sensibiliseret yderst tumorigene HNC-CSCS til konventionelle kemoterapi. Endelig synergistisk effekt af ALA-PDT og cisplatin behandling svækket invasiv /colongenicity ejendom i HNC-CSCS.

Konklusion /Betydning

Vores resultater giver indsigt i den kliniske udsigten til ALA-PDT som en potentiel kemo-adjuverende behandling mod hoved- og halscancer ved at fjerne CSCS ejendom

Henvisning:. Yu CH, Yu CC (2014) Fotodynamisk terapi med 5-aminolevulinsyre (ALA) Forringer tumorfremkaldende og Chemo-Resistance ejendom i hoved og halscancer-afledt cancerstamceller. PLoS ONE 9 (1): e87129. doi: 10,1371 /journal.pone.0087129

Redaktør: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, USA

Modtaget: December 6, 2013; Accepteret: December 22, 2013; Udgivet: januar 24, 2014

Copyright: © 2014 Yu, Yu. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse understøttes af forskningsbevilling fra National Science Rådet (100-2632-B-040-001-MY3, 101-2314-B-040-016, 102-2628-B-040 -001 -MY3) .De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hoved- og halskræft (HNC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer i verden og en af ​​årsagerne til cancer-relaterede dødsfald på grund af hyppige tilbagefald efter kemoterapi modstand [1]. Trods forbedringer i diagnose og behandling af HNC har langsigtede overlevelsesrater forbedret kun marginalt i det seneste årti [1]. Nye lægemidler eller strategier er et presserende behov for at forbedre chemosensitization til konventionelle kemoterapeutiske lægemidler og kliniske respons af HNC patienter [2].

Nylige undersøgelser har påpeget modstand mod konventionelle radiotherapies /kemoterapi behandling er en større kliniske kriterier til karakterisering cancer stamceller (CSCS) med selv-fornyelse og yderst tumorigenenic kapacitet i maligne tumorer, herunder HNC [2] – [4] Både intracellulær ALDH1 + og CD44 + celler er blevet foreslået at udvise CSCS egenskaber og har været anvendt som CSCS funktionelle markører for hoved og neck cancer-afledte cancerstamceller (HNC-CSCS) [5] – [7]. Ikke desto mindre søger en effektiv tilgang rettet mod HNC-CSCS at forbedre HNC -relaterede maligniteter er et presserende behov [7].

Fotodynamisk terapi (PDT) involverer to individuelt ugiftige komponenter, lys og fotosensibilisator [8]. PDT er en ny behandling og har et betydeligt lovende for mange faste tumorer [9]. Undersøgelser har vist, at topisk 5-aminolevulinsyre-medieret PDT (ALA-PDT) bliver brugt i behandlingen af ​​forskellige humane præmaligne og maligne læsioner med nogle opmuntrende kliniske resultater [10] – [13]. PDT kan have potentialet til at inhibere metastase af ufuldstændigt behandlet HNC [14]. I en mus Lewis lungecarcinom-model, ALA-PDT reducerede metastase af cancerceller in vivo [15]. Desuden ALA-PDT øger apoptotiske evne af orale cancerceller gennem NF-KB /JNK signalering [16]. ALA-PDT også ophævet migration kapacitet af orale cancerceller ved nedregulering af FAK og ERK [17].

Baseret på de tidligere undersøgelser, er formålet med undersøgelsen er at undersøge effekten af ​​ALA-PDT på chemosensitization og CSCS ejendom i HNC. Samlet set vi først demonstrerede ALA-PDT effektivt reducerer CSC-lignende ejendom, herunder ALDH1 aktivitet, CD44 positivitet, selvfornyelse, invasion, og forbedret kemosensitivitet i HNC. ALA-PDT ville være en potentiel kemo-adjuverende behandling og kan være gavnligt for anti-CSCS behandling i HNC.

Materialer og metoder

Primære dyrkede celler fra HNC væv

Kirurgiske vævsprøver fra HNC patienter blev opsamlet efter at have indhentet skriftligt informeret samtykke, og denne undersøgelse blev godkendt af The Institutional Review Board i Chung Shan Medical University Hospital (CSMUH No: CS10249). Primære HNC celler blev etableret som beskrevet tidligere [6], [18]. Kort fortalt, efter kirurgisk fjernelse af HNC væv blev vævene vasket 3 gange i glucose indeholdende HBSS, derefter blev prøverne skåret i en tykkelse på 300 um og de skivede væv blev nedsænket i 0,1% (vægt /vægt) collagenase indeholdende glucose indeholdende HBSS i 15 minutter ved 37 ° C og underkastet rotation shaker rystning ved 125 rpm. HNC primær kultur blev dyrket i DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) med 10% føtalt bovint serum, suppleret med 1 mM natriumpyruvat, ikke-essentielle aminosyrer, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 95% befugtet luft, 5% CO

2).

Kemikalier Salg

5-ALA blev opnået fra Sigma (St . Louis, MO, USA). Lige før brug, blev 5-ALA yderligere fortyndet i dyrkningsmedium til passende endelige koncentrationer.

HNC cellelinjer dyrkning og 5-ALA-baserede fotodynamisk terapi

Til ALA-PDT undersøgelser, cellerne blev inkuberet med 5-ALA i 3 timer, og derefter bestrålet med rødt lys på 635 ± 5 nm ved forskellige doser.

Berigelse af kugle-dannende HNC cancer stamceller (HNC-CSCS)

Spheres fra HNC celler blev isoleret i medium bestående af serumfrit DMEM /F12-medium (GIBCO), N2 supplement (GIBCO), 10 ng /ml humant rekombinant basisk fibroblast vækstfaktor (basisk FGF) og 10 ng /ml epidermisvækstfaktor faktor (EGF) (R kanin anti-GAPDH (MDBio, Inc., Taipei, Taiwan); og muse-anti-β-actin (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Immunreaktive proteinbånd blev påvist ved ECL detektionssystem (Amersham Biosciences Co, Piscataway, NJ, USA).

In vitro

celleinvasion Assay

I Transwell migration assays , 2 × 10

5-celler blev udpladet i det øverste kammer i et Transwell (Corning, Acton, MA, USA) med en porøs membran (8,0 um porestørrelse). Celler blev udpladet i medium med lavere serum (0,5% FBS), og medium suppleret med højere serum (10% FBS) blev anvendt som en kemoattraktant i det nedre kammer. Cellerne blev inkuberet i 24 h ved 37 ° C og celler, som ikke migrerer gennem porerne blev fjernet ved en vatpind. Celler på den nedre overflade af membranen blev farvet med Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) for at vise kernerne; fluorescens blev detekteret ved en forstørrelse på 100x under anvendelse af et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Antallet af fluorescerende celler i en total på fem tilfældigt valgte felter blev talt. In vitro celleinvasion analyse blev som tidligere beskrevet [19].

blød agar kolonidannende assay

Hver brønd (35 mm) af en seks-brønds dyrkningsplade blev coatet med 2 ml bottom agar (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,6% (w /v) agar). Efter det nederste lag blev størknet, 2 ml topagar-medium blanding (DMEM, 10% (v /v) FCS, 0,3% (w /v) agar) indeholdende 2 × 10

4-celler blev tilsat, og skålene blev inkuberet ved 37 ° C i 4 uger. Plader blev farvet med 0,005% krystalviolet derefter kolonierne blev talt. Det samlede antal kolonier med en diameter ≥100 um blev talt over fem felter pr godt for i alt 15 felter i tredobbeltforsøg [3].

Statistisk analyse

Statistisk Package of Social Sciences software (version 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistisk analyse. Studerendes

t

test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans af forskellene mellem eksperimentelle grupper;

s

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til 0,05 for alle tests.

Resultater

Hæmning af ALDH1 aktivitet i HNC celler under ALA-PDT behandling

ALDH1, et cytosol isoenzym, som er ansvarlig for oxidationen af ​​retinol på retinsyre under tidlig stamcelledifferentiering er begge blevet vist at være CSC markører i hoved- og halscancer [20], [21]. Først brugte vi in ​​vitro cellebaserede ALDH aktivitet assay system, som er blevet påvist som en HNC-CSCS markør, at undersøge virkningerne af ALA-PDT på ALDH1 aktivitet i HNC cellelinjer og primære dyrkede HNC celler ved flowcytometri beskrevet i materialer og metoder. Vores data foreslog ALA-PDT-behandling signifikant nedsætter ALDH1 aktivitet HNC celler (Fig. 1).

(A) HNC cellelinjer (SAS og Ca9-22) og primære HNC celler (HNC-1 og HNC- 2) blev podet som 1 × 10

6 celler /brønd i 6-brønds-plade og derefter forbehandlet 1 mM ALA i 3 timer efterfulgt af PDT med rødt lys ved en dosis på 4 J /cm2 eller ALA eneste behandling kontrolgruppe . ALDH + -celler blev bestemt ved Alderfluor assay og levedygtige celler (7-AAD negative) blev anvendt til analyse. DEAB-behandlede celler blev anvendt som negativ kontrol. (B) kvantificering Resultaterne er vist i søjlediagrammet. Forsøgene blev gentaget tre gange, og repræsentative resultater blev vist. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± SD *, p. 0,05

ALA-PDT eliminerer effektivt selvfornyelse kapacitet, CD44 positivitet, og stemness underskrifter i HNC-CSCS

Tidligere, undersøgte vi vellykkede sfære dannelse i serielle passager af kultur, en af ​​indekser til vurdering af den vedvarende selvfornyelse ejendom for kræft stamceller, og viste, at selv-fornyelse kapacitet på alle HNC-CSCS [22]. For at undersøge effekten af ​​ALA-PDT med at opretholde selvfornyelse HNC-CSCS, vi evaluerede den sekundære sfære-dannende evne med ALA-PDT-behandling i HNC celler. Behandling af HNC celler med ALA-PDT forstyrret kugler kropsstørrelse og antal af HNC-CSCS (fig. 2A). Flowcytometrianalyse af CD44-ekspression viste, at ALA-PDT-behandling reducerede procentdelen af ​​både CD44 + celler i HNC-CSCS (fig. 2B). For yderligere at fastslå, om reduktionen i tumor sfære dannelse effektivitet med ALA-PDT-behandling var på grund af nedsat stemness markører ekspression, stemness gener (Oct-4 og Nanog) af kugle-dannende HNC-CSCS med kontrol og ALA-PDT-behandling blev bestemt ved Western blot-analyse. Resultaterne bekræftede, at ALA-PDT-behandlede HNC-CSCS markant reduceret udtrykket udskrift (Fig. 2C) og protein niveau (fig. 2D) af stemness gener.

(A) For selvfornyelse analyse, single cellesuspension blev opnået fra primære HNC-CSCS sfærer efter Accutase fordøjelse og sekundær sfære dannelse kapacitet blev bestemt med primær sfære dyrkningsproceduren undtagen klædningen celledensitet som 10000 celler /ml. (B) Ekspression af CD44 positivitet af kontrol og ALA-PDT-behandlede HNC-CSCS blev bestemt ved flowcytometri analyse. Data, der vises her, er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 vs. Control. SAS eller Ca9-22-afledt HNC-CSCS behandlet med kontrol eller ALA-PDT og analyseret udskrifter og proteinniveau af OLT-4 og Nanog af real-time RT-PCR (C) og immunblotting analyse (D), hhv. *, P. 0,05 vs. Kontrol

ALA-PDT behandling levering øger effekten af ​​kemoterapi i HNC-CSCS

CSCS er relativt resistent over for kemoterapi [6]. Resultaterne, som ALA-PDT-behandling regulerede CSCS ejendomme foreslog en rolle for ALA-PDT som en potentiel kemo-adjuverende behandling. Celle levedygtighed assays viste, at den cytotoksiske virkning på HNC-CSCS til cisplatin og fluorouracil (5-FU) var signifikant forøget med ALA-PDT kombinationsbehandling den (fig. 3A). Flowcytometrianalyse af multiresistens (MDR) gener viste, at den faldt kemoresistens af ALA-PDT-behandling kunne tilskrives den reducerede ekspression af ABCG2 (fig. 3B). Disse data antyder, at ALA-PDT-behandling lindret den lægemiddelresistens af HNC-CSCS til cisplatin og fluorouracil (5-FU) behandling gennem ABCG2 nedregulering.

(A) HNC-CSCS med ALA-PDT eller kontrol behandling blev udsat for behandling med forskellige koncentrationer af cisplatin eller 5-FU. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. (B) Flowcytometrianalyse af udtrykket niveau af resistente markør ABCG2 udtryk i HNC-CSCS som angivet.

Samtidig indgivelse af ALA-PDT-behandling og cisplatin ophævet invasiv og clonogenicity af HNC -CSCs

Da CSCS synes at spille en væsentlig rolle i at fremme tumorfremkaldende aktivitet [3], søgte vi at måle synergistiske virkninger af ALA-PDT kombineret med cisplatin behandling på invasion /clonogenicity af HNC-CSCS. Enkelt cellesuspension af ALA-PDT-behandlede HNC-CSCS blev behandlet med eller uden cisplatin behandling blev anvendt til analyse af deres invasion /clonogenicity

in vitro

som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Behandling med cisplatin alene påvirkede ikke invasionen evne i HNC-CSCS (fig. 4A), kombinationen af ​​ALA-PDT og cisplatin behandling forbedret effektiviteten af ​​disse behandlinger (fig. 4A). I mellemtiden var tilsvarende synergistiske virkning af ALA-PDT-behandling og kemo-behandling også observeret i kolonidannelse assayet (fig. 4B). Kombinationen behandling viste en synergistisk effekt i ophævelse clonogenicity i HNC-CSCS. Disse data indikerer, at effektiviteten af ​​cisplatin kemoterapi behandling på HNC-CSCS kan forbedres med ALA-PDT behandling.

(A) Invasion evne og (B) kolonidannende evne i HNC-CSCS blev undersøgt efter behandling med enten ALA-PDT eller cisplatin kemoterapi eller begge. *, P 0,05 ALA-PDT vs. kontrol; #, P 0,05 ALA-PDT + cisplatin vs. ALA-PDT alene

Diskussion

CSCS anses for at være ansvarlig for initiering, spredning og metastaser af tumorer [23. ]. Vigtigt er det, kan eksistensen af ​​CSCS forklare kræft tilbagefald, selv efter den kliniske behandling med enten strålebehandling eller kemoterapi på kræftpatienter [24]. Derfor søger den ny behandling strategi rettet mod CSCS forhåbentlig give os nye behandlingsmetoder. I nærværende rapport, for det første viste vi ALA-PDT forudsat en terapeutisk effekt i HNC-CSCS ved at hæmme de CSCS-lignende egenskaber af hoved-halscancer, som stemness signatur, migration evne, og kemoresistens. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at demonstrere den kritiske rolle en ALA-PDT-baseret behandling i at målrette HNC-afledte CSC-lignende celler og i at blokere HNC-CSCS-medieret tumor igangsætte aktivitet.

Epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) er en proces kritisk for passende fosterudvikling, og det er også genansat hos voksne under tumorigenese [25]. EMT er bredt accepteret som en af ​​de CSCS egenskaber, [26] og Oct4 /Nanog signalering har vist sig at være involveret i reguleringen af ​​EMT og metastase [27]. Oral cancer epitelceller kan erhverve mesenchymale træk, som letter migration og invasion gennem EMT proces. [28] Det er kendt, at EMT kan give anledning til celler med stamcelle og cancer initierende stamceller egenskaber, der har undergået EMT er derfor mere motile og metastaseret . [26]. Da vi har fundet, at effekten af ​​ALA-PDT om invasion evne i HNC-CSCS, udforske, om ALA-PDT-medieret CSCS og invasion kapaciteter afhængigt EMT vej vil blive undersøgt i fremtiden.

Kemoterapi er den nuværende platform til behandling HNC patienter med metastaser [29]; imidlertid den kemoterapeutiske virkning er begrænset, og dens bivirkninger vid udstrækning interferere med livskvalitet patienter. CSCS er klinisk karakteriseret ved resistens over for kemoterapi [29]. Tilstedeværelsen af ​​CSCS resulterer i den lave effekt af anti-cancer behandlinger og den fejlslagne udryddelse tumor og i sidste ende fører til tumor tilbagefald og metastaser [30]. Den HNC-CSCS var meget modstandsdygtig over for kemoterapi [18], og den kemoresistens af disse celler blev inhiberet væsentligt, når de blev behandlet med ALA-PDT. Det er bemærkelsesværdigt, at ALA-PDT-behandling resulterede i reducerede MDR proteinniveauer i HNC-afledte CSCS efter chemotreatment. De detaljerede mekanismer i regulatoriske netværk mellem ALA-PDT behandling på resistente gener kræver yderligere undersøgelser.

Som konklusion den foreliggende undersøgelse viste de inhiberende virkninger af ALA-PDT om stamceller-lignende egenskaber og kemoresistens i HNC . Især her er stort behov for at optrævle de underliggende mekanismer i ALA-PDT-medieret vej i HNC-CSCS og yderligere evaluere de terapeutiske muligheder for ALA-PDT behandling klinisk.